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方法論記事

嗅覚掘削作業によるマウス判定バイアスの評価

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DOI：

10.3791/63426

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2022年3月4日

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of Guelph, 2Institute of Cell Biology and Neurosciences, National Scientific and Technical Research Council-University of Buenos Aires, 3Laboratory of Experimental Animals, Faculty of Veterinary Sciences, National University of La Plata, 4Department of Animal Biosciences, University of Guelph

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、新しいマウス判断バイアスプロトコルの詳細な説明を提供します。この嗅覚掘り作業の情動状態に対する感受性の証拠も実証され、多様な研究分野にわたるその有用性が議論される。

要約

判断バイアス(JB)は、肯定的および否定的な感情/感情状態の個人が曖昧な情報を解釈する方法の違いです。この現象は長い間ヒトで観察されており、肯定的な状態の個人は曖昧さに「楽観的に」反応し、否定的な状態の人は代わりに「悲観主義」を示しています。動物の影響を評価することを目的とした研究者は、これらの差異的応答を利用して、感情状態の指標として判断バイアスを評価するためのタスクを開発しました。これらのタスクは、多様な種や研究分野でますます人気が高まっています。しかし、研究で最も広く使用されている脊椎動物であり、情動障害のモデル化に大きく依存している種である実験用マウスでは、情動状態の変化に敏感であると検証されたJBタスクは1つだけです。ここでは、この新しいマウスJBタスクの詳細な説明と、マウスの影響に対する感受性の証拠を提供します。改良はまだ必要ですが、マウスJBの評価は、マウスの福祉に関する実用的な質問と、トランスレーショナルリサーチにおける感情状態の影響に関する基本的な質問の両方に答えるための扉を開きます。

概要

感情的に変調された判断バイアス(以下JB)を測定することは、動物の感情状態を研究するための有用なツールであることが証明されています。この革新的なアプローチは、肯定的または否定的な感情状態(感情と長期的な気分)を経験している人間が情報を処理する方法の違いを確実に実証するため、人間の心理学から借用しています1,2,3。例えば、不安や抑うつを経験している人間は、中立的な表情を否定的に解釈したり、中立的な文章を脅迫的なものとして解釈するかもしれません4,5。これらのバイアスは適応値を持ち、したがって種6,7間で保存されている可能性が高い。動物の影響を評価することを目的とした研究者は、この現象を巧みに利用し、中立的または曖昧な手がかりに応答して報酬の期待が高まることとして楽観主義を運用化し、懲罰または報酬の不在に対する期待の高まりとして悲観主義を運用可能にしている8,9。したがって、実験的設定において、曖昧な刺激に対する楽観的および悲観的応答は、それぞれ肯定的および否定的な影響の指標として解釈することができる10、11。

動物の影響の他の指標と比較して、JBタスクは、感情状態の価数と強度の両方を検出できるため、特に貴重なツールとなる可能性があります10,11。JBタスクが陽性状態を検出する能力(例えば、Rygula et al.12)は、動物の影響のほとんどの指標が陰性状態の検出に限定されているため、特に有用である13。JBタスクの間、動物は通常、あいまいな合図(例えば、中間調)を提示される前に、報酬を予測する肯定的な判別的合図(例えば、高周波トーン)および罰を予測する負の判別的合図(例えば、低周波トーン)に応答するように訓練される8。曖昧な手がかりに応答して、動物が「楽観的に」肯定的な手がかりに対して訓練された応答を行う場合(報酬を期待しているかのように)、これは肯定的な判断バイアスを示します。あるいは、動物が罰を避けるために否定的な訓練された反応を示す場合、これは「悲観主義」または否定的な判断バイアスの兆候です。

ハーディングら8による動物のための最初の成功したJBタスクの開発以来、いくつかのJBタスクは、多様な研究分野にわたる幅広い種のために開発されてきた7。しかし、その人気が高まっているにもかかわらず、動物のJBタスクはしばしば労働集約的です。さらに、おそらくそれらはそれらを鼓舞した人間のタスクとは方法論的に異なるため、時にはゼロまたは直感に反する結果14を生成し、通常は小さな治療効果サイズ15しか得られません。その結果、JBタスクの開発と実装が困難な場合があります。実際、研究16,17で最も広く使用されている脊椎動物であり、情動障害のモデル化に大きく依存している種である実験用マウス18については、過去10年間の多くの試みにもかかわらず、情動状態の変化に敏感であると検証されたJBタスクは1つだけ19(Resascoらの補足資料を参照)。 要約のために)。この記事では、最近検証されたマウスJBタスクについて説明し、その生物学的に関連する設計を詳述し、この人道的なタスクをマウスの影響に関連する重要な仮説をテストするために適用する方法を強調します。全体として、このプロトコルは、マウスにおけるJBに対する関心のある任意の変数の情動効果を調査するために実装することができる。これには、ここで説明するようなカテゴリー的治療変数(薬物または疾患の影響、環境条件、遺伝的背景など)、または連続的な変数(生理学的変化、家庭のケージ行動など)との関係が含まれます。

