マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般に頭蓋骨を介したアクセスを含み、頭蓋骨のランドマークによって導かれる。ここでは、脳幹のランドマークの直接可視化に依存する大槽 マグナを介して 尾側脳幹と上部頸部脊髄を標的とする代替定位アプローチを概説する。
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方法論記事
マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ
この記事について
サマリー
要約
マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般的に頭蓋骨のランドマークによって導かれる。その後、頭蓋骨に穴を開けたバリ穴 を介して アクセスが得られます。この標準的なアプローチは、尾側脳幹および上部頸椎帯の標的にとって、これらの部位が頭蓋骨のランドマークから遠く離れているため、特定の解剖学的課題のために困難であり、不正確さにつながる可能性がある。ここでは、尾側脳幹および上部頸椎の関心のある離散領域を標的とするために使用される、大槽を介した代替定位アプローチ を 概説する。大槽マグナは後頭骨からアトラス(すなわち、第2の椎骨)まで延びており、脳脊髄液で満たされ、硬膜で覆われている。このアプローチは、解剖学的障壁のために到達しにくい選択された中枢神経系(CNS)構造への再現可能なアクセス経路を提供する。さらに、標的部位に近接した脳幹ランドマークを直接可視化することができ、尾側脳幹および上部頸部の限られた関心領域に少量の注射を送達する場合の精度が向上する。最後に、このアプローチは、運動および感覚運動研究にとって重要な小脳を回避する機会を提供する。
概要
マウス1の脳部位を標的とする標準的な定位手術は、一般に、一組のイヤーバーおよびマウスバーを用いた頭蓋骨の固定を含む。座標は、次に、参照アトラス2,3、および頭蓋骨のランドマーク、すなわちブレグマ(前頭骨と頭頂骨の縫合糸が一緒になる点)またはラムダ(頭頂骨と後頭骨の縫合糸が一緒になる点;図1A、B)。推定された標的の上の頭蓋骨へのバリ穴を通して、マイクロインジェクションの送達またはカニューレまたは光ファイバーによる器具付けのいずれかのために、標的領域に到達することができる。これらの縫合糸の解剖学的構造の変化およびブレグマまたはラムダ4,5の局在化における誤りのために、脳に対するゼロ点の位置は動物によって異なる。この変動から生じるターゲティングの小さな誤差は、大規模または近くのターゲットにとっては問題ではないが、前後または背側房面のゼロ点から離れた小さな関心領域、および/または年齢、緊張および/または性別によってサイズが変化する動物を研究する場合、その影響は大きい。延髄と上部頸髄に特有のいくつかの追加の課題があります。第1に、前後座標の小さな変化は、小脳の位置およ....
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プロトコル
著者は、プロトコルがベスイスラエルディーコネス医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていると宣言しています。
1. 手術器具・定位フレームの作製
注:手術は無菌条件下で行われます。無菌性は、無菌チップ技術を用いて維持される。
- 選択した注射剤(アデノ随伴ウイルス(AAV)または従来のトレーサー)を充填したマイクロピペットまたはシリンジで定位アームを定位フレームに取り付け、マウスアダプタを準備します(図2A)。
- オートクレーブ処理された手術器具(材料表)を準備し、滅菌面に置きます。
麻酔誘導とマウス調製
- O2を 0.5 L/minでオンにし、イソフルラン気化器を4.0に設定し、O2 の流れが誘導ボックスにあることを確認します。
警告: イソフルラン誘導ボックスがフード内に置かれ、イソフルランが手術部位から取り除かれていることを確認してください。 - マウス(10週齢の雄性C57BL/6J)を誘導チャンバーに入れる。
- 呼吸が遅くなった....
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結果
水槽マグナアプローチは、標準的な定位アプローチでは到達しにくい、または一貫性のない標的化を起こしやすい尾側脳幹および上部頸索構造を標的にすることを可能にする。大槽に到達するための手術は、皮膚の切開、トラペジウス筋の薄い層、および硬膜の開口部を必要とし、したがってマウスによって十分に許容される。これは、標準的な定位アプローチのように複数のバリ穴をあける必要がないため、複数の(縦方向に分散したまたは両側の)サイトをターゲットにする場合、特に効率的で侵襲性が低いです。マウスでは、図3で舌下核と腹内側髄質(GiV)についてさらに例示するように、胸槽マグナアプローチを用いて尾側脳幹の舌下核9、腹側呼吸器群8、および隣接する網状形成8などの構造を日常的に標的化しています。例えば、舌下核は、背側髄質長方体における運動ニューロンのスリムだが吻側尾側に細長い柱であり、その吻側極は標準的なアプローチを介して標的とすること.......
