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方法論記事

マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

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DOI：

10.3791/63344

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2022年1月21日

 ,  ,  , 
1Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般に頭蓋骨を介したアクセスを含み、頭蓋骨のランドマークによって導かれる。ここでは、脳幹のランドマークの直接可視化に依存する大槽 マグナを介して 尾側脳幹と上部頸部脊髄を標的とする代替定位アプローチを概説する。

要約

マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般的に頭蓋骨のランドマークによって導かれる。その後、頭蓋骨に穴を開けたバリ穴 を介して アクセスが得られます。この標準的なアプローチは、尾側脳幹および上部頸椎帯の標的にとって、これらの部位が頭蓋骨のランドマークから遠く離れているため、特定の解剖学的課題のために困難であり、不正確さにつながる可能性がある。ここでは、尾側脳幹および上部頸椎の関心のある離散領域を標的とするために使用される、大槽を介した代替定位アプローチ を 概説する。大槽マグナは後頭骨からアトラス(すなわち、第2の椎骨)まで延びており、脳脊髄液で満たされ、硬膜で覆われている。このアプローチは、解剖学的障壁のために到達しにくい選択された中枢神経系(CNS)構造への再現可能なアクセス経路を提供する。さらに、標的部位に近接した脳幹ランドマークを直接可視化することができ、尾側脳幹および上部頸部の限られた関心領域に少量の注射を送達する場合の精度が向上する。最後に、このアプローチは、運動および感覚運動研究にとって重要な小脳を回避する機会を提供する。

概要

マウス1の脳部位を標的とする標準的な定位手術は、一般に、一組のイヤーバーおよびマウスバーを用いた頭蓋骨の固定を含む。座標は、次に、参照アトラス2,3、および頭蓋骨のランドマーク、すなわちブレグマ(前頭骨と頭頂骨の縫合糸が一緒になる点)またはラムダ(頭頂骨と後頭骨の縫合糸が一緒になる点;図1A、B)。推定された標的の上の頭蓋骨へのバリ穴を通して、マイクロインジェクションの送達またはカニューレまたは光ファイバーによる器具付けのいずれかのために、標的領域に到達することができる。これらの縫合糸の解剖学的構造の変化およびブレグマまたはラムダ4,5の局在化における誤りのために、脳に対するゼロ点の位置は動物によって異なる。この変動から生じるターゲティングの小さな誤差は、大規模または近くのターゲットにとっては問題ではないが、前後または背側房面のゼロ点から離れた小さな関心領域、および/または年齢、緊張および/または性別によってサイズが変化する動物を研究する場合、その影響は大きい。延髄と上部頸髄に特有のいくつかの追加の課題があります。第1に、前後座標の小さな変化は、小脳の位置および形状に起因する硬膜に対する背腹座標の有意な変化と関連している(図1Bi)2,6,7。第2に、上部頸帯は頭蓋骨2内には含まれない。第三に、後頭骨の傾斜位置と頸部筋肉2の層が傾いているため、脳幹と脊髄の移行部付近に位置する構造では、標準的な定位アプローチがさらに困難になります(図1Bi)。最後に、尾側脳幹および頸部コードにおいて関心のある多くの標的は小さく2であり、正確で再現性のある注射を必要とする8,9。

貯水槽マグナを通る代替アプローチは、これらの問題を回避します。水槽マグナは、後頭骨からアトラス(図1A、すなわち、第2の椎骨)10まで延びる大きな空間である。それは脳脊髄液で満たされ、硬膜10によって覆われている。後頭骨とアトラスの間のこの空間は、頭部を前屈させるときに開く。これは、縦頭蓋筋の上にある対になった腹の間を移動し、尾側脳幹の背側表面を露出させることによってアクセスすることができる。関心のある領域は、背側表面の近くにある場合、これらの領域自体のランドマークに基づいてターゲットにすることができます。または、中心運河がIV心室に開く点であるobexを、座標がより深い構造に到達するためのゼロ点として使用することによって。このアプローチは、腹側呼吸器群、髄内側網状形成、孤独路の核、領域後脳、または舌下核を標的とするラット11、ネコ12、マウス8、9、および非ヒト霊長類13を含む様々な種において首尾よく使用されている。しかし、このアプローチは、解剖学の知識、特殊なツールキット、および標準的な定位アプローチと比較してより高度な手術スキルを必要とするため、広く利用されていません。