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プロトコル

実験は、ゲルフ大学のアニマルケア委員会(AUP #3700)によって承認され、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに準拠して実施され、ARRIVE(Animal Research: In Vivo Experiments)20 の要件に従って報告されました。

1. 実験準備

  1. 実験計画 ( 表 1).
    注:この行動テストは、香りベースのGo/Go掘削タスクであり、マウスは高値または低価値の報酬を掘り起こす必要があります。長方形のアリーナ(図1)を2本の腕で、片方の腕に香りを付け、もう片方の腕に香りを付けない。以下に概説するように、マウスは、曖昧な匂い混合物を提示する前に、陽性および否定的な匂いの手がかりを区別するように訓練される。
    1. 以下のようにして、ケージをミントまたはバニラ陽性識別刺激(DS+)グループに擬似ランダムに割り当てる。
      注:このプロトコルは、バニラDS+臭気混合物に割り当てられたマウスについてのみ検証されています(詳細については、代表的な結果およびResasco et al.19 を参照してください)。ただし、DS+、DS-、およびあいまいな混合物が有効なJB評価の要件を満たしていることを確認するために、パイロットテストを強くお勧めします(ステップ4.7.3および5.3)。したがって、ここで概説する方法には、JBの評価要件を首尾よく満たすグループ(バニラDS+マウス)とそうでないグループ(ミントDS+マウス)の例を提供するために、バニラとミントDS+の両方のテストが含まれます。以前のパイロットテストでは、この種の問題を事前に特定していました。
    2. ミントDS+マウス:これらのマウスの場合、トレーニングのためのアリーナセットアップ中(下記のステップ1.4を参照)、ミント臭キューで高価値報酬を含む香りディスペンサーとポット、およびバニラ臭キューで報酬を含まないものにマークを付けます。
    3. バニラDS+マウス:これらのマウスの場合、トレーニングのためのアリーナセットアップ中(下記のステップ1.4を参照)に、バニラ臭いキューで価値の高い報酬を含む香りディスペンサーとポット、ミント臭キューで報酬を含まないものにマークを付けます。
      注: このタスクは、強化トレーニング試行と非強化テスト試行で構成されます。強化されていない試験試験では、マウスは報酬にアクセスできず(下記のステップ1.4.3を参照)、ミントとバニラの両方のDS+マウスの曖昧な臭いの手がかりは同じ1:1ミント/バニラ混合物です。
    4. 次のように、ケージを左右の香りのアームグループに擬似ランダムに割り当てます(DS+匂いグループ間での相殺)。
    5. 左:これらのマウスの場合、トレーニングとテストのためのアリーナセットアップ中(下記のステップ1.4を参照)、適切なDS+またはDS-臭気の合図で左腕にマークを付け、右腕が常に無臭であることを確認します(蒸留水のみでマークされています)。
    6. 右:これらのマウスの場合、トレーニングとテストのためのアリーナセットアップ中(下記のステップ1.4を参照)、適切なDS+またはDS-臭気の合図で右腕にマークを付け、左腕が常に無臭であることを確認します(蒸留水のみでマークされています)。
    7. 次のように、各動物にランダムに「ブラインドコード」を割り当てます。
      注:盲検化により、研究者はマウスを取り扱い、その行動をスコアリングして、動物のIDまたは治療に気付かずにままで、望ましくない主観的バイアスを避けることができます。これは、ARRIVE(Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)ガイドラインおよびその他の参考資料20に準拠するための必須のステップです。
    8. スプレッドシートにブラインドコードの列を追加し、各動物IDとそれらが割り当てられた対応する治療を含みます。
