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方法論記事

安定的にトランスフェクションされたメラノーマ細胞クローンの単離

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DOI:

10.3791/63371

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2022年8月4日

 ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wrocław

この記事について

サマリー

ガラスシリンダーを使用して安定的にトランスフェクションされた黒色腫細胞クローンを単離するためのプロトコルが記載されている。私たちは、手順全体の成功に決定的となる可能性のある実践的なアドバイスに焦点を当てています。

要約

ゲノム情報に安定した変化を持つ細胞集団は、研究モデルとして科学者に広く利用されています。細胞トランスフェクションを繰り返す必要はなく、細胞内トランスフェクションは細胞集団の不均一化やトランスフェクション効率のばらつきを引き起こし、再現性に影響を与える可能性があるためです。さらに、大規模な分析に適しています。安定な細胞クローンの作製は、遺伝子機能の研究や組換えタンパク質の作製など、幅広い応用に有用です。最初の一過性トランスフェクションで均質な細胞集団を得る方法はいくつかあります。ここでは、ガラスシリンダーによるシングルセルクローンの単離について説明します。この方法は以前から知られていましたが、いくつかの重要な手順があり、それらを怠ると失敗につながる可能性があります。この方法を使用して、目的のタンパク質を安定して過剰発現するクローン(POI)または目的の遺伝子をノックアウトするクローン(GOI)を取得することに成功しました。薬物濃度選択の最適化、ガラスボンベの調製、得られたクローンがGOIの発現に望ましい変化があるかどうかのPCRによる検証、ウェスタンブロット分析、免疫染色、またはgDNAシーケンシング(派生クローンの種類による)などの調製ステップについて説明します。また、確立された細胞株の表現型の不均一性についても、安定した細胞クローンを得る上で問題となる可能性があるため、これについても説明します。

概要

哺乳類細胞の安定トランスフェクションは、がん研究を含むいくつかの細胞培養アプリケーションで日常的に使用されている方法です。一過性トランスフェクションに対するその利点は、導入された外来遺伝物質が環境要因(細胞のコンフルエント性や複製段階など)や細胞分裂によって失われることがないことです。これは、宿主のゲノムに組み込まれているためです1。安定して発現する細胞株の開発は骨の折れる困難な作業ですが、長期間にわたる持続的な遺伝子発現が必要な場合は、安定細胞株の作製が好ましい選択肢となります。トランスフェクションの最も一般的な目的は、特定の遺伝子または遺伝子産物の発現の過剰産生またはダウンレギュレーションによる機能を研究することです。しかし、組換えタンパク質の産生や遺伝子治療には、細胞2への外来遺伝物質の導入も必要である。

クローンは、1つの個々の細胞から派生した細胞集団として定義されます。単一細胞クローンの単離は、遺伝子型および表現型の多様性を持つ細胞を研究する際の細胞生物学の重要な側面です。細胞クローンの導出には、希釈技術、クローニングリング技術3、細胞選別技術4の3つの主要な技術が使用されます。それぞれに長所と短所があります。ガラスシリンダー技術を使用して黒色腫細胞クローンを単離する方法について詳しく説明します。この方法の利点は、細胞が低密度の細胞培養から中程度のクローン増殖を示すことです。また、選抜された細胞は、すでにコロニーを形成しているため、すでに増殖能を発揮しています5。この手順では、トランスフェクションした細胞をまばらに播種しますが、希釈を制限するのではなく、大きな容器に播種し、選択的抗生物質の存在下で2〜3週間増殖してコロニーを形成するようにします。次に、個々のコロニーは、コロニーの上に置かれ、シリコーングリースを使用して容器に接着されたガラスシリンダーを使用して分離できます。次に、細胞をトリプシンで分離し、次にマルチウェルプレートに移して、選択培地の存在下でさらに培養します。

クローンの単離について記述した研究は数多くありますが、ここでは、選抜後2週間後のクローンのサイズ、単離時のクローンの位置のマーク方法、選抜のための適切な濃度の抗生物質の選択方法など、詳細を示すことに焦点を当てています。私たちは、手順全体の成功に決定的となる可能性のある実践的なアドバイスに焦点を当てています。提示されたプロトコルにより、2〜4週間以内に安定した細胞クローンを得ることができます。この方法は簡単で安価で、複雑な機器は必要ありません。私たちは、GSN KOクローン6,7,8を含む多くの研究モデルを取得することを可能にした技術を共有しています。

