下垂体は、体の内分泌系の主要な調節因子である。この記事では、生物学的および機能がほとんど理解されていない腺の幹細胞集団を研究するための新しい3D in vitro モデルとして、マウス下垂体からのオルガノイドの開発を説明する。
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方法論記事
下垂体幹細胞生物学を探るための In Vitro モデルとしてのマウス下垂体からのオルガノイドの開発
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
下垂体は、身体の成長、代謝、性的成熟、生殖、ストレス反応などの重要な生理学的プロセスを調節するマスター内分泌腺です。10年以上前、幹細胞は下垂体で同定されました。しかしながら、トランスジェニック in vivo アプローチの適用にもかかわらず、それらの表現型、生物学、および役割は不明のままである。この謎に取り組むために、下垂体幹細胞生物学を深く解明するために、新しく革新的なオルガノイド in vitro モデルが開発されています。オルガノイドは、定義された培養条件下で、組織の(上皮)幹細胞から自己発達し、それらの幹細胞およびその組織の複数の特徴を再現する3D細胞構造を表す。ここでは、マウスの下垂体由来オルガノイドが腺の幹細胞から発達し、 そのin vivo 表現型および機能的特徴を忠実に再現することが示されている。とりわけ、それらは、遺伝子導入的に加えられた局所的損傷に応答して生じる in vivo としての幹細胞の活性化状態を再現する。オルガノイドは、ステムネス表現型を堅牢に保持しながら、長期的に拡張可能である。この新しい研究モデルは、新生児の成熟から加齢に伴う退色、および健康な腺から罹患した腺に至るまで、下垂体リモデリングの重要な条件における幹細胞の表現型および挙動を解読するために非常に貴重である。ここでは、マウス下垂体由来オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルが提示され、これは下垂体幹細胞のまだ謎めいた世界に飛び込むための強力なツールを提供する。
概要
下垂体は、脳の基部に位置する小さな内分泌腺であり、視床下部に接続されている。腺は、末梢および中枢(視床下部)入力を統合して、調整された調整されたホルモン放出を生成し、それによって下流の標的内分泌器官(副腎および生殖腺など)を調節して、適切なタイミングで適切なホルモンを産生する。下垂体は内分泌系の主要な調節因子であり、したがって正当にマスター腺1と呼ばれる。
マウスの下垂体は、3つの葉(図1)、すなわち、前葉(AL)、中間葉(IL)、および後葉(PL)からなる。主要な内分泌ALは、5つのホルモン細胞型を含みます, 成長ホルモンを産生するソマトトロープを含みます (GH);プロラクチン(PRL)を生成するラクトトロープ;副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)を分泌するコルチコトロペ;甲状腺刺激ホルモン(TSH)産生に関与する甲状腺綱;黄体形成ホルモン(LH)と卵胞刺激ホルモン(FSH)を作る性腺刺激薬。PLは、ホルモンオキシトシンおよびバソプレシン(抗利尿ホルモン)が貯蔵されている視床下部からの軸索突起からなる。ILはALとPLの間に位置し、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)を産生するメラノトロープを収容する。ヒト下垂体では、ILは発生中に退行し、メラノトロープはAL1内に広がる。
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プロトコル
本研究の動物実験は、ルーヴェン大学動物実験倫理委員会(P153/2018)により承認された。すべてのマウスは、標準化された条件(23±1.5°Cの一定温度、相対湿度40%〜60%、および12時間の昼夜サイクル)で大学の動物施設で飼育され、水と食物を 自由に利用できました。
1. マウス
- C57BL/6Jマウスなど、若年成人年齢(8~12週齢)の市販のマウス系統を使用してください。一般に、2〜3匹のマウスは、プロトコールのために十分な数のAL細胞を提供する。
2. マウスALの単離と解離
注:培地A、B、およびCは、予め19,20個用意されている。組成を表2に示す。
- マウスALの単離
- CO2窒息によりマウスを安楽死させ、続いて断頭した(図2A)。マウスの頭を脱イオン水で洗浄して血液を除去し、70%EtOHを噴霧して滅菌環境を生成します。
- 滅菌手術器具を用いて、耳の間....