    9. 各動物に、ケージ番号や処置とは無関係の一意のコード(例えば、文字と数字の組み合わせ「A2」)をランダムに割り当てます。
      注:すべてのランダム化は、乱数ジェネレータ(Random.org など)を使用して実行する必要があります。この無作為化ステップの間、治療、ひずみなど(該当する場合)にわたってカウンターバランスをとる。これは、実験を通して治療に「盲目的」なままである研究助手によって行われます。この個人は、偏った評価を避けるために、テスト中にデータを収集してはなりません。
    10. すべてのデータ収集中に、ライブおよびビデオスコアリングのレイテンシである「盲目」の研究者に、動物の盲目コードのみで掘削および掘削期間を提供して、研究者が治療に対して盲目になるようにします。
      注:データ収集中に使用されるスプレッドシートには、動物のブラインドコードと、各試験の掘削および掘削期間に対応する待機時間のみが含まれます。実験の最後に、対応する動物IDと治療情報をスプレッドシートに追加できるため、研究者をデータ分析のために「盲検化解除」することができます。
  2. 材料の準備。
    1. 高価値食品報酬:乾燥した甘味バナナチップスを手で約0.5 cm x 0.5 cmに割る。
    2. 価値の低い食べ物の報酬:まな板とナイフを使用して、げっ歯類の固形飼料(動物の通常の食事から)を約0.125 cm3 に切ります。
      注: 高額および低額の報酬を識別するためのパイロット テストは、タスクを開始する前に実施する必要があります。
    3. ミントおよびバニラエッセンス:1mLシリンジまたはマイクロピペットを使用して、ミントおよびバニラ抽出物を標識遠心分離管に加える。抽出液を蒸留水で1:4に希釈し、数回反転させて混合する。これらを毎日行い、使用前に繰り返し反転させて、混合物が新鮮で一貫していることを確認します。
    4. 曖昧な臭い混合物:ミントとバニラのエッセンスを希釈した後、遠心分離管に等量加えます(希釈されたエッセンスの1:1混合物を作成します)。曖昧な臭い混合物に対する反応をテストする日にこれらを作り、混合物が新鮮で一貫していることを確認するために使用前に繰り返し反転させてください。
      注:適切な希釈液および中間臭気混合物を識別するためのパイロットテストは、強度がメーカー、バッチなどによって異なる可能性があるため、あいまいなプローブの有用性を保証することを強くお勧めします。複数の曖昧な手がかりが提供されている場合は、マウスを陽性、中点、陰性に近いテストの手がかりにランダムに割り当てます。詳細については、「ディスカッション」を参照してください。
    5. コットンパッド:各円形のコットンパッドを6つの等しい部分にカットします(香りディスペンサーとして使用されるティッシュカセット内に収まるようにします)。
      注:高値および低価値の食品報酬、綿パッド、および臭気混合物の量は、試験される被験者の数に依存します。各フェーズの被験者1人当たりの試行回数については表 1 を、各試験タイプで必要な資料については 表2 を参照してください。
    6. 実験領域を特定する:コロニールームまたは他の場所のベンチでトレーニングとテストを実施します。マウスが活動的である暗期に赤色光の下ですべての試験を実施する。
  3. ホームケージを掘るための事前トレーニング(実験の1週間前)。
    1. テストするケージごとに、少量のコーンコブ寝具を2つの掘削ポット(ポットの底を覆うのに十分な量)に注ぎ、埋葬時におやつがポットの中央に残るようにします。
    2. 1つのポットで、ケージ内の各マウスが1ピース(例えば、3匹のマウスのケージに対して3個のバナナチップ)を持つことができるように、コーンコブ層の上に価値の高い報酬の小片を置きます。もう1つのポットでは、ケージ内の各マウスが1個(例えば、3匹のマウスのケージの場合は3個のチャウ)を持つことができるように、コーンコブ層の上に価値の低い報酬の小片を置きます。
    3. 各鍋の御馳走の上にコーンコブの寝具をゆっくりと注ぎ、それらを覆い、鉢を3cmの高さまで満たします。
