マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

マウス¹の脳部位を標的とする標準的な定位手術は、一般に、一組のイヤーバーおよびマウスバーを用いた頭蓋骨の固定を含む。座標は、次に、参照アトラス^2,3、および頭蓋骨のランドマーク、すなわちブレグマ(前頭骨と頭頂骨の縫合糸が一緒になる点)またはラムダ(頭頂骨と後頭骨の縫合糸が一緒になる点;図1A、B)。推定された標的の上の頭蓋骨へのバリ穴を通して、マイクロインジェクションの送達またはカニューレまたは光ファイバーによる器具付けのいずれかのために、標的領域に到達することができる。これらの縫合糸の解剖学的構造の変化およびブレグマまたはラムダ^4,5の局在化における誤りのために、脳に対するゼロ点の位置は動物によって異なる。この変動から生じるターゲティングの小さな誤差は、大規模または近くのターゲットにとっては問題ではないが、前後または背側房面のゼロ点から離れた小さな関心領域、および/または年齢、緊張および/または性別によってサイズが変化する動物を研究する場合、その影響は大きい。延髄と上部頸髄に特有のいくつかの追加の課題があります。第1に、前後座標の小さな変化は、小脳の位置および形状に起因する硬膜に対する背腹座標の有意な変化と関連している(図1Bi)^2,6,7。第2に、上部頸帯は頭蓋骨²内には含まれない。第三に、後頭骨の傾斜位置と頸部筋肉²の層が傾いているため、脳幹と脊髄の移行部付近に位置する構造では、標準的な定位アプローチがさらに困難になります(図1Bi)。最後に、尾側脳幹および頸部コードにおいて関心のある多くの標的は小さく²であり、正確で再現性のある注射を必要とする^8,9。

貯水槽マグナを通る代替アプローチは、これらの問題を回避します。水槽マグナは、後頭骨からアトラス(図1A、すなわち、第2の椎骨)¹⁰まで延びる大きな空間である。それは脳脊髄液で満たされ、硬膜¹⁰によって覆われている。後頭骨とアトラスの間のこの空間は、頭部を前屈させるときに開く。これは、縦頭蓋筋の上にある対になった腹の間を移動し、尾側脳幹の背側表面を露出させることによってアクセスすることができる。関心のある領域は、背側表面の近くにある場合、これらの領域自体のランドマークに基づいてターゲットにすることができます。または、中心運河がIV心室に開く点であるobexを、座標がより深い構造に到達するためのゼロ点として使用することによって。このアプローチは、腹側呼吸器群、髄内側網状形成、孤独路の核、領域後脳、または舌下核を標的とするラット11、ネコ¹²、マウス^8、9、および非ヒト霊長類¹³を含む様々な種において首尾よく使用されている。しかし、このアプローチは、解剖学の知識、特殊なツールキット、および標準的な定位アプローチと比較してより高度な手術スキルを必要とするため、広く利用されていません。

ここでは、大槽 マグナを介して 脳幹と上部頸髄に到達し、ランドマークを視覚化し、ゼロ点を設定し(図2)、関心のある個別の脳幹および脊髄領域へのマイクロインジェクションの定位送達のためのターゲット座標を推定および最適化するための段階的な外科的アプローチについて説明します(図3)。次に、このアプローチに関連する長所と短所について説明します。

著者は、プロトコルがベスイスラエルディーコネス医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていると宣言しています。

1. 手術器具・定位フレームの作製

注:手術は無菌条件下で行われます。無菌性は、無菌チップ技術を用いて維持される。

1. 選択した注射剤(アデノ随伴ウイルス(AAV)または従来のトレーサー)を充填したマイクロピペットまたはシリンジで定位アームを定位フレームに取り付け、マウスアダプタを準備します(図2A)。
2. オートクレーブ処理された手術器具(材料表)を準備し、滅菌面に置きます。

麻酔誘導とマウス調製

1. O2_を 0.5 L/minでオンにし、イソフルラン気化器を4.0に設定し、_O2 の流れが誘導ボックスにあることを確認します。
   警告: イソフルラン誘導ボックスがフード内に置かれ、イソフルランが手術部位から取り除かれていることを確認してください。
2. マウス(10週齢の雄性C57BL/6J)を誘導チャンバーに入れる。
3. 呼吸が遅くなったら、誘導チャンバーを開き、マウスを少し持ち上げます。バリカンを使って頭から肩まで脱毛します。

