インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

Summary

ここでは、複数の濃度応答を同時に取得しながら細菌群動性を評価するためのインデューサーグラジエントプレートの使用について説明します。

Abstract

細菌群動性は、細菌群集が半固体表面上を移動するために使用する一般的な微生物学的表現型である。誘導された群動性の調査において、誘導物質の特定の濃度は、種から所望の応答を引き出すために最適濃度範囲内で起こる事象を報告することができない可能性がある。複数の濃度を含む半固体プレートは、インデューサー濃度範囲内の応答を調査するために一般的に使用される。しかし、別々の半固体プレートは、不均一な凝固時間のために各プレート内の中粘度および含水率の変動を増加させる。

この論文では、単一のグラジエントプレート上で表面群動性を同時に試験するワンステップ法について説明し、アイソメトリックに配置された試験ウェルは多濃度応答の同時取得を可能にする。本研究では、 大腸菌 K12および 緑膿菌 PAO1の表面群動を、レスベラトロールおよびアラビノースなどの誘導物質の濃度勾配に応答して評価した。定期的に、群れの形態を画像化システムを用いて画像化し、表面全体の群動過程を捉えた。

群れの形態の定量的測定は、ImageJソフトウェアを使用して取得され、群れ領域の分析可能な情報を提供しました。この論文は、表面群動に対するインデューサーの効果に関する定性的および定量的な情報を提供する単純な勾配スウォームプレート法を提示し、より広い範囲の運動性細菌種に対する他のインデューサーの効果を研究するために拡張することができる。

Introduction

細菌群動性は、物質の表面を横切る細菌細胞の集団的移動を指す。実験室で特別に準備された半固体寒天プレート¹に加えて、この表現型は動物組織²、水和表面³、植物の根⁴などのいくつかの柔らかい基質にも観察されます。半固体表面は細菌群がる基本的な条件の1つと考えられていますが、いくつかの種はまた、それらの群動性をサポートするためにエネルギーに富んだ培地を必要とします⁵。鞭毛の回転は、水泳と群がる運動性の両方を動かします - 水泳は、液体環境内の単細胞運動性を表しますが、群れは半固体表面を横切る微生物集団の同期運動です。

基質粘度は細菌の運動性に影響を及ぼす。 ヘリコバクター・ピロリなどの病原性微生物の研究では、病原体の運動性はムチン層の粘度によって変化し、ヒト宿主の環境酸性化の影響を受けることが示されています⁶。これらの環境を再現するために、0.3%(w / v)を超える寒天濃度を使用した以前の研究では、細菌の遊泳運動性が制限され、表面群動への漸進的なシフトがもたらされた。1%(w / v)を超える寒天濃度の使用は、多くの種の群れ運動性を防ぎます⁷。表面に形成されるコロニーパターンは、特徴のない^mat8、雄牛の目⁹、樹状突起¹⁰、渦¹¹など、多様です。

このようなパターンの関連性は不明のままですが、これらのパターンは環境的および化学的手がかりに依存しているようです¹²。環境の手がかりは、温度、塩分濃度、光、pHなどのさまざまな側面をカバーしていますが、化学的手がかりには、微生物クォーラムセンシング分子、生化学的副産物、栄養素の存在が含まれます。AHL(N-ヘキサノイル-Lホモセリンラクトン)などの自己誘導物質クォーラムセンシングシグナル伝達分子は、界面活性剤の産生を調節することによって表面群動に影響を与えることができる^13,14。フィトアレキシン化合物であるレスベラトロールは、細菌の群れ運動性を制限する可能性があります¹⁵。

本研究では、野生型大腸菌K12株に対するレスベラトロールの勾配濃度の影響を調査し、操作された大腸菌K12-YdeHおよび緑膿菌PAO1-YdeH種のアラビノース誘導性群動性を調べる。YdeH酵素の産生はaraBADプロモーターを介してアラビノースによって誘導され、細胞のc-di-GMP摂動をもたらし、細菌群動性に影響を与える^16,17。この誘導性群動は、大腸菌K12-YdeHおよび緑膿菌PAO1-YdeH株を用いたアラビノース勾配群プレートを用いて研究される。