    4. 各ケージに1つの高値ポットと1つの低値ポットを同時に10分間置きます。10分後、すべてのケージからポットを取り出します。
    5. コーンコブを捨てて、鍋に残っているおやつ。動物やケージの臭いが将来の試験に影響を与えるのを防ぐために、すべてのポットを70%エタノールで徹底的に拭きます。
    6. 手順 1.3.1 ~ 1.3.5 を 1 日に 1 回、5 日間連続して繰り返します。
      注:このフェーズの目標は、正式なトレーニングの開始前に、すべてのケージメイトが御馳走を掘って食べる機会を与えることです。これはまた、食物報酬への慣れを促進します。
  4. トレーニングとテスト用にセットアップされたアリーナ。
    1. アリーナを赤信号の下の作業台に置きます。アリーナ、掘削ポット、および香りディスペンサーのすべてのコンポーネントを70%エタノールで徹底的に拭き取り、以前の試験からほこりや臭いを取り除きます。
    2. 次のようにして掘り鍋を準備します。
    3. 適切な食料報酬を「アクセスできないコンパートメント」に置きます( 図1参照)。
      注:このコンパートメントに含まれる報酬は、特定の試験でどの治療(もしあれば)が埋葬されるかによって異なります( 表2を参照)。したがって、各ポットには、2つのコンパートメントにバナナチップとチャウが1個ずつ常に含まれています。
      1. DS+ 臭気ポット: 強化試験中は、チャウ 1 枚をアクセスできないコンパートメントに置き、バナナチップ 1 枚をポットのアクセシブルな場所に埋めます。
      2. DS-臭気ポット:強化された試験中は、チャウ1個とバナナチップ1個をアクセスできないコンパートメントに置きます。鍋のアクセス可能なエリアでは、食べ物の報酬は利用できません。
      3. 無香料の鍋:強化された試験中は、バナナチップ1枚をアクセスできないコンパートメントに置き、鍋のアクセス可能な場所に1枚のチャウを埋めます。
      4. すべての強化されていないテスト試験(陽性、陰性、あいまいさ)では、チャウ1個とバナナチップ1個をアクセスできないコンパートメントに置きます。鍋のアクセス可能なエリアでは、食べ物の報酬は利用できません。
        注:このステップは、埋もれたおやつの香りがどの鍋に報われるかを明らかにするのを防ぐことです。そのため、2つのコンパートメント間のバリアは、臭気の伝達を容易にするために穿孔されています。
    4. 各鍋に少量のコーンコブ寝具を注ぎ、埋葬されたときに食べ物の報酬を中央に保ちます。適切な食物報酬( 表2参照)をコーンコブ層の上に1枚置き、コーンコブ寝具をおやつの上にゆっくりと注ぎ、それらを覆い、3cmの高さまで鍋を満たします。
    5. 1 mLのシリンジまたはマイクロピペットを使用して、適切な臭い混合物(ミント、バニラ、またはあいまいな混合物)または蒸留水( 表2参照)を0.1mL引き出し、円を描くようにコーンコブの上に直接注入します。
    6. 香りのディスペンサーを準備します。
      1. 1枚のコットンパッド片をティッシュカセットのベースに置きます。1 mLのシリンジまたはマイクロピペットを使用して、適切な臭気混合物(ミント、バニラ、またはあいまいな混合物)または蒸留水( 表2参照)を0.1mL取り出し、綿片に注入します。ティッシュカセットを蓋で覆い、香りのコットンを囲み、香りのディスペンサーを作ります。
    7. 掘り鍋を腕の端に置き、香りディスペンサーを各腕の始めに置きます。取り外し可能な「ドア」をカセットスロットの直前に挿入して、アリーナアームへの入り口をブロックし、スタートコンパートメントを作成します( 図1参照)。
      注:掘削ポット、香りディスペンサー、およびシリンジは、匂いの合図の意図しない混合を避けるために、実験を通して明確にラベル付けされ、1つの香りにのみ使用する必要があります(つまり、ミント、バニラ、無香料、および曖昧な混合物には異なる材料セットを使用してください)。