ここでは、大槽 マグナを介して 脳幹と上部頸髄に到達し、ランドマークを視覚化し、ゼロ点を設定し(図2)、関心のある個別の脳幹および脊髄領域へのマイクロインジェクションの定位送達のためのターゲット座標を推定および最適化するための段階的な外科的アプローチについて説明します(図3)。次に、このアプローチに関連する長所と短所について説明します。

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プロトコル

著者は、プロトコルがベスイスラエルディーコネス医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていると宣言しています。

1. 手術器具・定位フレームの作製

注:手術は無菌条件下で行われます。無菌性は、無菌チップ技術を用いて維持される。

  1. 選択した注射剤(アデノ随伴ウイルス(AAV)または従来のトレーサー)を充填したマイクロピペットまたはシリンジで定位アームを定位フレームに取り付け、マウスアダプタを準備します(図2A)。
  2. オートクレーブ処理された手術器具(材料表)を準備し、滅菌面に置きます。

麻酔誘導とマウス調製

  1. O2を 0.5 L/minでオンにし、イソフルラン気化器を4.0に設定し、O2 の流れが誘導ボックスにあることを確認します。
    警告: イソフルラン誘導ボックスがフード内に置かれ、イソフルランが手術部位から取り除かれていることを確認してください。
  2. マウス(10週齢の雄性C57BL/6J)を誘導チャンバーに入れる。
  3. 呼吸が遅くなったら、誘導チャンバーを開き、マウスを少し持ち上げます。バリカンを使って頭から肩まで脱毛します。

3. 定位フレーム内でのマウスの位置決め

  1. マウスを定位フレームに移動し、柔軟なノーズコーンにノーズを置きます。この段階で、O2 の流れがノーズコーンに向けられていることを確認してください。
  2. マウスを定位フレーム内に配置して、イヤーバーのみを使用します。
    メモ:イヤーバーが均一で、頭が水平であることを確認してください。
  3. マウスの頭を 90° の角度に前屈させて、機首を手動で誘導します。この位置を固定するには、マウスアダプターのイヤーバーの柱の間に、柱と平行にプラスチック製のバリアを配置します。頭蓋骨の平らな部分は、従来の定位手術における平らな頭蓋骨のアプローチと同様に、基準として機能する。
    メモ:頭部を曲げすぎないでください(つまり、前頭蓋骨の平面とテーブルの表面の平面との間の角度が90°を超える場合)、上気道を流れる気流を妨げます。気流が妨げられる場合は、マウスの位置を変えて、体が体幹の下に支えられ、プラスチックカードが前頭蓋骨の平面と表の表面の表面の平面の間で90°に設定されていることを確認します( 図2A,C)。
  4. 加熱パッドをマウスの下に置き、首と体の他の部分が同じレベル(つまり、テーブルとほぼ180°または平行)に配置されていることを確認します。スプリングハサミを保持するツールボックスを使用して、ボディをこの位置に持ち上げることができます。
    注:このステップは、頭蓋骨によって所定の位置に保持されているCNSのより多くの吻側部分とは対照的に、尾側脳幹および上部頸部が位置に応じて移動するので重要である。
  5. 4mg/kgメロキシカム徐放性(SR)の単回投与を皮下(s.c.)に2μL/g体重の容量で注射し、眼に潤滑剤を塗布する。
  6. 手術用切開部位を最初に70%アルコール調製パッドで洗浄し、次にベタジン調製パッドで、次にアルコール調製パッドで再度洗浄し、乾燥させる。
  7. 体の下にドレープを置きます。
  8. 手を消毒し、滅菌手袋を着用してください。
  9. 手術部位にドレープを置きます。

