光干渉断層撮影法の網膜症モデルマウスへの応用

Summary

ここでは、マウス網膜症の診断と定量的測定を容易にするために、光干渉断層撮影法を用いた in vivo イメージング技術について述べる。

Abstract

光干渉断層撮影(OCT)は、網膜症の診断のための非侵襲的な方法を提供します。OCTマシンは、網膜の厚さを計算できる網膜断面画像をキャプチャできます。OCTは臨床現場で広く使用されていますが、基礎研究への応用は、特にマウスなどの小動物ではそれほど普及していません。眼球のサイズが小さいため、マウスで眼底画像検査を行うことは困難です。そのため、小動物のOCTイメージングに対応するために、特殊な網膜イメージングシステムが必要です。本稿では、OCT検査手順のための小動物固有のシステムと画像解析のための詳細な方法を紹介します。超低比重リポタンパク質受容体(Vldlr)ノックアウトマウスおよびC57BL/6Jマウスの網膜OCT検査の結果を提示する。C57BL/6JマウスのOCT画像は網膜層を示し、 Vldlr ノックアウトマウスのOCT画像は網膜下血管新生と網膜菲薄化を示した。要約すると、OCT検査は、マウスモデルにおける網膜症の非侵襲的検出および測定を容易にすることができる。

Introduction

光干渉断層撮影(OCT)は、組織1,2,3,4,5,6,7,8、特に網膜9,10,11,12の非侵襲的検査のために、in vivo高解像度および断面イメージングを提供できるイメージング技術です。.また、網膜の厚さや網膜神経線維層の厚さなど、いくつかの重要なバイオマーカーを定量するためにも使用できます。OCTの原理は光コヒーレンス反射率法であり、これは、試料から反射された光のコヒーレンスから断面組織情報を取得し、それをコンピュータシステム⁷を介してグラフィックまたはデジタル形式に変換する。OCTは、網膜疾患患者の診断、フォローアップ、および管理に不可欠なツールとして、眼科クリニックで広く使用されています。また、網膜疾患の病因についての洞察を提供することもできます。

OCTは、臨床応用に加えて、動物実験でも使用されています。病理学は形態学的特性評価のゴールドスタンダードですが、OCTには非侵襲的なin vivoイメージングと縦断的フォローアップという利点があります。さらに、OCTは網膜症動物モデル11、^13、14、15、¹⁶、^17、18、^19、20において組織病理学とよく相関することが示された。マウスは生物医学研究で最も一般的に使用される動物です。しかし、その小さな眼球は、マウスでOCTイメージングを行う上で技術的な課題をもたらします。

マウス²¹、²²における網膜イメージングに最初に使用されたOCTと比較して^、小動物におけるOCTは、ハードウェアおよびソフトウェアシステムに関して最適化されている。たとえば、OCTをトラッカーと組み合わせると、信号対雑音比が大幅に低下します。OCTソフトウェアシステムのアップグレードにより、より多くの網膜層を自動的に検出できます。統合されたDLPビーマーは、モーションアーチファクトを減らすのに役立ちます。

超低密度リポタンパク質受容体(Vldlr)は、内皮細胞の膜貫通タンパク質です。網膜血管内皮細胞、網膜色素上皮細胞、および外限膜^23、24の周囲に発現する。網膜下新生血管は、 Vldlr ノックアウトマウス²³の表現型である。したがって、 Vldlr ノックアウトマウスは、網膜下血管の病因および潜在的な治療法を調査するために使用される。この記事では、小動物モデルでの網膜症研究に技術的な参考資料を提供し、 Vldlr ノックアウトマウスの網膜病変を検出するためのOCTイメージングのアプリケーションを示します。

Protocol

手術は、視覚眼科学研究協会の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明に従って実施されました。実験デザインは、施設動物倫理委員会(日本医療倫理委員会、EC 20171213(4)-P01)によって承認されました。この研究では、生後2か月のC57BL / 6Jマウスと Vldlr ノックアウトマウスを使用しました。各群に7匹のマウスがいて、全員が雌で、体重は20gから24gでした。