この勾配温板は、二層媒体を順次固化させることにより調製される(図1B)。最下層は、インデューサーと共に添加された培地を含み、支柱状のペトリ皿の片面に注がれる。最下層の固化に際し、シャーレは平坦な表面に戻り、そこでインデューサを含まない媒体を含む上層がプレートの反対側から添加される。スウォームプレートが完全に固化した後、固定レイアウトに従ってウォームプレートに穴を開けることによって(図1C)、または媒体硬化プロセス中にペグを含むプレートカバーの3Dプリントモデルを使用してウェルをインプリントすることによって(補足図S1)、等尺的に配列された保持ウェルが生成される。ゲルイメージングシステムは、異なる時点での群れ形態をキャプチャするために使用されます(図2)。ImageJソフトウェアを使用した表面スウォーミングの解析(補足図S2)は、表面スウォーミングプロセスの定量的結果を提供します(図3)。

したがって、我々は、誘導物質の濃度範囲内で表面群動運動性を試験する簡単な方法を提案する。この方法は、誘導物質を最下層培地に混合することによって他の誘導物質の複数の濃度応答を試験するために使用することができ、他の運動性種(例えば、 枯草菌、 サルモネラ・エンテリカ、 プロテウス・ミラビリス、 エルシニア・エンテロコリチカ)に適用することができる。このアプローチは、単一の化学誘導物質をスクリーニングするための信頼できる定性的および定量的結果を提供することができ、より多くの化学誘導物質を評価するために別々のプレートを使用することができる。

Protocol

1. グラジエントスウォームプレートの作製

1. 温培地の調製
   注: 異なる中粘度の簡単な比較については、ディスカッションのセクションを参照してください。0.7%(w/v)寒天濃度の温生培地をこのプロトコールで使用した。
   1. 2つの円錐形のフラスコに寒天を含むリソゲニーブロス(LB)粉末を調製する。各フラスコには、2gのトリプトン、2gの塩化ナトリウム、1gの酵母エキス、および1.4gの寒天が含まれる。二重蒸留水(_ddH2O)を加え、マグネチックスターラーバーを使用して懸濁液を攪拌する。追加のddH2Oを加えて、最終容量を200mLに調整します。
   2. この溶液を121°Cで20分間オートクレーブする。通気孔付きの通気性キャップまたはボトルシールフィルムを使用してください。
      注:寒天はオートクレーブで加熱すると溶解します。
   3. 温度が65°Cに下がったら、溶液を混合して均質性を確保し、短期間の使用のために培地を65°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに移します。
2. 最下層群媒剤の調製
   注:最下層培地は、群れ培地とインデューサーストック溶液の混合物です。インデューサー勾配群プレートの配合を 表1に示す。
   1. 凍結乾燥レスベラトロール粉末114.12 mgを5 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して100 mMレスベラトロール原液を調製し、この溶液を-20°Cで保存した。
   2. 6gのアラビノース粉末を30mLのddH2Oに溶解して₂₀%(w / v)アラビノースストック溶液を調製する。アラビノースが溶解するのを許すために10-15分待つ。溶液を室温で保存する。
   3. 65°Cのインキュベーターから培地を取り出し、室温に置きます。三角フラスコが保持できるほど冷えるまで、群れ培地を冷却します(〜50°C)。温水培地を室温で長期間置かないでください、これは寒天の固化を引き起こすので。
   4. 必要量のインデューサー原液を50°Cで温培地に加える(表1)。ピペットを使用して、インデューサー溶液を注ぐ代わりに分配します。静かに旋回して、インデューサーを群れ培地と混合します。
      メモ: この手順は、オートクレーブ処理できないインデューサ用です。媒体に気泡を導入しないように注意してください。
3. 二重層グラジエント群れプレートの作製
   注:上層培地は、0.7%(w / v)寒天を含むLB培地です。
   1. 13 x 13 cm角のペトリ皿にインデューサーの名前とひずみのラベルを付け、蓋の端に皿を支えます(図1B)。
   2. 50 mL ピペットまたは 50 mL 遠沈管を用いて 40 mL の暖かい下層培地 (50 °C) を加えます。
      注:あるいは、13 x 13cm角のペトリ皿の場合、40mLの最下層および上層媒体が適しています。10 x 10cm角のペトリ皿には、25mLの最下層および上層培地が適している。
   3. 最下層の媒体を層流フードの内側に覆われずに1時間硬化させます。媒体が固まる間、正方形のペトリ皿を邪魔しないでください。
      注:最下層を硬化させている間、インデューサーを含まない温媒体は、65°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに保持する必要があります。
   4. 最下層が完全に固化したら、蓋を外し、正方形のペトリ皿を層流フードの中に置きます。
   5. 50 mL ピペットまたは 50 mL 遠沈管を用いて 40 mL の温かい上層培地 (50 °C) を加える。
      注:上層培地にはインデューサーは含まれていません。
   6. ベンチトップの2層プレートを覆い、1時間邪魔されずに硬化させます。準備したプレートを4°Cで最大24時間保管してください。
      注:硬化時間を長くすると、水分含有量が減少し、群がる運動性が制限されます。