2.掘削トレーニング:5日間、1日あたり2回の陽性試験(表2)

  1. ホッパーから食物を取り除いて自宅のケージで訓練する前に、マウスを1時間高速にします。
  2. 上記のアリーナ設定手順に従って、強化されたポジティブトライアルのアリーナを設定します(ステップ1.4)。
  3. 掘削訓練の1日目に、食べ物の報酬を3cmのトウモロコシの穂軸の寝具の上に埋めるのではなく、の上に置きます。
  4. 報酬を次の4日間にわたってトウモロコシの穂軸の下に深く埋め、5日目までに3cmの寝具の底に位置するまで(すなわち、1日目:トウモロコシの穂軸の上に、2日目:トウモロコシの穂軸の非常に薄い層に埋もれ、3日目:鍋の底に半分埋もれ、4日目: 鍋の底までの道のりの4分の3を埋め、5日目:鍋の底に埋めた)。
  5. マウスを自宅のケージから空の輸送ケージに移動します。動物のブラインドコードが記載されたキューカードを輸送ケージの上に置き、実験を行う研究者が動物のIDと治療に対して盲目のままになるようにします。マウスを実験エリアに運びます。
    注:ステップ2.1および2.5は、マウスに精通した研究助手が完了する必要があります。試験中のその後のステップは、動物IDに盲目の研究者(および該当する場合は治療)によって実施されます。従来のテールハンドリングの嫌悪的な影響を避けるために、カップハンドリング(オープンハンド)またはトンネルハンドリング(紙コップまたはプラスチックトンネル付き)を使用してマウスを常に取り扱います21。
  6. 輸送ケージからアリーナのスタートコンパートメントにマウスを移動します。スタートの「ドア」を外し、すぐにプレキシガラスの蓋をアリーナの上に下ろし、5分間のトライアルタイマーを開始します。
    メモ:同じケージの複数のマウスをテストする場合は、同時に行う必要があります。しかし、同時に検査される動物の数は、利用可能な盲目の観察者の数に依存する。理想的には、研究者は一度に1匹の動物を観察して扱うでしょうが、必要に応じて1人の個人が2匹の動物を同時に観察して扱うことができます。
  7. 掘り下げるためのライブスコアレイテンシーと、両腕の報酬を食べるためのレイテンシ。
    1. 掘る待ち時間を、掘り起こしの最初の発生が観察された時刻として記録します。掘削は、前足および/または銃口でトウモロコシ穂軸の寝具を積極的に押すか操作するマウスとして記述される。
    2. 食べるまでの待ち時間を、食事の最初の発生が観察される時間として記録します。食べることは、前足でそれを保持し、幽霊に座っている間に報酬を消費するマウスとして記述されています。
  8. 試験が終了したら、プレキシガラスの蓋を持ち上げ、マウスを輸送ケージに戻します。
  9. すべてのトウモロコシの穂軸の寝具を捨て、鍋に残ったおやつ。ティッシュカセットを開き、綿片を捨てる。アリーナと掘削ポットのすべての成分を拭き取り、ディスペンサーを70%エタノールで徹底的に香り付けします。
  10. 2 回目の陽性トライアルのアリーナを設定します (ステップ 1.4)。ステップ2.6~2.9を繰り返して、陽性試験を強化します。
  11. 輸送ケージを研究助手に返却し、マウスを自宅のケージに戻せるようにします。
  12. 手順 2.1 ~ 2.11 を 5 日間連続して繰り返します。

3. 差別研修:10日間、1日4回試行

  1. ステップ 1.4 の手順に従って、肯定的または否定的な試行 ( 表 2 を参照) のアリーナをセットアップします。
  2. 表2に概説されている順序に従って、1日に2回の陽性試験と 2 回の陰性試験を実施する(すなわち、1~5日目の陽性試験と陰性試験を交互に行い、6~10日目に擬似ランダム試験を行う)。
  3. 各トレーニング日の初めに手順 2.1 の指示に従い、手順 2.5 ~ 2.10 に従います。マウスが合計4回の試験を受けるまで繰り返す。
  4. 輸送ケージを研究助手に返却し、マウスを自宅のケージに戻せるようにします。
  5. 手順 3.1 ~ 3.4 を 1 日に 1 回、合計 10 日間繰り返します (つまり、2 日間の週末で区切られた 2 つの連続した 5 日間の稼働週)。

4. テスト

注:試験期間は3〜5日(各マウスが学習基準を満たすのにかかる時間によって異なります)、陽性および陰性の試験が実施されるセッションでは1日あたり5回の試行、あいまいな試験が実施される場合は1日あたり3回の試行です。