1. 実験条件

1. マウスを2つのグループに割り当てます: Vldlr ノックアウトマウスからなる実験グループとC57BL / 6Jマウスからなる対照グループ。
2. 従来、マウスに餌と水を与えます。
3. 室温(22°C)、湿度(50〜60%)、明暗サイクル(12時間〜12時間)、および室内光強度(350〜400ルクス)の安定した条件下で動物実験室でマウスを飼育します。
4. 実験装置を準備します:小動物用の共焦点走査レーザー検眼鏡(cSLO)による光干渉断層撮影(図1A)。
5. 実験に必要なすべての材料を準備し(図1B)、マウスの体重を測定します(図1C)。

2. 情報記録

1. グループ、コード、生年月日、年齢、性別、体重、麻酔薬の投与量などの情報を記録します。

3. 機器の起動とテスト

1. コンピュータの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。
2. [テスト プログラム] ボタンをクリックして、 テスト プログラム を完了します。
3. サーモスタットの電源を入れ、37°Cの温度に予熱します。
4. プログラムのテスト後に OCT モジュール 手順を開始します。
5. 新しい件名を作成し、マウス情報を入力します。
6. 電気毛布を予熱し、外科用タオルで覆います。

4.麻酔

1. チレタミンとゾラゼパムを含む凍結乾燥麻酔薬粉末を使用して、麻酔薬混合物を調製します。.
   注:麻酔投与の選択、投与量、および経路については、地域の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。少なくとも1時間、不動および疼痛知覚の喪失をもたらす麻酔薬で動物を麻酔し、その後動物は急速に回復する。投与量は、実験時間の長さ、動物の体重、およびその他の要因に基づく必要があります。.
2. 調製した麻酔薬混合物を使用して動物を麻酔する。回復するまで、手順全体を通して動物を暖かく保つようにしてください。

5.散瞳液滴の適用

1. 首筋でマウスを手動で拘束し、眼球をわずかに突き出し、片方の目を上に向けてマウスの頭を回転させます。
2. 散瞳液滴を適用して瞳孔を拡張します(図2A)。
3. 10分後に瞳孔の拡張を確認します。

6.マウスの配置

1. 電気毛布のプラットフォームにマウスを置きます。
2. 医療用ヒアルロン酸ナトリウムゲルで両目をコーティングします(図2B)。
3. 60 D二重球面レンズ(プリセットレンズ)をcSLOデバイスにねじ込みます(図1A-5、6)。
4. マウスの角膜に100Dコンタクトレンズを置き、凹面側が角膜表面のヒアルロン酸ナトリウムゲルに触れます(図2C、Dおよび図3A-II)。
5. マウスを小型の恒温動物プラットフォームに置き、cSLOデバイスのレンズから目を1〜2 mm離します(図3A)。
6. 瞳孔をレンズの中央に保つために、鉗子でコンタクトレンズの角度を調整します。
7. 頭の調整を微調整して、目の向きをまっすぐにします。

7.共焦点走査レーザー検眼鏡(cSLO)

1. OCTボタンをクリックし、マウスモジュールを選択して、cSLOプログラムを起動します(図4B)。
2. IRモード(光源:赤色光)を選択し、パラメータを調整します(範囲:2047、図4D)。
3. 検査する目を選択します(右目:図4C-1、左目:図4C-2)。
4. レバーを制御し、プリセットレンズをコンタクトレンズに向かってゆっくりと動かします。
5. 後極の画像が明確になるまで視度値を調整します(図4E)。
6. 網膜後極の画像を視神経乳頭の中央に揃えるようにさらに調整します。

8.光干渉断層撮影(OCT)