3. 定位フレーム内でのマウスの位置決め

1. マウスを定位フレームに移動し、柔軟なノーズコーンにノーズを置きます。この段階で、_O2 の流れがノーズコーンに向けられていることを確認してください。
2. マウスを定位フレーム内に配置して、イヤーバーのみを使用します。
   メモ:イヤーバーが均一で、頭が水平であることを確認してください。
3. マウスの頭を 90° の角度に前屈させて、機首を手動で誘導します。この位置を固定するには、マウスアダプターのイヤーバーの柱の間に、柱と平行にプラスチック製のバリアを配置します。頭蓋骨の平らな部分は、従来の定位手術における平らな頭蓋骨のアプローチと同様に、基準として機能する。
   メモ:頭部を曲げすぎないでください(つまり、前頭蓋骨の平面とテーブルの表面の平面との間の角度が90°を超える場合)、上気道を流れる気流を妨げます。気流が妨げられる場合は、マウスの位置を変えて、体が体幹の下に支えられ、プラスチックカードが前頭蓋骨の平面と表の表面の表面の平面の間で90°に設定されていることを確認します( 図2A,C)。
4. 加熱パッドをマウスの下に置き、首と体の他の部分が同じレベル(つまり、テーブルとほぼ180°または平行)に配置されていることを確認します。スプリングハサミを保持するツールボックスを使用して、ボディをこの位置に持ち上げることができます。
   注:このステップは、頭蓋骨によって所定の位置に保持されているCNSのより多くの吻側部分とは対照的に、尾側脳幹および上部頸部が位置に応じて移動するので重要である。
5. 4mg/kgメロキシカム徐放性(SR)の単回投与を皮下(s.c.)に2μL/g体重の容量で注射し、眼に潤滑剤を塗布する。
6. 手術用切開部位を最初に70%アルコール調製パッドで洗浄し、次にベタジン調製パッドで、次にアルコール調製パッドで再度洗浄し、乾燥させる。
7. 体の下にドレープを置きます。
8. 手を消毒し、滅菌手袋を着用してください。
9. 手術部位にドレープを置きます。

4.水槽マグナにアクセスするための手術

1. マウスのつま先をつまむか、角膜反射をチェックして、マウスが適切に麻酔をかけられていることを確認してください。
2. イソフルランを維持レベル(2.0)まで低減する。
3. 1回の滑らかな動きで後頭骨の端から肩に向かって手術用ブレード#10で1〜1.2cmの切開を行います。
4. トラペジウス筋の正中線ラペに切開を行う。これは、対になったロンガス頭蓋炎筋を露出させる。
   注:マウスでは、トラペジウス筋は非常に細く、ほぼ透明な筋肉です。正中線にとどまり、不必要な出血を引き起こすため、下にある筋肉に切り込まないようにしてください。
5. 両方のリトラクターフックを、対になった縦鞘状頭蓋炎筋の間に、一方を左向きに、もう一方を右向きに配置します。止血剤の重量は、止血剤の位置を再調整することによって変更することができるリトラクターフックに張力を提供する。
6. 手術用顕微鏡を所定の位置に置き、手術野をよりよく視覚化します。
7. 鈍い椎間板切除鉗子を使用して、正中線が容易に見える後頭部から始めて、対になった縦鎌状頭蓋炎筋の左右の腹を分離する。鈍い鉗子を正中線の後頭部の骨を横切って槽硬膜に接するところまで導き、硬膜を横切ってアトラスまで進みます。
   注:ペアの縦頭蓋炎筋は、正中線でそれらを一緒に保持するものが何もないので、切断する必要はありません。そうすると不必要な出血を引き起こします。
8. リトラクターを再配置し、止血剤を再配置して張力を調整し、貯水槽マグナのビューを開きます。
9. 鈍い椎間板切除鉗子を使用して、正中線で筋肉をさらに分離し、脳幹と小脳の良好な視界を得る。
10. 必要に応じて、小脳と脳幹が硬膜の下に見えるまで、手順4.7-4.9を繰り返します。
11. 鈍い椎間板切除鉗子を使用して、脳幹の明確な視界があるまで、正中線から横方向に鉗子を動かすことによって結合組織の小さな鎖の硬膜をクリアし、ターゲットの必要に応じて、より多くの側方空間を作り出す。