  1. ホッパーから食べ物を取り除いて、自宅のケージでトレーニング/テストする前に、マウスを1時間高速にします。
  2. ステップ 1.4 のアリーナ設定手順に従い、ステップ 2.5 ~ 2.10 の強化試験手順に従って、1 つの陽性試行と 1 つの陰性試行をランダム化された順序で実行します (表 1 を参照)。
  3. ビデオ録画された強化されていないテスト試行を 1 回実行します。
    注: 強化されていないトライアルは、報酬が置かれている場所を除き、強化トライアルと同じです。したがって、強化されていない試験では、高値と低価値の報酬の1枚が、香りのポットと香りのないポットの両方について、アクセスできないコンパートメントに配置されます。
    1. 学習基準が満たされるまで、各マウスに対して毎日1回の陽性または陰性テスト試行を実施します(最大4日間、学習基準はステップ4.7.3で説明されています)。陽性と陰性のテスト試験が、日間で交互に実施されていることを確認する(例:1日目:陽性テスト、2日目:陰性テスト、3日目:陽性テストなど)。
    2. ステップ 1.4 のアリーナのセットアップ手順に従います。
    3. 輸送ケージからアリーナのスタートコンパートメントにマウスを移動します。腕の端にある両方のポットが見えるように三脚にビデオカメラをセットし、録画を開始します。動物のブラインドコードと治験の種類(陽性テストまたは陰性テスト)がビデオに記録されていることを確認してください(ビデオスコアリング中の参照用)。
    4. スタート「ドア」を取り外し、すぐにプレキシガラスの蓋をアリーナの上に下ろし、2分間のトライアルタイマーを開始します。
    5. トライアルが終了したら、録画を停止し、カメラを横に動かし、プレキシガラスの蓋を持ち上げ、マウスを輸送ケージに戻します。
    6. すべてのトウモロコシの穂軸の寝具を捨て、鍋に残ったおやつ。ティッシュカセットを開き、綿片を捨てる。アリーナ、掘削ポット、香りディスペンサーのすべての成分を70%エタノールで徹底的に拭きます。
  4. ステップ 1.4 のアリーナ設定手順に従い、ステップ 2.5 ~ 2.10 の強化試験手順に従って、1 つの陽性試行と 1 つの陰性試行をランダム化された順序で実行します (表 1 を参照)。
  5. 輸送ケージを研究助手に返却し、マウスを自宅のケージに戻せるようにします。
  6. すべてのマウスが毎日5回のトライアルを完了したら、ビデオスコアリングのためにカメラのメモリカードからコンピュータにビデオを転送します。
  7. テスト当日に陽性および陰性のテストトライアルビデオにスコアを付け、マウスが学習基準を満たしているかどうかを評価します。学習基準を満たす動物は翌日にあいまいなテストを受けるため、同日のビデオスコアリングを確保してください。
    1. イベント記録ソフトウェアまたはストップウォッチを使用して、治療に盲目の研究者に、陽性および陰性のテスト試験の最初の1分間に各ポットを掘り起こし、掘削する各マウスの潜伏時間を記録させます。
    2. 掘る待ち時間を、掘り起こしの最初の発生が観察された時刻として記録します。掘削は、前足および/または銃口でトウモロコシ穂軸の寝具を積極的に押すか操作するマウスとして記述される。マウスが掘削に費やした合計時間として掘削時間を記録します。
    3. 各マウスの陽性(DS+)試験と陰性(DS-)試験の間で香りのついた腕の掘削期間を比較し、動物がタスクを識別できるかどうかを判断します。DS+ の香り付きアームでの掘削時間が、テストの最初の 1 分間の DS- 香り付きアームの掘削時間が 2 倍以上である場合 (DS+ の掘削時間は 3 秒以上)、満たすべき学習基準を検討してください。
  8. マウスが学習基準を満たすまで、ステップ4.1-4.7を毎日繰り返します。
    1. 4日目までに基準を満たしていない個人を曖昧な試験(したがって、判断バイアス評価)から除外する。
  9. 学習基準を満たしたマウスについて、曖昧な匂い混合物に対する応答を試験する。
    1. ホッパーから食べ物を取り除いて、自宅のケージでトレーニング/テストする前に、マウスを1時間高速にします。
    2. ステップ 1.4 のアリーナ設定手順とステップ 2.5 ~ 2.10 の強化トライアルの指示に従って、1 つの陽性および 1 つのネガティブ強化トライアルをランダム化された順序で実行します。
    3. 曖昧な臭気混合物を用いて、ステップ4.3で説明したように、ビデオ録画された非強化試験試験を1回実施する( 表2参照)。
  10. 曖昧な裁判ビデオにスコアを付けて、判断の偏りを評価します。
    1. イベント記録ソフトウェアまたはストップウォッチを使用して、動物IDと治療に盲目の研究者に、試験試験の最初の1分と2分間に各ポットで掘る各マウスの潜伏時間(ステップ4.7.2を参照)を記録してもらいます。

5. データ解析

注:必要な正確な分析は、実験計画の詳細によって異なります。ここでは一般的な概要を概説しますが、研究者は動物JB実験の分析を計画するときはガイギャックス22 を参照し、サンプルサイズを選択するときはGakillとGarner23 を参照することを強くお勧めします(必要な分析は 先験的な 検出力分析には複雑すぎることが多いため)。