1. OCT プログラムを起動します (図 4G)。
2. OCT画像が表示されるまで進行状況バーを上下にクリックします(図4H)。
3. パラメータを調整します:範囲最小(図4I)= 0-20、範囲最大(図4J)= 40-60。
4. 理想的なOCT画像が得られるまで、プリセットレンズの距離と位置方向を調整します。
5. cSLOの標準ラインを移動してスキャン位置を選択します(図4M)。
6. 視神経乳頭からスキャンを開始します。
7. 各目について同じ順序で画像を収集します:水平線:視神経乳頭→上→劣。垂直線:視神経頭→鼻→側頭。
8. 4方向から画像を収集します。
9. [平均]をクリックして、cSLOおよびOCTイメージ信号をオーバーレイします(図4Fおよび図4O)。
10. 撮影ボタンをクリックして、SLO-OCT画像を取得します(図4P)。
11. すべての画像を保存してエクスポートします(図4Q、R)。

9. 実験終了(OCT試験後)

1. マウスを電気毛布の上に置いて、目覚めるまで暖かく保ちます。
   注意: マウスは、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで監視する必要があります。術後の明るい光への曝露は最小限に抑える必要があります。
2. 100Dコンタクトレンズを取り外します。
3. 角膜を保護するためにレボフロキサシンアイジェルを適用します。
4. ウェイクアップ後、マウスをケージに戻します。
   注意: 検査したマウスが完全に回復するまで、他のマウスの会社に戻されていないことを確認してください。
5. ソフトウェアの電源を切り、コンピュータの電源を切ります。
6. 100 Dコンタクトレンズを水で洗浄します。レンズを乾かします。
7. 環境をきれいにして消毒します。

10. 画像解析

1. VldlrノックアウトマウスのOCT画像をC57BL/6JマウスのOCT画像と比較します。
2. 複数の位置を観察する:視神経乳頭を通過する垂直および水平スキャン。上、下、鼻、および側頭スキャン。異常な反射サイトスキャン。
3. 各画像の網膜の厚さ、形状、層状、異常な反射率病変、および網膜と硝子体の硝子体界面を観察します。
4. 病変の位置、特徴、および数を記録します。

11.網膜層別化補正

1. OCT インターフェイスの [負荷検査 ] をクリックします (図 5A)。
2. ポップアップ ウィンドウからマウスの OCT イメージを呼び出します。
3. 画像の選択:OCT画像は、視神経乳頭を水平または垂直にスキャンします。
4. メディアコンテナ内の画像をダブルクリックして、画面に表示します(図5C)。
5. [レイヤー 検出 ]をクリックして、網膜の自動レイヤー化を完了します(図5D)。
6. 解析用に準備したレイヤーの両側の分割線を選択します(図6D-10)。
7. 別の分割線を選択し(図6B-6)、レイヤーの編集(図6A-1)をクリックして、赤い円が表示されたら線をアクティブにします(図6B-7)。
8. 間隔(図6A-4、例:50)と制限範囲(図6A-5、例:50)を調整します。
9. 赤い円を移動して分割線を変更します(図6Bと図6Cの緑の分割線を比較してください。図6Cは修正結果を示す)。

12.網膜ラミネーションの厚さ

1. マーカーの測定ボタンをクリックします(図6D-9)。
2. 解析する層の分割線を選択し(例えば、外顆粒層で、リストの4^番目と5^番目の分割線を選択)、OCT画像上に層の境界を表示します(図6D-10)。
3. [レイヤーと接続](図6D-11)を選択し、移動中に接続を維持します(図6D-12)。
4. 結果を表示する領域を選択します(選択した列は色付きです、図6D-13)。
5. OCT画像上で解析する位置をクリックして、測定線を表示します(水平軸に垂直で、結果の領域の色と一致します)(図6D-14)。
6. 次の測定の次の列をクリックして、前のデータを表示します(図6E-15)。
7. μm単位の長さ(組織)行のVert値(測定位置の厚さ)を読み取ります(図6E、赤い長方形)。
8. マーカーの削除(図6E-16)と新しいマーカー(図6E-17)をクリックして再テストし、結果が元のデータをカバーするようにします(再測定が必要な場合)。
9. キーボードの Print Scr を押してスクリーンショットを保存するか、[ 検査の保存 ]をクリックして直接保存します(図5H)。
10. 統計分析のためにスプレッドシートまたは統計ソフトウェアにデータを入力します。