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ディスカッション
標準的な定位手術は、CNS1の標的部位の座標を計算するために、一般的に頭蓋骨のランドマークに依存している。その後、標的部位は、頭蓋骨1にドリルで開けられたバリ穴を介してアクセスされる。この方法は、標的部位が前後面および背側腹面2の頭蓋骨ランドマークから遠くに位置し、頭蓋骨の解剖学的構造および上層筋肉がアクセスを困難にするため、尾側脳幹には理想的ではない6(図1Bi)。我々の研究は、尾側脳幹および上部脊髄の標的部位にアクセスするための代替定位アプローチを、槽マグナアプローチと呼ぶと述べている。この方法を標準的な定位アプローチと異なる主な特徴は、頭部の前屈が大槽を開く位置決めと、脳幹の背側表面における主要な脳幹ランドマークをobexなどの基準点として使用することである。我々の結果は、このアプローチが、少量(5-50nL)のトレーサーまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)を離散的な.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
この作業は、R01 NS079623、P01 HL149630、および P01 HL095491 によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アルコールパッド | Med-Vet International | SKU: | 手術部位感染の予防のためのMDS090735Z皮膚の準備 |
| 角度付き鉗子、デュモン#5/45 | FST | 11251-35 | は、硬膜 |
| Betadineパッド | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | 手術部位感染の予防のための皮膚の準備 |
| コレラ毒素サブユニット-b、アレクサフルオット488/594抱合体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 488:C34775、594:C22842 | 蛍光トレーサー |
| クリッパーウォール | モデルMC3、28915-10手術部位で毛皮を剃るためのウォールモデルMC3、28915-10 | ||
| コーナークランプ付き電極ホルダー | ピペットを保持する | Kopf | 1770 |
| 流量計 | ルモント機器 | モデル#65 MM | は、手術面 |
| 上のマウスへのイソフルランと酸素の流れを調節します蛍光マイクロスフェア、ポリスチレン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | F13080 | 蛍光トレーサー |
| 加熱パッド | ストールティング | 53800M | 温度調節 |
| ポートフックアップキット付き誘導チャンバー | ミッドマーク社 | 初期麻酔を提供する | 93805107 92800131チャンバー |
| インスリンシリンジ | エキシントインターナショナル | 26028 | 生理食塩水と鎮痛剤を投与する |
| イソフルラン | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | 吸入麻酔薬 |
| イソフルランマトリックスVIP 3000気化器 | Midmark Inc | 91305430 | 吸入麻酔薬送達のための装置 |
| 椎弓切除鉗子、デュモン#2 | FST | 11223-20 | デュラ |
| エア、圧縮 | リンデ | UN 1002 | のみ刺激装置&と併用精密な溶液注入のための空気を供給するためのPicoPump |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | 鎮痛剤 |
| Microhematocrit ホウケイ酸ガラス 校正済み毛細管 | Globe Scientific Inc | 51628 | 指定された座標への材料のトランスフェクション用 |
| マウスアダプター | Stoelting | 0051625 | マウス手術のためのラット定位固定装置フレームの適応 |
| ニードルホルダー、学生ハルステッド-蚊の止血 | FST | 91308-12 | 合用 |
| 酸素レギュレータ | 生命維持製品 | S / N 909328、ロット092109 | 酸素タンクからの酸素レベルを調節 |
| 酸素タンク、圧縮 | リンデ | USP UN 1072 | イソフルラン麻酔とともに提供 |
| プラスチックカード | ではありません適用 | できない | 任意のしっかりしたプラスチックカード、定位フレーム(例えば、IDカード)に合うようにカット |
| PicoPump(または類似のもの) | 世界精密機器(WPI) | SYS-PV820 | 精密溶液注入 |
| 生理食塩水、滅菌マウンテン | サイド医療機器 | H04888-10 | 中に失われた体液を置き換えるメス |
| ハンドル、#3 | FST | 10003-12 | メス |
| サミを保持し、ポリプロピレン | 縫合糸をカットする | ||
| ハサミ、付属のボックスFST15002-08 | さみで硬膜を開くためだけに、体を持ち上げるためのボックス | ||
| 固定マイクロマニピュレーターKopf1760-61 | 電極ホルダーに取り付けて座標に基づいて | ||
| 位置を調整する定位「U」フレームアセンブリと細胞内ベースプレート | Kopf | 1730-B、手術用1711 | フレーム |
| 滅菌綿チップアプリケーター | ピューリタン | 25-806 10WC | 手術野から血液を吸収 |
| 滅菌されていない穴あきドレープ | ヘンリー・シャイン | 9004686 | 滅菌手術野用 |
| 滅菌光学軟膏 | Puralube | P1490 | 眼潤滑剤 |
| 刺激装置&精密 | な解決の注入のための制御されたpresurred空気を提供する | 草の医療機器 | S44 |
| 外科の刃#10 | Med-Vet International | SKU: | 皮切開のための |
| 外科用鉗子、余分細いGraefe | FST | 11153-10 | 皮を握る |
| 外科用手袋 | Med-Vet International | MSG2280Z | |
| 手術用顕微鏡 | ライカ | モデル M320/F12 | 手術部位の5倍-40倍率 |
| 縫合糸 5-0 ポリプロピレン | オアシス | MV-8661 | 皮膚を閉じる |
| テガダーム | 3M | 3M ID 70200749250 | 滅菌バリアを提供します |
| ユニバーサルクランプとスタンドポスト | Kopf | 1725 | 定位 U フレームと細胞内ベースプレート |
| に取り付けられた 創傷フックハートマン止血剤 | FST | 18200-09、13003-10 | は、筋肉を分離し、手術窓を提供します |
参考文献
- JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , Neuroscience (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al.
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再版と許可