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プロトコル

1. 薬物濃度最適化のための細胞継代培養と播種

  1. 細胞培養培地(この場合は、NaHCO3、10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、1%(v / v)L-グルタミン、および1%(v / v)抗生物質-抗真菌薬)の濃度を下げたダルベッコの改変イーグル培地)とトリプシン溶液を水浴中で37°Cに温めます。
  2. T25細胞培養フラスコで増殖したA735細胞から細胞培養培地を吸引し、廃棄します。細胞株は、市販の供給源から入手します。
  3. フラスコを1 mLのトリプシンまたはPBS溶液で洗浄することにより、細胞から残っている細胞培養培地を洗い流します。
  4. 細胞からトリプシンまたはPBS溶液を吸引して廃棄します。
  5. 1 mLのトリプシン溶液をフラスコに加え、37°Cでインキュベートします。 倒立顕微鏡を使用して細胞の剥離を注意深く観察します。
  6. トリプシンの活性を停止するために、3 mLの新鮮な完全細胞培養培地を添加し、細胞が剥離したら細胞培養フラスコをそれで洗い流します。
  7. 細胞懸濁液をフラスコから15 mLの遠心チューブに移します。
  8. 細胞を800 x g で5分間、室温(RT)で遠心分離します。
  9. 上清を吸引して捨てます。
  10. 細胞を新鮮細胞培養培地1 mLに再懸濁します。
  11. 細胞密度を計算するには、自動セルカウンターまたは血球計算盤で細胞をカウントします。
  12. 適切なサイズの培養皿に適切な数の細胞を播種します。
    注:この実験では、A375細胞株の450,000個の細胞を、35 mm培養皿の2 mLの細胞培養培地に播種しました。

2. 選択した薬物濃度の最適化

  1. 安定な細胞クローンを選択するために使用する薬剤のメーカー推奨濃度範囲を見つけます。
    注:遺伝子ベクターによるトランスフェクションにより細胞に導入された選択遺伝子は、選択薬物に対する耐性を細胞に提供します。1 μg/mL の濃度のピューロマイシンを選択マーカーとして使用して、遺伝子ベクターの安定した発現を取得し、トランスフェクションされていない細胞を排除しました。
  2. 96ウェルプレートのウェルに細胞を播種し、翌日に50%のコンフルエンスに到達させます。各薬物濃度と未処理のコントロールに対して3つのウェルを準備します。ウェルあたり10,000個の細胞を播種します。細胞番号は、使用する細胞株によって異なり、経験的に決定する必要があります。
  3. 24時間後、製造業者が推奨する最低濃度から最高濃度までの完全培地で薬物を10希釈して調製し、それらを細胞に加える。
    注:この場合、ピューロマイシンを使用しました。濃度範囲は0〜10μg/mLでした。3日ごとに、または培地中に多くの死細胞が観察された場合は、新鮮な培地に交換します。
  4. 細胞を1週間毎日観察し、コントロールプレートに対する細胞の合流、増殖、および死について記録します。
    注:適切な濃度とは、細胞が増殖を停止し、すぐに細胞死を引き起こさず、48〜120時間後にすべての処理細胞を死滅させる濃度です。しかし、細胞株と薬剤の組み合わせによっては、細胞の増殖が止まって死滅する段階がない場合があります。このような状況では、すべての細胞を殺す最も低い濃度の薬物が選択に適しています。