2. 大腸菌 K12および 緑膿菌 PAO1の増殖

1. _ddH2Oにトリプトン5g、NaCl5g、酵母エキス2.5gを加えてLB培地500mLを調製し、溶液を500mLに補充する。この溶液を121°Cで20分間液体サイクルでオートクレーブし、4°Cで保存した。
2. _ddH2Oにトリプトン1g、NaCl1g、酵母エキス0.5g、寒天1.5gを加えて1.5%(w/v)LB寒天培地100mLを調製し、溶液を100mLに補充する。この溶液を121°Cで20分間の液体サイクルでオートクレーブする。 寒天が固化するのを防ぐために、培地を50°Cの水浴に移す。
3. LB寒天培地フラスコが持ちやすい場合は、25mLピペットを使用して、20mLのLB寒天培地をシャーレ(直径10cm)に加えます。プレートを室温で一晩放置し、LB寒天プレートを4°Cで保存した。
4. -80°Cで保存したストック培養物を、使い捨て接種ループを用いてLB寒天ペトリ皿にストリーク大腸菌K12、大腸菌K12-YdeH、緑膿菌PAO1、および緑膿菌PAO1-YdeH株を採取する。反転させたシャーレを37°Cで一晩インキュベートする。
5. シャーレから異なる菌株の単一コロニーを選び、各コロニーを5mLのLB培地に接種し、220rpmに設定した実験室オービタルシェーカー中で37°Cで培養物をインキュベートする。
6. 培養密度が_OD600nm 〜1.0に達したら、培養物をシェーカーから取り出し、室温で置く。ステップ 3.2.1 で説明したように、培養密度を _OD600nm = 1.0 に調整します。

3. グラジエントウォームプレートの接種とインキュベーション

1. 接種井戸の調製
   注:標準距離で区切られたウェルを生成できる3Dプリントカバーモデルは、以下に説明する方法の代わりに使用できます(補足図S1)。
   1. 図1Cに示すA4用紙のウェル位置に印を付けます。2つまたは3つの反復を伴う1つの正方形のペトリ皿に3つの試験濃度を設定する。
   2. マークされたA4用紙を固化したグラデーションプレートの下に置きます。100 μL のピペットチップの広い側を、マークされた位置にある半固体培地表面に押し込みます。ピペットチップが上層培地の底に達するまでピペットチップを押します。
   3. 先端が底に触れたら、先端に垂直な力を加えないでください。先端を静かに回転させて、円筒形の内容物をよく分離します。
   4. ピペットチップを非常に短い距離に沿って水平に動かして、脇に置かれた狭い場所に空気が流れるようにします。親指と中指でピペットを持ちながら先端を人差し指で押して先端内部のガスの流れを遮断します。
   5. 先端を垂直に引き出し、井戸の内容物を先端に保持しながら引き出します。
      メモ:ウェルの内容物が滑り落ちる場合は、人差し指でもう少し圧力をかけて先端を完全に密閉します。
   6. マークされたすべての位置で手順3.1.2~3.1.5を繰り返します。接種前に群れプレートを覆う。
2. グラジエントプレート接種とインキュベーション
   1. 一晩生育培養密度を_OD600nm =1.0に調整する。
   2. 一晩成長培養した80 μLのピペットを各ウェルに入れる。細菌培養物を井戸の外にこぼさないでください。
   3. プレートをシーリングフィルムで包みます。長期観察(3〜5日)のために、滅菌実験室用ゴムテープでプレートを包む。
      メモ:ゴムテープは壊れにくいです。
   4. _ddH2Oで満たされたビーカーをインキュベーター内に置き、インキュベーター内の湿度を維持します。グラジエントウォームプレートを37°Cでインキュベートする。
      注:群れプレートを逆さまにインキュベートしないでください。これにより、細菌培養物が井戸から漏れます。
   5. 接種直後の群れプレートを画像化し、これを 0時間 時点として記録する。