4.水槽マグナにアクセスするための手術

  1. マウスのつま先をつまむか、角膜反射をチェックして、マウスが適切に麻酔をかけられていることを確認してください。
  2. イソフルランを維持レベル(2.0)まで低減する。
  3. 1回の滑らかな動きで後頭骨の端から肩に向かって手術用ブレード#10で1〜1.2cmの切開を行います。
  4. トラペジウス筋の正中線ラペに切開を行う。これは、対になったロンガス頭蓋炎筋を露出させる。
    注:マウスでは、トラペジウス筋は非常に細く、ほぼ透明な筋肉です。正中線にとどまり、不必要な出血を引き起こすため、下にある筋肉に切り込まないようにしてください。
  5. 両方のリトラクターフックを、対になった縦鞘状頭蓋炎筋の間に、一方を左向きに、もう一方を右向きに配置します。止血剤の重量は、止血剤の位置を再調整することによって変更することができるリトラクターフックに張力を提供する。
  6. 手術用顕微鏡を所定の位置に置き、手術野をよりよく視覚化します。
  7. 鈍い椎間板切除鉗子を使用して、正中線が容易に見える後頭部から始めて、対になった縦鎌状頭蓋炎筋の左右の腹を分離する。鈍い鉗子を正中線の後頭部の骨を横切って槽硬膜に接するところまで導き、硬膜を横切ってアトラスまで進みます。
    注:ペアの縦頭蓋炎筋は、正中線でそれらを一緒に保持するものが何もないので、切断する必要はありません。そうすると不必要な出血を引き起こします。
  8. リトラクターを再配置し、止血剤を再配置して張力を調整し、貯水槽マグナのビューを開きます。
  9. 鈍い椎間板切除鉗子を使用して、正中線で筋肉をさらに分離し、脳幹と小脳の良好な視界を得る。
  10. 必要に応じて、小脳と脳幹が硬膜の下に見えるまで、手順4.7-4.9を繰り返します。
  11. 鈍い椎間板切除鉗子を使用して、脳幹の明確な視界があるまで、正中線から横方向に鉗子を動かすことによって結合組織の小さな鎖の硬膜をクリアし、ターゲットの必要に応じて、より多くの側方空間を作り出す。

5.槽膜の開口部

  1. 角度の付いたデュモン鉗子(#4/45)を使用して、後頭骨からアトラスまで伸びる硬膜をつかみます。後頭骨の近くの硬膜をつかみ、スプリングハサミを使用して硬膜に小さな開口部(〜0.5〜1.5mm)を作ります。
    注:この吻側位置では、脳幹と上層の硬膜との間の空間が最も広く、硬膜を安全に操作するための十分なスペースを提供します。
  2. スプリングハサミを使用して硬膜を持ち上げ、硬膜をさらに開きます。ウィンドウのサイズはターゲットによって異なります。
    注:複数の縦方向注射または両側注射を行う場合は、より大きなウィンドウが必要になります。単一の一方的または正中線の注射を行う場合は、小さなウィンドウで十分です。
  3. 硬膜が開いたら、滅菌キューチップで余分な脳脊髄液を排出します。

6. ランドマークとゼロポイントの識別

  1. 開いた硬膜を通して詳細なランドマークで脳幹の背側表面を見てください。中心管がIV心室に開く点であるobexは、標準的な前後および中側ゼロ点である。

7. ターゲット座標

注:さまざまなターゲットについて、方法論間の移行を容易にするために、ゼロ点ブレグマを基準とした前後(AP)座標と中側座標(ML)座標、およびゼロ点オブレックスを基準としたAP座標とML座標を持つ水槽マグナ座標のリストを含めました(表1)。背腹側(DV)座標は、APおよびMLの進入点における脳または小脳の表面(標準アプローチ)または脳幹または上部頸髄の表面(大槽マグナアプローチ)を基準とする。計画は手術前に行う必要があります。