3. 細胞播種とトランスフェクション

  1. 6ウェルプレートのウェルに細胞を播種します。
    注:細胞培養培地中の細胞懸濁液の最終容量は2.5mLである必要があります。この実験では、ウェルあたり450,000個の細胞を播種しました。細胞数は、播種の48時間後にそれらの合流が90%を超えないように、経験的に決定する必要があります。
  2. 細胞を37°Cで、5%のCO2 を含む加湿雰囲気で24時間培養します。
    注:細胞はトランスフェクション前に24時間培養しました。しかし、播種から48時間後には、細胞がより効率的にトランスフェクションされていることが観察されました。
  3. 細胞培養培地を吸引し、細胞の上に廃棄します。
  4. 廃棄した培地を、予熱した抗生物質を含まない細胞培養培地(10%(v/v)FBS、グルタミン添加DMEM)と交換してください。
    注:細胞培養培地を変更する必要があるのは、一部のトランスフェクション試薬によって引き起こされる細胞透過性の増加によるものであり、これにより細胞内への抗生物質の流入が増加し、細胞死につながる可能性があります。
  5. トランスフェクション試薬を抗生物質および無血清のDMEMで希釈します。ポリエチレンイミン(PEI)、脂質ベースのトランスフェクション試薬、またはエレクトロポレーションを使用してください。細胞トランスフェクションには、4 μgのDNAに対して2 mg/mLポリエチレンイミン溶液を1:2.175の重量比で使用します。
    注:DNA溶液として、2つのプラスミドの混合物をCRISPR/Cas9(D10A)システムで使用し、次のgRNA配列を使用しました:5'ccgggccgtgcagcaccgtg3'および5'atccagctgcacggtaaaga3'。
  6. トランスフェクション混合物をRTで30分間インキュベートします。
  7. インキュベーション後、トランスフェクション混合物を6ウェルプレートのウェルで増殖する細胞に滴下して慎重に加えます。
  8. 細胞を37°Cで、5%のCO2 を含む加湿雰囲気で2〜6時間培養します。
  9. 培地を完全細胞培養培地に交換します。
  10. 細胞を37°Cで5%のCO2 を含む加湿雰囲気で次の24時間培養します。

4. 細胞クローンの生成

  1. トランスフェクションした細胞をトリプシン化し、プロトコルのセクション1の指示に従って、20 mmの成形グリッドを備えた直径150 mmの培養皿に移します。
    注:高密度の場合、細胞が互いに融合するため、細胞を2つの細胞培養皿に均等に移すことをお勧めします。培養皿のグリッドは、クローンの位置を特定し、その移動を追跡するのに役立ちます。印刷されたディッシュプランでは、後でクローンの位置をマークできます(図1B)。さらに、培地の除去や空気への曝露に耐えられない細胞(死滅/不可逆的な損傷をもたらす)については、表面積の小さいより多くのディッシュを使用して、1つのディッシュから分離するコロニーを減らす方が良いでしょう。これにより、クローン単離中の空気への曝露時間が短縮され、細胞の脱水症の可能性が減少する可能性があります。
  2. 細胞を37°Cで、5%のCO2 を含む加湿雰囲気で24時間培養します。
  3. 細胞培養培地を選択的抗生物質を含む培地に変更します。
    注:この時点から、選択的抗生物質の存在下で細胞を培養することが重要です。そうしないと、統合された導入遺伝子が遺伝子から切り取られる可能性があります。
  4. 培地は3日ごと、または培地に多くの死細胞が浮かんでいるときに交換してください。
    注:この実験では、細胞をピューロマイシンと1μg/mLの濃度でインキュベートしました。細胞クローンの選択ステップには約2週間かかります。クローンの形成は、倒立顕微鏡で成長を観察して監視する必要があります。なぜなら、クローンが成長して隣接する細胞クローンと接触してはならないからです。1つのコロニーからの細胞が別のコロニーと一緒に移動して成長するのを防ぐことはできません。したがって、クローンからの細胞移動についてプレートを観察し、それに関する情報をディッシュプランに記録することが重要です。

5. 分離するクローンの選択

  1. 細胞培養皿で細胞クローンを倒立顕微鏡(10倍または20倍)で観察します。
    注:クローンは約500〜30,000個の細胞で構成されています。ただし、使用する細胞株によって異なります。満足のいくコロニーは、他の細胞コロニーから分離し、非常に大きく優れたクローンが複数の細胞から生じる可能性があるため、平均的なサイズである必要があります(図1B)。
  2. 倒立顕微鏡を使用して、ディッシュを注意深く調べ、見つかったクローンを評価することにより、適切なコロニーを見つけます。選択したクローンの位置にマーカーを置き、その下の皿にマーカーを置きます。同時に、印刷されたディッシュプランにコロニーの局在化をマークします(図1B)。
    注:ディッシュから約20〜30のコロニーを選択する必要があります。場合によっては、得られる細胞クローンが少なくなるため、そのような場合はそれらすべてを単離する必要があります。