  1. 「盲検でない」研究者は、盲検コードごとに対応する動物IDおよび治療情報(例えば、濃縮または従来のハウジング;薬物またはプラセボなど)をスプレッドシートに追加する。結果のスプレッドシートに、学習基準 (陽性、陰性、およびあいまいなテスト試行) を満たした各動物について、香りのついた腕を掘る待ち時間を示す 3 つの行が含まれていることを確認します。
  2. 優先統計ソフトウェアを使用して、反復測定一般化線型混合モデルを実行します。ここでは、結果変数は掘り下げる待ち時間になります。モデルに、固定効果として治療(または対象の連続変数)、試行タイプ、および治療 x 試行タイプ交互作用が含まれていることを確認します。マウス ID (処理内でネスト) をランダムな効果として含めます。モデルに含まれる追加の項は、適用される実験計画によって異なります。
    注:マウスが集団飼育され(この社会種24に適切であるように)、ケージの仲間が試験される場合、治療中にネストされたケージ(存在する場合)はランダム効果としてモデルに含まれなければならない(そしてマウスIDはその後ケージ内にネストされなければならない)。
  3. 各試行タイプでレイテンシの最小二乗平均をプロットして、提示されたあいまいな手がかりが中間として解釈されたことを確認します(つまり、あいまいな試行のレイテンシ最小二乗平均の推定値は、正と負のレイテンシの中間点にある必要があります)。マウス JB は、この要件が満たされている場合にのみ評価します。
  4. Treatment x Trial Type 相互作用を調査して、マウスが影響変調 JB を表示するかどうかを決定することにより、あいまいな試行を掘り下げる潜伏時間に対する治療の単純な効果 (または関心のある連続変数) を評価します。

figure-protocol-1
図1:実験装置の図。 JB装置は、2つのアームを有する長方形のアリーナを含む。各アームには、開始位置に香りディスペンサーがあり、端部に配置された掘削ポットが含まれています。Resasco et al.19からエルゼビアの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

位相：実験計画
すべての高価値報酬バナナチップス
低価値報酬げっ歯類チョウ
DS+ミントまたはバニラ(カウンターバランス)
ティッカーミントまたはバニラ(カウンターバランス)
掘削トレーニング掘削トレーニングスケジュール5日間:2ポストライアル/日
掘削試験期間5分
差別研修差別研修スケジュール10日間:4トライアル/日
掘削試験順序1-5日目:4試行/日
トライアル1:ポス
トライアル2:ネグ
トライアル3:ポス
トライアル4:ネグ
6~10日目:4回試行/日*
差別裁判期間5分
テスティングテストスケジュール3-5日(学習基準を満たす時間に依存)
5 トライアル/日
テストフェーズの順序試練1と2:ポスまたはネグ**
トライアル 3: テストトライアル
試練4と5:ポスまたはネグ**
試験試用期間2分
*試験は擬似無作為化されていたため、マウスは常に1日に2つのPos試験と2つのNeg試験を行った。
** 試験は擬似ランダム化されたため、マウスは常に試験試験の前後に1つのPos試験と1つのNeg試験を行った。

表1:実験計画の概要とトレーニングとテストのスケジュール。 実験計画の詳細に加えて、掘削トレーニング、差別トレーニング、およびテストフェーズの1日あたりの試行回数と順序。Resasco et al.19からエルゼビアの許可を得て転載。

トライアルの詳細
位相トライアルタイプ香りのアーム無香料の腕
オドインク埋もれた報酬アクセスできない報酬オドインク埋もれた報酬アクセスできない報酬
掘り起こしと差別のトレーニングポストレーニングDS+バナナチャウチャウ水チャウチャウバナナ
ネグトレーニングティッカー報酬なしバナナ+チャウ水チャウチャウバナナ
テスティングポステストDS+報酬なしバナナ+チャウ水報酬なしバナナ+チャウ
ネグテストティッカー報酬なしバナナ+チャウ水報酬なしバナナ+チャウ
あいまいなテストミント/
バニラ混合物		報酬なしバナナ+チャウ水報酬なしバナナ+チャウ
学習基準マウスは、DS+ポット(ポステスト)でDS-ポット(ネグテスト)の2倍の長さで掘り、最低3秒間掘る必要があります。