5.槽膜の開口部

1. 角度の付いたデュモン鉗子(#4/45)を使用して、後頭骨からアトラスまで伸びる硬膜をつかみます。後頭骨の近くの硬膜をつかみ、スプリングハサミを使用して硬膜に小さな開口部(〜0.5〜1.5mm)を作ります。
   注:この吻側位置では、脳幹と上層の硬膜との間の空間が最も広く、硬膜を安全に操作するための十分なスペースを提供します。
2. スプリングハサミを使用して硬膜を持ち上げ、硬膜をさらに開きます。ウィンドウのサイズはターゲットによって異なります。
   注:複数の縦方向注射または両側注射を行う場合は、より大きなウィンドウが必要になります。単一の一方的または正中線の注射を行う場合は、小さなウィンドウで十分です。
3. 硬膜が開いたら、滅菌キューチップで余分な脳脊髄液を排出します。

6. ランドマークとゼロポイントの識別

1. 開いた硬膜を通して詳細なランドマークで脳幹の背側表面を見てください。中心管がIV心室に開く点であるobexは、標準的な前後および中側ゼロ点である。

7. ターゲット座標

注:さまざまなターゲットについて、方法論間の移行を容易にするために、ゼロ点ブレグマを基準とした前後(AP)座標と中側座標(ML)座標、およびゼロ点オブレックスを基準としたAP座標とML座標を持つ水槽マグナ座標のリストを含めました(表1)。背腹側(DV)座標は、APおよびMLの進入点における脳または小脳の表面(標準アプローチ)または脳幹または上部頸髄の表面(大槽マグナアプローチ)を基準とする。計画は手術前に行う必要があります。

1. ターゲットを決定するには、3 つの座標セット (AP、ML、DV) を使用します。頭の位置のために、脳幹構造の相対的な向きは場所によって異なる。
   1. 尾から茎までの目標距離>0.4mm(図1B、緑色)の場合、次の手順を実行します。
      1. AP: 標準的な定位参照アトラス(例:Paxinos および Franklin アトラス²)または横平面で切断された組織系列を使用して、obex とターゲットの間の AP 距離を推定します。
      2. ML: 横平面で切断された標準の定位参照アトラスまたは組織系列を使用して、obex とターゲット間の ML 距離を推定します。
      3. DV: AP および ML ターゲット ポイントの脳または小脳の表面を基準とした座標を推定します。横平面で切断された標準的な定位参照アトラスまたは組織系列を使用して、所望のAPおよびML座標における脳幹表面と標的との間の距離を推定する。
   2. 尾から茎までの目標距離<0.4mm(図1B、オレンジ色)の場合、次の手順を実行します。
      1. AP:脳幹の前方屈曲を考慮して座標を調整します。腹側座標および吻側座標の場合、AP 脳幹エントリ ポイントは、標準平面内のターゲット AP 座標に対してより尾側になります。
      2. ML: ターゲット座標は、標準の定位参照アトラスまたは横平面で切断された組織系列から取得します。座標は、ターゲット AP レベルで視覚化された正中線を基準にしています。
      3. DV: AP および ML ターゲット ポイントの脳幹の表面を基準とした座標を推定します。脳幹の前方屈曲を考慮してDVを調整する。腹側座標および吻側座標の場合、DV座標は、標準平面における脳幹の背側表面からの距離よりも大きくなる。

8. ターゲットの注入

1. 定位アームを使用してピペットまたはシリンジをターゲットに下げ、標準的な定位アプローチと同様に溶液を注入します。3-50 nLの容量を使用する場合、針のトラックを避けるために、注射後1〜5分間所定の位置に放置してください。次に、定位アームを使用してピペットまたはシリンジを持ち上げます。
2. 手順 8.1 を繰り返します。複数のターゲットの場合。

9. 手術野の閉鎖

1. 手術野からフックを慎重に取り外します。対になった縦鎌状頭蓋炎の筋肉は中立的な位置に戻り、水槽マグナを完全に覆います。台形筋と硬膜は縫合糸を保持するには壊れやすいため、正中線で閉じないでください。
2. 3つのナイロンまたはポリプロピレン縫合糸(5-0または6-0)で皮膚を閉じます。