6.ガラスシリンダーの準備

  1. クローンを単離する前に、ガラスシリンダー(直径6.4 mm、高さ8 mm)(図1C)を最初のガラス製ペトリ皿に入れ、オートクレーブします。
  2. 2番目のガラスシャーレをオートクレーブします。
  3. 2番目のオートクレーブ処理されたガラスペトリ皿の底にシリコーングリースの薄層を塗布します。皿を層流キャビネットの下に置き、UVライトを30分間適用して、シリコングリースを滅菌します。
    注:オプションで、シリコーングリースをオートクレーブ滅菌できます。
  4. オートクレーブ滅菌したシリンダーを、シリコングリースコーティングされたシャーレに浸します。これで、クローンを分離する準備が整いました。
  5. クローンを単離した後、シリンダーを取り扱う細胞材料に適用される規則に従ってシリンダーを洗浄します。遺伝子組換えの場合は、次亜塩素酸ナトリウムを使用して滅菌してください。
  6. シリンダーをキシレンで一晩洗って、シリコングリースを取り除きます。
  7. 化学フードの下でシリンダーを脱イオン水で洗い、キシレン溶液を取り除きます。
  8. シリンダーをペーパータオルの上に置き、乾かします。
  9. シリンダーはガラスのペトリ皿に保管します。
  10. 次回の使用前に、このマニュアルのポイント1から始めて、シリンダーを準備してください。

7. クローンの分離

  1. 各ウェルに0.5 mLの予熱済み完全細胞培養培地を含む24ウェルプレートを調製します。
  2. トランスフェクションした細胞を150 mmのディッシュで増殖させ、15 mLの温かい滅菌PBSで3回慎重に洗浄します。PBSを慎重に吸引して廃棄します。
  3. 滅菌ピンセットを使用して、片側にグリースが付着したシリンダーを移します。マークされたクローンのサイトで培養皿の底にあるシリンダーを押して、単一細胞クローン起源の成長コロニーの周りに孤立したウェルを作成します。
    注意: シリンダーは、液体の漏れを防ぐために底にしっかりとくっつく必要があります。
  4. 各シリンダーに50 μLのトリプシン溶液を加え、数分間インキュベートします。細胞を酵素的に傷つけないように注意してください。コロニーを1つずつ処理します。コロニーが他のもので汚染されないように、シリンダーごとにピペットチップを交換することを忘れないでください。
    注:インキュベーション時間は使用する細胞株によって異なり、経験的に決定する必要があります。トリプシン溶液は、細胞の剥離を容易にするためにピペッティングすることができます。倒立顕微鏡を使用して細胞の剥離を注意深く監視します。細胞剥離後、各シリンダーに50μLの細胞培養培地を添加してトリプシン活性を停止します。
  5. 直ちに100 μLの細胞懸濁液を24ウェルプレートの1ウェル内の培地に移します。
    注:ここでは、0.5 μg/mLの濃度の選択的抗生物質を使用してクローン増殖を継続しました。
  6. 24ウェルプレートで細胞クローンの成長をモニターし、90%のコンフルエントに達したら、6ウェルプレートに移します。プロトコルのセクション 1 の指示に従ってください。トリプシン(0.5 mL)と止め培地(1.5 mL)の容量のみを変更します。.
  7. 6ウェルプレートで増殖する細胞クローンをモニターし、コンフルエントに達したら、T12.5細胞培養フラスコに移します。
  8. T12.5細胞培養フラスコで細胞クローンを観察し、コンフルエントに達したら、自動セルカウンターや血球計算盤などの適切な方法で継代培養し、カウントします。選択的抗生物質、20%(v/v)FBS、および10%(v/v)DMSOを含む70%完全培地を含む培地中の細胞の半分を凍結します。残りの細胞をカバースリップ(12 mm x 12 mm)に播種して免疫染色し、6ウェルプレートの2つのウェルに播種してgDNAの単離とライセートの調製を行います。
    注:A375細胞株の場合、6ウェルプレートのカバースリップあたり45,000細胞、ウェルあたり450,000細胞をシードします。