表 2.トライアルの詳細の概要。 掘削トレーニング、差別トレーニング、およびテストフェーズの各試行タイプで提示される臭気の手がかりと報酬。DS(+): 正の判別刺激, DS(-): 負の判別刺激, Pos: 正, ネグ: 負.Resasco et al.19からエルゼビアの許可を得て転載。展開された表については、元の記事の補足表 S2 を参照してください。

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結果

ここで提示された結果は、Resascoら19の実験1からの関連する知見を反映している。この実験の被験者は、18匹の雌性C57BL/6NCrl(「C57」)および18匹のBalb/cAnNCrl(「Balb」)マウスであった。動物は3〜4週齢で施設に到着し、混合株カルテット25において、環境的に濃縮されたまたは従来の収容処置(それぞれEHまたはCH)に無作為に割り付けられた。各ケージには、1匹のC57と1匹のBalbが含まれ、さらに別の実験で使用された2匹のDBA/2NCrlマウスが含まれていた。ここで、環境濃縮を伴うこの社会種の集団飼育を可能にした雌マウスの使用は、雄マウス26において起こり得る攻撃性および資源保護の高まりを回避しつつ(ただし、この課題は非富化雄ヌードマウス19においても適用されていることに留意されたい)。CHマウスは、トウモロコシのコブ寝具、2種類のネスティング材料(しわの寄った紙片および綿の巣)を備えたオープントップの透明なポリ...

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ディスカッション

ここで概説した香りベースの掘削プロトコルと結果は、マウスの感情状態の変化を検出するこの新しいJBタスクの能力を実証しています。したがって、このタスクは、多様な研究分野にとって貴重なツールとなります。他のJBタスクと同様に、動物の影響を評価するには、動物が最初に手がかりを区別することを学び(ステップ4.7.3)、あいまいな刺激が中間として解釈されること(ステップ5.3)が重要です。単純ではあるが、これらの要件を満たすことは、特にマウスJBタスクを開発し実装するための15以上の過去の試みが失敗した実験室マウスでは、困難な場合がある19。ここでは、複数のコンポーネントがこれらの技術的基準を満たす上で重要な役割を果たし、タスクの成功と有用性に貢献しました。

第一に、このタスクの動物行動学的設計は、判別的手がかりと必要な応答の両方が生物学的に関連性があったため、識別学習の成功を促進した:マウスは印象的な嗅覚能力を有し、匂い刺激33を提示されたときに迅速な学習とかなりの記憶スパンを可能にし、そして彼...

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開示事項

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者らは、このプロトコルが基づいているReseascoら19 検証作業への貢献について、Miguel Ayala、Lindsey Kitchenham、Michelle Edwards博士、Sylvia Lam、Stephanie Dejardinに感謝する。また、マウスと素晴らしい動物ケア技術者、ミカエラ・ランドールとミシェル・シープラックにも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
無水エタノール業務用アルコールP016EAAN蒸留水で70%に希釈し、洗浄用
遠心分離管フィッシャー5539515mLチューブ ここでエッセンスを希釈するために使用されます。ただし、サンプルサイズに必要な総量に基づいてサイズを選択する場合があります
Cheerios (オリジナル)CheeriosN/A市販されています。トウモロコシの穂軸の寝具を取り扱うための別館のケージに入るように動物を訓練するための報酬として使用されます
Envigo7092Teklad 1/8 トウモロコシの穂軸の寝具は、鉢や動物のケージを掘る際に使用されます
綿パッドEquate N/A市販されています。香りの分配のためのティッシュカセットの中に合うように実験室で変更
Digging potsRubbermaidN/A市販のもの。容器は、実験室の装置に合うように改造されました
乾燥、甘くしたバナナチップスストックとバレルN / A市販。JBタスクでの高価値報酬
JB装置N / A装置は研究室で作られました
JWatcherイベント記録ソフトウェア動物行動研究所、マッコーリー大学バージョン1.0オンラインで無料でダウンロードできます。JBタスク中の掘削行動をスコアリングするために使用されます
ミント抽出物FleiborN / A商業的に「メンタ(Solución)".識別刺激臭
エンビゴ2914クラッドグローバル14%タンパク質げっ歯類維持ダイエット。JBタスクとホームケージでの定期的な食事での低価値報酬
統計ソフトウェアSASバージョン9.4同等のソフトウェアプログラム(Rなど)も適切です
バニラ抽出物Fleibor市販の「Vainilla(Solución)".識別刺激臭
カメラソニーDCR-SX22ソニーハンディカム。
ネズミダイエットテSAS他のビデオ

参考文献

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