13.網膜全体の厚さの測定

1. ライン 1 (ILM、内限界膜、 図7B)と ライン7 (OS-RPE、OS:外側感光体セグメント;RPE:網膜色素上皮層、 図7C)の右上隅のリストにある。
   注:網膜の全厚さとは、OCT上のILMとOS-RPEの間の網膜である網膜神経上皮層の厚さを意味します。
2. 視神経乳頭の両側の網膜の厚さを特定間隔で測定します。
   1. 例:視乳頭の端にある網膜構造の外観から、水平定規の200μm間隔で4つの値を測定します(図7G、H)。
3. すべての測定値をスプレッドシートに記録します。
4. 複数の t検定(行ごとに1つ)を使用して、両方のグループの対応する各位置の測定値を比較します。

Results

OCTの高解像度スキャンのおかげで、マウスの網膜の層を観察することができ、異常な反射とその正確な位置を特定することができます。この研究では、 Vldlr ノックアウトマウスとC57BL / 6Jマウスの網膜OCT画像を比較しました。すべてのC57BL/6JマウスのOCT画像は、反射率の異なるさまざまな網膜層を示し、境界は明確でした(図8D)。対照的に、すべての Vldlr ノックアウトマウスは、OCT画像上に異常な過反射病変を示した(図8B)。

Vldlrノックアウトマウスにおける不完全硝子体剥離(PVD)

OCTの結果は、 Vldlr ノックアウトマウスの網膜表面にいくつかの中央反射バンドを示した(

Discussion

本研究では、小動物網膜イメージングシステムを用いたOCTイメージングを適用して、不完全な後硝子体剥離、網膜下新生血管形成、および網膜厚さの菲薄化を示す Vldlr ノックアウトマウスの網膜変化を評価しました。OCTは、 生体内の網膜の状態を調べるための非侵襲的なイメージング方法です。ほとんどのOCTデバイスは、人間の目の検査用に設計されています。ハードウェア機器のサイズ、焦点距離の設定、システムパラメータの設定、および受験者の位置決め要件はすべて人間の目に基づいています。人間専用のOCT機器で小動物を検査するには、レンズとシステム設定の変更が必要です。本稿では,小動物OCT検査手順について述べる.

焦点距離は、眼球のサイズが異なるさまざまな小動物の画像スキャン中に異なります。この焦点距離の違いは非常に重要であり、鮮明で正確な眼底画像を取得するには解決する必要があります。効果的な方法の1つは、対物レンズを異なる曲率のレンズに置き換えることです。眼球が小さいため、マウスはOCT機器の二重球面60Dプリセットレンズに加えて、角膜の前に100Dのコンタク...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dptコンタクトレンズ	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		アクセサリー RETImap
ダブル非球面60-Dptガラスレンズ	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		アクセサリー RETImap
所属 電熱ブランケット	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35 cm
注射器(1mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
レボフロキサシン塩酸塩アイジェル	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g:0.015 g
医療用ヒアルロン酸ナトリウムゲル	アルコン	16H01E
マイクロリットル注射器上海	高鳩産業貿易有限公司、LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 &L
ポビドンヨウ素溶液	広東メディヘルス製薬株式会社		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
小動物耳スタッド	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
トロピカミドフェニレフリン点眼薬	参天製薬株式会社		5 mg/mL
キシラジン	シグマ	X1251-5G	5 g
ゾレチル 50	Virbac.S.A	7FRPA	チレタミン 125 mg + ゾラゼパム 125 mg