8. 生成された細胞クローンの検証

  1. 免疫染色
    注:細胞上で免疫染色を行い、目的タンパク質(POI)の発現レベルを決定します。POIの発現レベルを比較できるようにするためのコントロールとして、野生型細胞またはコントロールクローンを同時に染色することが重要です(図2A)。
    1. 細胞培養培地を吸引して廃棄します。
    2. カバースリップ上で増殖している細胞をPBSで3回洗浄します。
    3. 各ウェルに0.5 mLの4%ホルムアルデヒド溶液を加えて細胞を固定し、室温で20分間インキュベートします。
      注:抗体が異なれば、必要な固定方法も異なります。
    4. 細胞をPBSで2回洗浄します。
    5. 細胞を透過処理するには、カバーガラスをPBS中の0.1% Triton X-100でRTで5分間インキュベートします。
      注:抗体が異なれば、必要な透過化方法も異なります。
    6. カバースリップをPBSで2回洗います。
    7. カバースリップを染色チャンバー9に置きます。
    8. 抗体の非特異的結合を避けるために、カバーガラスを0.1%(v/v)Triton X-100 PBS溶液中の1%(w/v)BSA中でRTで30分間インキュベートします。
    9. 針とピンセットを使用して、端のあるカバースリップをリグニンの一部に置き、溶液を取り除きます。
    10. 一次抗体を1%(w/v)BSA溶液および0.1%(v/v)Triton X-100溶液溶液で調製します。各カバースリップに30 μLの溶液を滴下し、湿った湿度チャンバーで4°Cで24時間インキュベートします。
      注:この実験では、1:200希釈のマウス抗GSN抗体を使用しました。
    11. 針とピンセットを使用して、端のあるカバースリップをリグニンの一部に置き、溶液を取り除きます。カバースリップを24ウェルプレートに入れます。
    12. カバースリップをPBSでRTで5分間3回洗います。
    13. PBS溶液中の1%(w/v)BSAおよび0.1%(v/v)Triton X-100中の二次抗体および色素を調製します。各カバーガラスに30 μLの溶液を滴下し、暗所の室温で1時間インキュベートします。
      注:ロバ抗マウス蛍光標識二次抗体488を1:200希釈で使用します。F-アクチンと細胞核を検出するために、ファロイジン-Alexa Fluor 568を1:200希釈で、Hoechst 33342を1:1000希釈で使用しました。
    14. 針とピンセットを使用して、端のあるカバースリップをリグニンの一部に置き、溶液を取り除きます。カバースリップを24ウェルプレートに入れます。
    15. カバースリップをPBSで3回、暗闇の中でRTで5分間洗います。
    16. カバースリップを脱イオン水で一度洗います。
    17. 封入剤を使用してカバースリップを顕微鏡ガラスに取り付けます。
    18. 共焦点顕微鏡を使用して細胞染色を視覚化し、派生クローンで発現するPOIのレベルを確認します(図2A)。
  2. ウェスタンブロット解析
    注:派生クローンにおけるPOI発現の欠如、上昇レベル、または低下レベルを確認するには、標準条件10でウェスタンブロット分析を実施します。野生型細胞またはコントロールクローンを同時に解析します(図2B、C)。
    1. 6ウェルプレートのウェルで増殖する細胞をPBSで3回洗浄します。
    2. スクレーパーを使用して選択したバッファーに細胞を収穫し、20秒間穏やかにボルテックスします。サンプルの凍結(-80°C)と解凍(4°C)の3サイクルを実行します。
      注:細胞骨格結合タンパク質抽出バッファー[10 mM Tris-HCl pH 7.4、100 mM NaCl、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1 mMエチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)、1 mM NaF、20 mM Na4P2O7、2 mM Na3VO4、1%(v / v)Triton X-100、10%(v / v)グリセロール、 0.1% (w/v) SDS、0.5% デオキシコール酸ナトリウム]、または尿素緩衝液 [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5% (w/v) SDS, 8.6% (w/v) スクロース, 74 mM 尿素, 1 mM DTT]、いずれも 1:100 プロテアーゼ阻害剤カクテル、1:100 セリンホスファターゼ阻害剤、および 1:100 チロシンホスファターゼ阻害剤を添加したものです。
    3. ライセートを12,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    4. サンプル中のタンパク質濃度を測定します(例:BCAアッセイによる)。
      注:アッセイは、緩衝液組成物との適合性に依存します。
    5. サンプルのウェスタンブロット分析を行うには、ポリアクリルアミドゲル(7%-15%)の各ウェルに30 μgのタンパク質をロードします。
    6. SDS-PAGE電気泳動を行い、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写します。