4. 細菌表面の群れのイメージング

1. 12時間ごとにインキュベーターからスウォームプレートを1つずつ取り出し、プレートを水平に保持し、ゲルイメージングシステムに置きます( 材料表を参照)。
   注:プレートの表面に指紋を残さないでください。暖かいプレートの側面を清潔な手袋で保持します。
2. ゲルイメージングモードを選択します。群れプレートを白色光にさらす。焦点距離を調整して、群れの最も鮮明な視界を提供します。
   注: 特定のバッチ内のすべてのプレートに同じ焦点距離を使用します。
3. 露出時間を300msに調整して、明確な観察のために群れの明るさを高めます。しきい値を調整して、背景ライトからの干渉を最小限に抑えます。
   メモ:スレッショルドは、ゲルイメージングシステムの操作インターフェースで調整されます。左側の値を大きくして、背景光からの干渉を最小限に抑えます。右側の値を減らして、群れの明るさを高めます。このプロトコルでは、領域は通常 6,000 ~ 50,000 です。
4. さらに分析するために画像ファイルを保存します。イメージング時間、インデューサタイプ、グラデーションの向き、ひずみを .txt ファイルに記録します。

5. ImageJソフトウェアを使用して群れ領域を定量化する

1. ゲルイメージングシステムを使用して取得した画像ファイルをインポートします。
2. ImageJソフトウェアを使用してスケールバーを設定し、すべての画像に適用します。
   1. 線ツールを使用して、ボードの長さを示す線分を作成します。
   2. 「 |の分析」をクリックします。「スケールを設定」 をクリックして 、「スケールを設定」 ウィンドウを開きます。
   3. 実際の長さを「 既知の距離 」および「 長さの単位」に入力します。
      注:この作品では13×13cm角のペトリ皿が使われていたため、実際の長さは「130」、長さの単位は「mm」です。
   4. [ グローバル ] チェックボックスをオンにします。
   5. スケール バーを挿入するには、[ |の分析] をクリックします。ツールの|バーを拡大縮小し、「 幅」(mm)、 高さ(ピクセル単位)、 フォントサイズ」と入力し、ドロップダウンメニューから「 色」、「 背景」、および 「位置」 を選択します。または、チェックボックスをオンにして、[ 太字テキスト] 、[テキストの非表示]、[ セリフフォント]、および [ オーバーレイ ] を選択します。
      注: これらのパラメーターの選択は、ユーザーとイメージのプロパティによって決まります。このプロトコルでは、[ 幅] (mm 単位) を 25、 高さ (ピクセル単位 ) を 20、 フォント サイズ を 80 に設定し、[場所] を選択してスケール バーを右下隅に配置し |右下。他のパラメータは、ユーザが選択することができる。
3. [プロセス|]をクリックします。 影は 、画像の鮮明さ、特に境界を強調する(補足図S2A)。「|の処理」をクリックします。 バッチ 処理して画像を処理します。
   メモ: この手順の目的は、より正確な境界画定を提供することです。
   1. [|の処理] をクリックして、画像を参照として 処理します。影の|南。
   2. [|の処理] をクリックします。バッチ|マクロを使用して、「バッチ処理」ウィンドウを開きます。ウィンドウに表示されている次のコマンドを探します。
      run("South");
      run("Save");
      close();
   3. 元のイメージのフォルダアドレスと出力ファイルのアドレスを入力するには、「バッチ 処理 」ウィンドウで 「処理 」をクリックします。
      メモ: 影付きの画像を別のフォルダにエクスポートし、元の画像のコピーを保持することをお勧めします。
4. 杖(トレース)ツールを使用して群れを個別に選択し、生成されたラインが群れの境界に正しく収まるまで公差を調整します(杖(トレース)ツールをダブルクリックします)(補足図S2B)。
   メモ: まず、ワン ド(トレース)ツール をクリックし、1つの画像上の群れを選択します。境界が正しく描かれていない場合は、杖 (トレース )ツールをダブルクリックして 「杖ツール」(Wand Tool ) ウィンドウを開き、 公差 を調整できます。
5. [|の分析]をクリックします。面積値をエクスポートするためのメジャー。
6. すべての群れが測定されるまで手順 5.1.1 ~ 5.1.5 を繰り返し、結果を.csvファイルに保存してさらに分析します。