  1. ターゲットを決定するには、3 つの座標セット (AP、ML、DV) を使用します。頭の位置のために、脳幹構造の相対的な向きは場所によって異なる。
    1. 尾から茎までの目標距離>0.4mm(図1B、緑色)の場合、次の手順を実行します。
      1. AP: 標準的な定位参照アトラス(例:Paxinos および Franklin アトラス2)または横平面で切断された組織系列を使用して、obex とターゲットの間の AP 距離を推定します。
      2. ML: 横平面で切断された標準の定位参照アトラスまたは組織系列を使用して、obex とターゲット間の ML 距離を推定します。
      3. DV: AP および ML ターゲット ポイントの脳または小脳の表面を基準とした座標を推定します。横平面で切断された標準的な定位参照アトラスまたは組織系列を使用して、所望のAPおよびML座標における脳幹表面と標的との間の距離を推定する。
    2. 尾から茎までの目標距離<0.4mm(図1B、オレンジ色)の場合、次の手順を実行します。
      1. AP:脳幹の前方屈曲を考慮して座標を調整します。腹側座標および吻側座標の場合、AP 脳幹エントリ ポイントは、標準平面内のターゲット AP 座標に対してより尾側になります。
      2. ML: ターゲット座標は、標準の定位参照アトラスまたは横平面で切断された組織系列から取得します。座標は、ターゲット AP レベルで視覚化された正中線を基準にしています。
      3. DV: AP および ML ターゲット ポイントの脳幹の表面を基準とした座標を推定します。脳幹の前方屈曲を考慮してDVを調整する。腹側座標および吻側座標の場合、DV座標は、標準平面における脳幹の背側表面からの距離よりも大きくなる。

8. ターゲットの注入

  1. 定位アームを使用してピペットまたはシリンジをターゲットに下げ、標準的な定位アプローチと同様に溶液を注入します。3-50 nLの容量を使用する場合、針のトラックを避けるために、注射後1〜5分間所定の位置に放置してください。次に、定位アームを使用してピペットまたはシリンジを持ち上げます。
  2. 手順 8.1 を繰り返します。複数のターゲットの場合。

9. 手術野の閉鎖

  1. 手術野からフックを慎重に取り外します。対になった縦鎌状頭蓋炎の筋肉は中立的な位置に戻り、水槽マグナを完全に覆います。台形筋と硬膜は縫合糸を保持するには壊れやすいため、正中線で閉じないでください。
  2. 3つのナイロンまたはポリプロピレン縫合糸(5-0または6-0)で皮膚を閉じます。

10. 術後ケア

  1. イソフルランをオフにし、マウスを定位フレームから取り外します。マウスを加熱パッドの上の清潔なケージに入れ、目を覚まして動くまで観察する。
  2. 術後1〜3日目の健康状態、体重、縫合糸を監視します。まだ除去されていない場合は、10日目に縫合糸を除去してください。

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結果

水槽マグナアプローチは、標準的な定位アプローチでは到達しにくい、または一貫性のない標的化を起こしやすい尾側脳幹および上部頸索構造を標的にすることを可能にする。大槽に到達するための手術は、皮膚の切開、トラペジウス筋の薄い層、および硬膜の開口部を必要とし、したがってマウスによって十分に許容される。これは、標準的な定位アプローチのように複数のバリ穴をあける必要がないため、複数の(縦方向に分散したまたは両側の)サイトをターゲットにする場合、特に効率的で侵襲性が低いです。マウスでは、図3で舌下核と腹内側髄質(GiV)についてさらに例示するように、胸槽マグナアプローチを用いて尾側脳幹の舌下核9、腹側呼吸器群8、および隣接する網状形成8などの構造を日常的に標的化しています。例えば、舌下核は、背側髄質長方体における運動ニューロンのスリムだが吻側尾側に細長い柱であり、その吻側極は標準的なアプローチを介して標的とすること...

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ディスカッション

標準的な定位手術は、CNS1の標的部位の座標を計算するために、一般的に頭蓋骨のランドマークに依存している。その後、標的部位は、頭蓋骨1にドリルで開けられたバリ穴を介してアクセスされる。この方法は、標的部位が前後面および背側腹面2の頭蓋骨ランドマークから遠くに位置し、頭蓋骨の解剖学的構造および上層筋肉がアクセスを困難にするため、尾側脳幹には理想的ではない6(図1Bi)。我々の研究は、尾側脳幹および上部脊髄の標的部位にアクセスするための代替定位アプローチを、槽マグナアプローチと呼ぶと述べている。この方法を標準的な定位アプローチと異なる主な特徴は、頭部の前屈が大槽を開く位置決めと、脳幹の背側表面における主要な脳幹ランドマークをobexなどの基準点として使用することである。我々の結果は、このアプローチが、少量(5-50nL)のトレーサーまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)を離散的な...