    7. 適切な抗体でメンブレンを染色することにより、POI発現レベルを視覚化します(図2B、C)。
      注:1:2000希釈のマウス抗GSN抗体と1:200希釈のマウス抗GAPDH抗体を使用しました。詳細については、論文2,11を参照してください。露光時間は、微弱な信号を見落とさないように十分に長くする必要があります(図2C)。
  3. gDNA解析
    注:顕微鏡およびウェスタンブロット技術により、派生クローンのPOI発現レベルを推定した後、ゲノムDNAを解析する必要があります。得られたクローンのgDNAテンプレート上で得られたPCR反応産物の長さを比較すると、GOIの配列が編集されたかどうかに関する情報が得られます(図2D)。
    1. 6ウェルプレートのウェルで増殖する細胞をPBSで3回洗浄します。
    2. スクレーパーを使用して、1 mLのPBSで細胞を回収します。
    3. 細胞を5000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    4. 上清を吸引して捨てます。
      注:ペレットは-80°Cで数ヶ月間保存できます。
    5. 市販のgDNA抽出キットを使用して、派生クローンのペレットからgDNAを単離します。
    6. CRISPR/Cas9遺伝子編集部位でgRNAターゲットの上流および下流に少なくとも300 bpをアニーリングすることにより、PCRプライマーを設計します。
      注:次のプライマーを使用しました:Fwd:5'gtgcagccaggatgagag3'、Rev:5'ccctgttactggtgcatc3'。
    7. DNA Polymerase Master Mixを使用して、製造元の指示に従ってPCR反応を行います。
      注:PCR反応混合物の組成を 表1に示し、PCR反応のサーモサイクラー設定を 表2に示します。
    8. Tris-acetate-EDTAバッファー(40 mM Tris pH 8.0、20 mM酢酸、1 mM EDTA)中の1%または2%(w/v)アガロースゲル中のPCR産物を分析します。
    9. GSN KOクローンのPCR産物アンプリコン長とCTRL KOクローンのPCR産物長(203 bp; 図 2D)。
  4. gDNAシーケンシング
    1. CRISPR/Cas9(D10A)プラスミドによってコードされたgRNAによって認識される配列の上流および下流の配列にアニーリングすることにより、PCRプライマーを設計します。
      注:次のようにプライマーを設計します:Fwd:5'gatctcgagctcaagcttctcgaattctgaacagtgcagacctttg3'、Rev:5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'。
    2. High-Fidelity DNA Polymerase(このような解析にはDNA増幅時に高い精度が要求されます)とgDNAをテンプレートとして使用してPCRを実施します。
      注:PCR反応混合物の組成を 表3に示し、PCR反応のサーモサイクラー設定を 表4に示します。
    3. 複数のクローニング部位内の制限酵素を用いてプラスミドを直鎖化し、37°Cで1時間インキュベートします。
      注:制限酵素消化反応混合物の組成を 表5に示します。使用されているプラスミドは関係ありません。pACGFP-C1は EcoRI酵素で直鎖化されました。
    4. インサートの濃度を推定し、アガロースゲル電気泳動によりプラスミドを切断します。
    5. DNAアセンブリ反応を準備します。
      注:従来のクローニング方法またはその他の方法を使用できます。
    6. コンピテントバクテリアを形質転換する(例:ヒートショック法による)12。
    7. プラスミドを単離します(例えば、製造元の指示に従って、または引用されたプロトコルに従って、コンストラクトごとに6つの細菌コロニーから)13。
    8. インサートがプラスミドに正常にクローニングされたかどうか、およびその長さが適切であるかどうかを制限酵素消化とDNA電気泳動によって確認します。
      注:選択したコロニーにインサート付きのプラスミドが含まれていない場合、プラスミドは後続の細菌コロニーから単離する必要があります。
    9. プラスミドシーケンシングによる遺伝子編集の確認(図3)。
      注:遺伝子の2つの対立遺伝子が存在するため、各派生細胞クローンのDNAシーケンシングの少なくとも2つの異なる結果を得る必要があります。倍数体細胞株(2 n以上)の場合、得られた細胞内のすべての遺伝子コピーの配列を得るためには、より多くのプラスミドの配列決定が必要です。遺伝子のすべてのコピーのクローニング配列を持つプラスミドが単離されるまで、必要な数のコロニーを単離します。市販のキットを使用して、研究された遺伝子の遺伝子座の数を推定できます。
    10. GSN KOおよびCTRL KOクローンで得られたgDNA配列を、マルチプルシーケンシングアラインメントプログラムを用いて比較します(図3)。
試薬容積
DNAポリメラーゼマスターミックス7.5 μl
フォワードプライマー(10 μM)1.5 μl
リバースプライマー(10μM)1.5 μl
滅菌水3.5 μl
gDNAの1 μl 10 ng gDNA を含む