10. 術後ケア

1. イソフルランをオフにし、マウスを定位フレームから取り外します。マウスを加熱パッドの上の清潔なケージに入れ、目を覚まして動くまで観察する。
2. 術後1〜3日目の健康状態、体重、縫合糸を監視します。まだ除去されていない場合は、10日目に縫合糸を除去してください。

水槽マグナアプローチは、標準的な定位アプローチでは到達しにくい、または一貫性のない標的化を起こしやすい尾側脳幹および上部頸索構造を標的にすることを可能にする。大槽に到達するための手術は、皮膚の切開、トラペジウス筋の薄い層、および硬膜の開口部を必要とし、したがってマウスによって十分に許容される。これは、標準的な定位アプローチのように複数のバリ穴をあける必要がないため、複数の(縦方向に分散したまたは両側の)サイトをターゲットにする場合、特に効率的で侵襲性が低いです。マウスでは、図3で舌下核と腹内側髄質(GiV)についてさらに例示するように、胸槽マグナアプローチを用いて尾側脳幹の舌下核9、腹側呼吸器群8、および隣接する網状形成8などの構造を日常的に標的化しています。例えば、舌下核は、背側髄質長方体における運動ニューロンのスリムだが吻側尾側に細長い柱であり、その吻側極は標準的なアプローチを介して標的とすることができる。しかし、DV座標(〜4.5mm)は、ほとんどが脳幹に入るわずか1.2〜1.4mmの上にある小脳によって決定されるため、マウスの頭部の位置の比較的小さな差は、したがって、誤った注射を容易に引き起こす可能性がある。この標的がゼロ点obexに近接しているため、槽マグナアプローチを介してより確実に標的とすることができる。さらに、脳幹と脊髄との間の移行まで延びる舌下核の尾端は、同じ大槽アプローチによって標的とすることができるが、標準的なアプローチは、APアプローチを釣り上げ、後頭骨および上層の頸部筋肉組織を避けるために座標を調整することによって、そのような尾部部位に到達するように修正されなければならない。

標準的なアプローチに対する水槽マグナアプローチの精度を決定するために、我々は腹側(腹内側髄質;GiA/V;N = 10)および背側(NuXII;N = 16)領域。測定は尾側脳幹の横切片で行った(図3)。結果(図4)は、標準的なアプローチと比較して、槽マグナアプローチの前後、中側、および特に背側平面における誤差が有意に小さいことを示している。これらの結果は、これらの標的に対する水槽マグナアプローチの精度が向上したことを強調している。我々は、標準的な定位座標(PaxinosとFranklin 2から派生したブレグマに対して、我々の研究のために最適化されている)と水槽マグナ座標(obexに対する相対座標)を 表1に含めた。これらの座標はすべて、 図3の舌下核および腹内側髄質について示されているように最適化および検証されています。