Results

勾配温プレートの調製、接種、およびインキュベーションからなるワークフローを 図1Bに示す。グラジエントスイミングプレートを生成するために、最下層培地を水平面から約4.3°で支柱状の皿に注ぎ(補足図S3)、続いて最下層が完全に固化した後に上層培地を注ぐ。二層培地の組成を 表1に示す。次いで、一晩培養した細菌培養物を試験ウェルにピペットで移し、適切なレベルの湿度を維持しながら37°Cでインキュベートした。複数の試験濃度を、2回または3回の反復で1つの勾配群板に設定する(図1C)。テストポイントに柱状突起を備えたカバー蓋の3D印刷モデルの代替オプションは、 補足図S1に示されています。

2つの遺伝子組み換え種、大腸菌K12-YdeHおよび緑膿菌PAO1-YdeHをアラビノース勾配プレート上で試験した。

Discussion

半固体グラジエントプレート上の細菌群動性の調査は、基質粘度、湿度、培地成分などの複数の要因を含むため、困難な作業になる可能性があります^18,19,20。これらの要因の中で、寒天濃度は、水泳または群がる運動性のいずれかへの微生物の復帰を決定する上で決定的な役割を果たす。寒天濃度が0.3%(w/v)から1%(w/v)に増加すると、細菌の遊泳運動性が制限され、徐々に表面群がりにシフトし、寒天濃度が1%(w/v)を超えると、水泳と群がる運動の両方が制限されます⁷。寒天濃度は、他の濃度よりも優れた性能を示したため、予備実験に基づいて0.7%(w / v)に固定された。

この寒天濃度は、以前は微生物の走化性²¹を研究するためにも使用されていました。寒天濃度の低下は、隣接するウェル間の重なりを伴い、より大きな群れ領域...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
寒天	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
遠心分離管	Corning	430790	15 mL
極低温バイアル	Corning	430488	2 mL
ジメチルスルホキシド (DMSO)	アラジン	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-アラビノース	アラジン	A106195	98%(GC)、500g
のペトリ皿	Bkman	B-SLPYM90-15	プラスチックペトリ皿、円形、90 mm x 15 mm
ベラトロール	アラジン	R107315	99%(GC)、25 g
塩化ナトリウム	マックリン	S805275	AR、99.5%(GC)、500 g
角型ペトリ皿	Bkman	B-SLPYM130F	プラスチックペトリ皿、正方形、13 mm x 13 mm
トリプトン	サーモサイエンティフィック オキソイド	LP0042	500 g
酵母抽出物	サーモサイエンティフィック オキソイド	LP0021	500 g
Equipments
生化学インキュベーター	ブルー pard	LRH-70
タノン 5200マルチイメージングシステム	タノン	5200CE
サーモスタット水バス	Jinghong	DK-S28