テーブル 1.PCR反応混合物の組成。

ステップス温度 [°C]時間 [分: 秒]
19504:00
29500:30
35700:30
47200:45
52, 35x に移動X
67210:00
78∞

テーブル2.PCR反応のサーモサイクラー設定。

試薬容積
5 x High-Fidelity DNA ポリメラーゼバッファー4 μl
dNTP(10 mM)0.4μl
フォワードプライマー(10 μM)1 μl
リバースプライマー(10μM)1 μl
滅菌水12.4 μl
gDNAの1 μl 10 ng gDNA を含む
ハイフィデリティDNAポリメラーゼ0.2μl

テーブル3。PCR反応混合物の組成。

ステップス温度 [°C]時間 [分: 秒]
19800:30
29800:30
36100:30
47201:00
5ステップ 2 に 35 回進みます。X
67210:00
78∞

テーブル4。PCR反応のサーモサイクラー設定。

試薬量
10 x バッファ3 μl
制限酵素1 μl
滅菌水20.7μl
プラスミド5.3 μl (5 μg の DNA を含む)

テーブル5。制限消化反応混合物の組成。

9. 細胞株の表現型の不均一性を評価する

  1. 細胞の免疫染色を行い、POI発現レベルを決定します。
  2. 共焦点顕微鏡で60倍の油浸レンズを使用して、倍率なしで写真を撮ります。
  3. 異なるレベルの細胞の分布比を確立するには、ほとんどの顕微鏡画像解析プログラムで通常利用可能な「露出オーバー/アンダー」ツールを使用します。露出不足の領域を示す細胞は、低レベルでPOIを生成するものとして扱います。露光過多の細胞をPOI発現量の多い細胞として分類し、残りの細胞を中程度レベルでPOIを発現する細胞として分類します。

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結果

提示されたプロトコルを使用して、ガラスシリンダー法による安定的にトランスフェクションされた黒色腫細胞クローンの単離の詳細なデモンストレーションを提供します(図1A)。私たちの研究は黒色腫細胞生物学に関連しており、私たちが使用する最も一般的な研究モデルは、接着性で高侵襲性のA375黒色腫ラインです。私たちの研究により、黒色腫細胞は他の種類の癌と比較して高レベルでゲルソリン(GSN)を産生することが示されているため14、このタンパク質が黒色腫の進行に果たす役割を調査しています。GSNは、メラノーマ細胞の運動性に関与するアクチン結合タンパク質です15。これは6つのドメインで構成され、そのアイソフォーム16に応じて82-84 kDaの分子量を有する。GSNは細胞質、核、および原形質膜に局在し、メラノーマ細胞のF-アクチンリッチ構造に見出すことができる8。