図 1: 主要なランドマーク、ターゲット領域、および定位水槽マグナ アプローチの平面の概略図。(A) 主要な解剖学的ランドマークと矢状平面での位置。(B)標準的な定位アプローチと水槽マグナ定位アプローチとそれらの基準点との関係を通じて到達できる領域。i)標準的なアプローチは、マゼンタと紫のターゲット領域から離れた骨のランドマークブレグマとラムダを利用しています。マゼンタの領域(尾髄延髄および上部頸部)は、斜めの後頭骨および頸部筋肉のために到達するのが困難である。紫色の領域(吻側髄質延髄)は動きやすく、伝統的なランドマークから遠く離れています。ii)槽マグナアプローチは、尾側髄質延髄および上部頸髄にアクセスするのに適しており、尾髄延髄から吻側に延びる縦柱に編成された脳幹構造を研究する際に利点を有する尾頸部のレベルまで。(C)貯水槽マグナアプローチに関連する様々な定位参照アトラスの平面の概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:定位貯水槽マグナアプローチのステップバイステップの概略概要。 (A)イヤーバーが最高レベルに均等に配置され、マウスバーが下降位置に配置され、前屈した頭部を90°の角度で固定するためのプラスチックカードを備えたマウスアダプタ。(B)イヤーバーを使用してマウスを立体粘着性フレームに固定し、頭を90°で前屈させ、定位フレームを基準として、硬質プラスチックカード を介して 所定の位置に保ちます。(C)体が後頭部と同じ平面にあるように上昇していることを確認してください。主要なランドマークを触診する。(D)後頭部から肩の吻側部分まで皮膚切開を行う。(E)トラペジウス筋のラペを切開する。正中線にとどまり、下にある筋肉に切り込まないようにしてください。(F)後頭筋から始まる縦鎌状頭炎筋の2つの腹の間の正中線を特定し、楕円形切除鉗子を尾方向に導く。(G)各創傷フックを縦頭蓋骨筋の腹の間に入れ、大槽マグナが見えるまで位置を変える。(H)骨のランドマーク(後頭骨、アトラス)、これらの骨構造の間に広がる硬膜、および基礎となる小脳と脳幹を特定する。必要に応じて硬膜をきれいにして、ターゲットレベルを公開します。(I)スプリングハサミと細かい鉗子を使って硬膜を開きます。(J) AP と ML のゼロ ポイントを形成する obex を特定します。ピペットを選択した AP 座標と ML 座標に移動します。ピペットを脳幹の背側表面に達するまで下げます。これがDVゼロポイントです。ピペットを目的の座標に下げます。(K)ピペットと傷口のフックを外し、縦頭蓋炎の筋肉を元の位置に戻します。(L)傷口を閉じ、マウスを定位フレームから外す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ターゲット座標の評価 尾側脳幹の低倍率顕微鏡写真。(a)逆行性トレーサーコレラ毒素サブユニットb(CTb;青色)をChAT-cre L10 GFP(緑色)レポーターマウス(雌、生後6ヶ月)の舌下核に注射する。CTb注射は舌下核に限定されていることに留意されたい。(B)vGluT2-ires-cre L10 GFPレポーター(緑色)マウス(雄、生後2ヶ月)のグルタミン酸作動性細胞を、延髄の尾内側髄質(GiV領域の尾極)の腹部に条件付き順行性トレーサー(マゼンタ)でトランスフェクションする。(C)vGLuT2-ires-creマウス(雄、生後2ヶ月)における条件付き逆行性トレースで、グルタミン酸作動性ニューロンのTVA(マゼンタ)トランスフェクションおよび尾内側延髄(GiV領域の尾極)における改変狂犬病感染(緑色)を示す。狂犬病ウイルスを上部頸椎脊髄に注入した。内部ランドマークはガイダンスとして機能します。略語-cAmb: アンビグウス複合体のコンパクト核;AP: エリアポストレマ;DMV:迷走神経の背側運動核;GiV:巨大細胞核、腹側部分;IO: 劣ったオリーブ。IRt: 中間網状核;LRN:側網状核;NuXII-低舌性核;sol:孤独な道の核;Sp5:脊椎三叉神経核;VRG:腹側呼吸器群。スケール バー: 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:標準アプローチと水槽マグナアプローチの精度の比較。前後面(A)、中間側平面(B)、および背側平面(C)における意図された標的の中心と実際の部位の中心との間の平均距離。データは、標準アプローチを用いたN=13匹の成体マウスおよび大槽アプローチを用いたN=13匹の成体マウスから得た。ターゲットの半径は30μmに設定した。結果は、前後平面(t(24) = 2.08, p = 0.049; 両側t検定; α 0.05)、中側平面(t(24) = 2.55, p = 0.018; 両側t検定; α 0.05)および背側房面(t(24) = 4.33, p = 0.0002; 両側t検定; α 0.05)においてより高い精度を示した。棒グラフは標準偏差で平均を表し、個々のドットは各マウスの値を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:尾側脳幹構造を標的とする標準および水槽マグナ定位座標の概要。標準アプローチと水槽マグナアプローチの両方で、PaxinosとFranklin Atlas2 からの座標は、組織学によって検証されたように関心のある領域が適切に標的化されるまで調整されていることに注意してください(図3)。また、網状形成の領域は明確に定義された境界を欠いており、ここではPaxinosとFranklin2のようにラベル付けされていることに注意してください。略語-AP:前後部。ML:中側。DV:背腹側。ChAT:コリンアセチルトランスフェラーゼ;F: 女性;M: 男性;M&F: 男性と女性;NA: 該当なし。Pet1:形質細胞腫発現転写因子1;セルト:セロトニントランスポーター、vGaT:小胞GABAトランスポーター;vGluT2:小胞グルタミン酸トランスポーター2;WT: ワイルドタイプ。すべての座標はミリメートル (mm) 単位です。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もありません。