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この作業は、R01 NS079623、P01 HL149630、および P01 HL095491 によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルコールパッドMed-Vet InternationalSKU:手術部位感染の予防のためのMDS090735Z皮膚の準備
角度付き鉗子、デュモン#5/45FST11251-35は、硬膜
BetadineパッドMed-Vet InternationalSKU:PVP-PAD手術部位感染の予防のための皮膚の準備
コレラ毒素サブユニット-b、アレクサフルオット488/594抱合体サーモフィッシャーサイエンティフィック488:C34775、594:C22842蛍光トレーサー
クリッパーウォールモデルMC3、28915-10手術部位で毛皮を剃るためのウォールモデルMC3、28915-10
コーナークランプ付き電極ホルダーピペットを保持するKopf1770
流量計ルモント機器モデル#65 MMは、手術面
上のマウスへのイソフルランと酸素の流れを調節します蛍光マイクロスフェア、ポリスチレンサーモフィッシャーサイエンティフィックF13080蛍光トレーサー
加熱パッドストールティング53800M温度調節
ポートフックアップキット付き誘導チャンバーミッドマーク社初期麻酔を提供する93805107 92800131チャンバー
インスリンシリンジエキシントインターナショナル26028生理食塩水と鎮痛剤を投与する
イソフルランMed-Vet InternationalSKU:RXISO-250吸入麻酔薬
イソフルランマトリックスVIP 3000気化器Midmark Inc91305430吸入麻酔薬送達のための装置
椎弓切除鉗子、デュモン#2FST11223-20デュラ
エア、圧縮リンデUN 1002のみ刺激装置&と併用精密な溶液注入のための空気を供給するためのPicoPump
Meloxicam SRZoo Pharm LLCLot # MSR2-211201鎮痛剤
Microhematocrit ホウケイ酸ガラス 校正済み毛細管Globe Scientific Inc51628指定された座標への材料のトランスフェクション用
マウスアダプターStoelting0051625 マウス手術のためのラット定位固定装置フレームの適応
ニードルホルダー、学生ハルステッド-蚊の止血FST91308-12合用
酸素レギュレータ生命維持製品S / N 909328、ロット092109酸素タンクからの酸素レベルを調節
酸素タンク、圧縮リンデUSP UN 1072イソフルラン麻酔とともに提供
プラスチックカードではありません適用できない任意のしっかりしたプラスチックカード、定位フレーム(例えば、IDカード)に合うようにカット
PicoPump(または類似のもの)世界精密機器(WPI)SYS-PV820精密溶液注入
生理食塩水、滅菌マウンテンサイド医療機器H04888-10中に失われた体液を置き換えるメス
ハンドル、#3FST10003-12メス
サミを保持し、ポリプロピレン縫合糸をカットする
ハサミ、付属のボックスFST15002-08さみで硬膜を開くためだけに、体を持ち上げるためのボックス
固定マイクロマニピュレーターKopf1760-61電極ホルダーに取り付けて座標に基づいて
位置を調整する定位「U」フレームアセンブリと細胞内ベースプレートKopf1730-B、手術用1711フレーム
滅菌綿チップアプリケーターピューリタン25-806 10WC手術野から血液を吸収
滅菌されていない穴あきドレープヘンリー・シャイン9004686滅菌手術野用
滅菌光学軟膏PuralubeP1490眼潤滑剤
刺激装置&精密な解決の注入のための制御されたpresurred空気を提供する草の医療機器S44
外科の刃#10Med-Vet InternationalSKU:皮切開のための
外科用鉗子、余分細いGraefeFST11153-10皮を握る
外科用手袋Med-Vet InternationalMSG2280Z
手術用顕微鏡ライカモデル M320/F12手術部位の5倍-40倍率
縫合糸 5-0 ポリプロピレンオアシスMV-8661皮膚を閉じる
テガダーム3M3M ID 70200749250滅菌バリアを提供します
ユニバーサルクランプとスタンドポストKopf1725定位 U フレームと細胞内ベースプレート
に取り付けられた 創傷フックハートマン止血剤FST18200-09、13003-10は、筋肉を分離し、手術窓を提供します
ガラスためのギメディカル剤 縫ー します 空気圧手術ハワーグナーFST14070-12スプリングはを管10SSは

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