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ディスカッション

我々は、ガラスシリンダーを用いた安定トランスフェクションされた黒色腫細胞クローンの単離について詳細に説明してきた。遺伝子の発現が変化したクローンを導出する際には、標的修飾クローンの結果とコントロールの結果を常に比較する必要があるため、コントロールクローンを取得することが重要です。このようにして、トランスフェクション自体または選択的抗生物質による培養が、導入された遺伝子改変などの他の要因ではなく、実験の結果に影響を与えないかどうかを確認できます。細胞クローンの調製を計画する際には、試験した細胞株がPOIの産生において均一であるかどうかを確認する価値があります。A375細胞におけるGSN発現(図2E)とは対照的に、コントロールクローンの取得後に不均一性を保持しない不均一なPOI発現を有することは、選択において考慮する必要があります。

クローニング手順に関連する最も一般的な問題は、トランスフェクションの効率の低さです。さらなる研究では、A375細胞株の場合、こ...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、ポーランド国立科学センター(プロジェクト#2016/22/E/NZ3/00654、AJMに付与)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15ml遠心分離管GoogleLab ScientificG66010522
150 mm細胞培養皿、20 mmグリッドファルコン353025
24ウェルプレートVWR International10062-896
35 mm培養皿エッペンドルフEP0030700112
6ウェルプレートエッペンドルフEP0030700113
96ウェルプレートVWRインターナショナル10062-900 
酢酸、80%溶液Chempur115687330
AgaroseProna-AboBLE500
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062
anti-GAPDH antibodiesSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-47724
anti-GSN antibodies  - clone C20Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-6405
抗GSN抗体  - クローン GS-2C4Sigma-AldrichG44896
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA3294
Color Taq PCR Master Mix (2x)EurXE2525
Control Double Nickase PlasmidSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-437281
Coverslipsbionovo16283
ダコ実装媒体 クロンテックS3023
DMSO - ジメチルスルホキシドアプリケーションケムA3672,0250
DNA精製キット EurX3555-02
ロバ抗マウス-Alexa Fluor 488Invitrogen# A-21202
DTT - 1,4-ジチオスレイトールSigma-Aldrich10197777001
EcoRI サーモフィッシャーサイエンティフィックFD0274
EDTA- エチレンジアミン四酢酸 ポッホ(Pol-Aura)593280117
EGTA - エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 Sigma-AldrichE0396
FBS - ウシ胎児血清 Gibco10270-106
ゲルソリン CRISPR プラスミドSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-401005-NIC
ホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148
グリセロールSigma-AldrichL-4909
高グルコース Dulbecco'修正されたイーグル」NaHCO3の濃度が低下した(1.5 g / l)培地 ポーランド科学アカデミー,Wrocfigure-materials-1aw, Poland11-500
Hoechst 33342 サーモフィッシャーサイエンティフィックH3570
L-グルタミンGibco25030-024
リグニン BionovoB-0521
リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬 InvitrogenL3000-008
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
Na4P2O7Sigma-AldrichP8010
NaFSigma-Aldrich450022
NEBuilder 組立ツール http://nebuilder.neb.com/#!/
pACGFP-C1 Clontech
PageRuler 染色済みタンパク質ラダーサーモフィッシャーサイエンティフィック 26616
Perfect 100 bp DNA ladderEurXE3134
phalloidin-Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
ホスファターゼ阻害剤カクテル 2Sigma-AldrichP5726
ホスファターゼ阻害剤カクテル 3Sigma-AldrichP0044
Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ サーモフィッシャーサイエンティフィックF530S
Pierce BCA Protein Assay キット サーモフィッシャーサイエンティフィック 23225
ポリエチレンイミン(PEI)Sigma-Aldrich408727
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma-AldrichP8340
ピューロマイシンInviviGenant-pr
SDS-ドデシル硫酸ナトリウム Sigma-AldrichL4509
シリコーン CX80 Polska
塩化ナトリウム - NaClChempur7647-14-5
オキシコール酸ナトリウムSigma-AldrichD6750259
スクロースPoch (Pol-Aura)PA-06-772090110
ガラスシリンダー Sigma-AldrichC3983-50EA
組織培養フラスコ 25mLVWR International10062-868
組織培養 75 cm2 フラスコVWR10062-872
トリズマベースSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichX100
トリプシン ポーランド科学アカデミー,Wrocfigure-materials-2aw、ポーランド20-500
尿素Sigma-Aldrich8656
キシレン溶液Chempur115208603
デ

参考文献

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