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結果
ALの単離および解離後、得られた単一細胞をECMに播種し、PitOM中で増殖させる(図1、表1)。図3Aは、播種時(Day 0)の細胞培養および密度を示す。いくつかの小さな破片が存在するかもしれないが(図3A、白い矢印)、通過時に消える。播種後14日目に、AL由来オルガノイドは完全に発達する(図3A)。オルガノイドは嚢胞性形態を示し、内腔を囲む上皮層を有する。この段階で、オルガノイドは500μmの直径に達し、通過されなければならない。図3Bは、解離したオルガノイド断片の再播種後の指示時間における継代後のAL由来オルガノイド培養物を示す。
時折、1つ以上の緻密な構造がオルガノイド培養物に現れることがある(図3A
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ディスカッション
AL由来オルガノイドは、ここに記載されるように、下垂体幹細胞をインビトロで研究するための強力な研究モデルを表す。現在、このオルガノイドアプローチは、初代下垂体幹細胞を確実かつ堅牢に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールである。胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する下垂体オルガノイドモデルが以前に報告されており、これは下垂体胚性器官形成を密接に反復する23;しかしながら、下垂体発生の研究または下垂体疾患のモデル化23,24,25にとって非常に有用であるが、ESC/iPSCから始まる報告されたプロトコルは、ここで説明されているプロトコルと比較して非常に時間がかかり、得られたオルガノイドも拡張可能ではない。
下垂体幹細胞オルガノイドの培養の成功は、プロトコールにおけるいくつかの重要なステップに依存する。.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この研究は、ルーヴェン工科大学とフランダース科学研究基金(FWO)からの助成金によって支援されました。E.L. (11A3320N) および C.N. (1S14218N) は、FWO/FWO-SB の博士号フェローシップによってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-メルカプトエタノール | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48 ウェルプレート、TC 処理、個別包装 | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (細胞培養グレード) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50倍)、ビタミンAを差し引いた | Gibco | 12587010 | |
| ベースモールド | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| カセット、Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| セルストレーナー、40 & マイクロ;mメッシュ、使い捨て | ファルコン | 352340 | |
| レラ毒素ビブリオからコレラ | グマアルドリッチ | C8052 | |
| シ膵臓からのデオキシリボヌクレアーゼI | シグマアルドリッチ | D5025D | |
| グルコース | メルク | 108342 | |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | シグマアルドリッチ | D2650DMEM | |
| 、粉末、高グルコース | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | ||
| ウシ胎児血清 (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning 15505739 | ||
| Mr. Frosty 冷凍容器 | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-アセチル-L-システイン | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G ナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| フェノールレッド | メルク | 107241 | |
| 塩化カリウム (KCl) | メルク | 104936 | |
| 組換えヒト EGF タンパク質、CF | R&D systems | 236-EG | |
| 組換えヒト FGF 基本/FGF2/bFGF (157 aa) タンパク質 | R&Dシステム | 234-FSE | |
| 組換え人間FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| 組換え人間IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| 換えヒトIL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| 組換えヒトNoggin | Peprotech | 120-10C | |
| 組換えヒトR-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| 組換えヒト/マウス FGF-8b | ペプロテック | 100-25 | |
| 組換えマウス ソニックヘッジホッグ/SHH (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy マイクロキット | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | BDH | 102415K | |
| ナトリウム 二水素リン酸 1-水和物 | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| ナトリウム炭酸水素塩 (NaHCO3) | メルク | 106329 | |
| ビン酸ナトリウム (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP、0.22 & マイクロ;m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP 滅菌遠心分離管トップフィルターユニット, 0.22 μm | ミリポア | SCGP00525 | |
| 滅菌水 | フレゼニウス B230531 | ||
| ストレプトマイシン硫酸塩 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | ThermoFisher Scientific | 12605028 | |
| Thicinmax(大豆)由来トリプシン阻害剤 | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| トリプシン溶液 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
参考文献
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen,....
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再版と許可
