Method Article

同時光遺伝学的変調と電気的神経記録のためのオプトロードアレイ

DOI:

10.3791/63460

⸱

September 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、光伝達用光ファイバと神経記録用電極アレイを用いたオプトロードシステムの製造方法について紹介する。チャネルロドプシン-2を発現するトランスジェニックマウスを用いた インビボ 実験は、同時光遺伝学的刺激および電気生理学的記録のためのシステムの実現可能性を示す。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去10年間、光遺伝学は、選択的神経調節またはモニタリングの独自の能力のために、神経シグナル伝達の調査に不可欠なツールとなっています。特定のタイプのニューロン細胞をオプシンタンパク質を発現するように遺伝子改変することができるので、オプトジェネティクスは、選択されたニューロンの光刺激または阻害を可能にする。光遺伝学のための光学系にはいくつかの技術的進歩がありました。最近、光送達のための光導波路と電気生理学的記録を組み合わせて、光遺伝学的刺激または阻害に対する神経応答を同時にモニターすることが提案されている。本研究では、マルチチャネル電極を埋め込んだ埋め込み型オプトロードアレイ(2x2光ファイバ)を開発しました。

光源として発光ダイオード(LED)を用い、微細加工したマイクロレンズアレイを集積し、光ファイバの先端に十分な光パワーを与えた。オプトロードアレイシステムは、使い捨て部品と再利用可能な部分で構成されています。使い捨て部品には光ファイバと電極があり、再利用可能な部分には光制御と神経信号処理用のLEDと電子回路があります。移植可能なオプトロードアレイシステムの新規設計は、オプトロド移植手術、光遺伝学的光刺激、および電気生理学的神経記録の手順に加えて、添付のビデオで紹介されている。 in vivo 実験の結果は、マウスの海馬興奮性ニューロンからの光刺激によって誘発される時間ロックされた神経スパイクを首尾よく示した。

Introduction

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神経活動の記録と制御は、脳がニューラルネットワークや細胞レベルでどのように機能するかを理解するために不可欠です。従来の電気生理学的記録方法は、マイクロピペットを用いたパッチクランプ1,2,3,4およびマイクロニューラル電極5,6,7,8を用いた細胞外記録を含む。神経調節法として、電気刺激は、神経細胞の直接的または間接的な脱分極を介して焦点脳領域を直接刺激するために頻繁に使用されてきた。しかし、電気的方法は、電流があらゆる方向に広がるため、記録または刺激のための神経細胞型を区別することができない。

新興技術として、光遺伝学は、神経系がどのように機能するかを理解する上で新しい時代を先導しました 9,10,11,12,13,14,15,16.

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Protocol

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動物の世話と外科的処置は、梨花女子大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました(番号20-029)。

1. オプトロードアレイの作製(図1、図2)

  1. マイクロレンズアレイに光ファイバを取り付けます。
    1. 光ファイバのパッシベーションコーティングを除去し、精密光ファイバクリーバーを用いて長さ5mmの小片に切断する。
    2. 光ファイバを透明なUVレジンに浸し、マイクロレンズアレイ上に光ファイバを配置します。
    3. UVランプを用いて樹脂を硬化させる。
    4. エポキシを使用してマイクロレンズアレイを3Dプリントされたハウジングに取り付けます。
  2. パーフルオロアルコキシ(PFA)コーティングされたタングステン線を整列させます。
    1. 長さ30mmのPFAタングステン線4本と銀線1本を5ピン、1.27mmピッチのメスコネクタにはんだ付けします。参照電極として銀線を使用してください。
    2. 1.27 mmピッチのメスコネクタをヘッドステージプリアンプに接続します。
    3. タングステン....

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Results

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オプトロード系は、標的ニューロンを活性化するのに十分な光力を提供するために首尾よく作製される。タングステン電極の微細位置合わせは、孔を介して微細加工されたシリコンを介して達成される。測定された光強度は、50mAの電流を印加したときの光ファイバ先端で3.6mW/mm2 です。マイクロレンズは光効率を3.13dB向上させた。光結合を強化するマイクロレンズアレイのために、印加電流は、マイクロレンズアレイシステムなしで同じ光強度を達成するために必要な電流の約半分である。LEDはより多くの電流でより多くの熱を発生するので、デバイスの熱を下げるためにマイクロレンズアレイを使用することは明らかに有利である。4つの電極の平均インピーダンスは1kHzの周波数で71.39kΩであり、活動電位の検出には十分低い。さらに、オプトロードアレイは、使い捨ておよび再利用可能な部品で構成され、コストを削減し、移植の総重量を最小限に抑えます。使い捨て部品の重量は約0.58gです。

CaMKIIα::ChR2マウスを用いてChR2発現ニューロンを直接刺激し、

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Discussion

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光遺伝学的刺激と電気生理学的記録を同時に行うためのシステムの実現可能性を検証した(図6)。光刺激中の大きなスパイクは、光刺激と同時に発生する光電アーチファクトです(図6A)。これは、赤色の破線の長方形の波形のズーム表示で明らかです(図6A)。図6Aに示すように、記録された波形から光電気アーチファクトが明確に選別され、海馬信号経路の光遺伝学刺激によって誘導される神経細胞応答が明確に同定された。図6B、Cはスパイクの数を示し、刺激効果を明瞭に示す。図6Aは、図6B、Cのヒストグラムを得るために用いられる波形の1つであり、記録結果は8回の繰り返し記録セッションから.......

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Disclosures

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著者らは、開示する利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は、韓国国立研究財団(NRF)を通じたConvergent Technology R&D Program for Human Augmentationの支援を受け、科学情報化部(NRF-2019M3C1B8090805)が資金提供し、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(No. 2019R1A2C1088909)の支援を受けました。韓国大田(テジョン)のKAIST生物科学科にあるイ・スンヒ氏の研究室には、トランスジェニックマウスを提供してくださったことに感謝します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5ピンコネクタNW3HD127K1.27 mm (.050") ピッチ
BovieFine Science Tools(F.S.T)18010-00高温焼灼キット
データ収集ソフトウェアIntan Technologies, LLCUSB インターフェースボードソフトウェアRHD USB インターフェースボードと連携
DentalCement Lang Dental Manufacturing Company, Inc.1223CLRジェット義歯修理パッケージでジェット液と粉末を使用
マニピュレーターアームStoelting Co.51904/51906左、右各デジタルマニピュレーターアーム、3軸、アドオン
ゲルフォームCutanplast標準(70 * 50 * 10 mm)止血効果のある滅菌再吸収性ゼラチンスポンジ
Headstage PreamplifierIntan Technologies, LLCRHD 16チャンネルレコーディング Headstages
Heating PadStoelting Co.53800RStoelting げっ歯類ウォーマー X1 ラット加熱パッド
付き LEDOSLONGB CS8PM1.13λ typ. 470 nm, 視野角 80 °C, 順方向電圧 2.85 V
MATLABMathWorks, Inc.R2019a
マイクロクランプSURGIWAY12-1002-04ストレートタイプ Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
光ファイバーThorlabs, Inc.FT200UMT0.39 NA、Ø 200 µmの中心のマルチモード光ファイバー、300のための高い OH - 1200 nm
PFA上塗を施してあるタングステンワイヤーA-Mシステム注文された棒のタイプ、およびOslash; 101.6 μm (.004")
フォトダイオードThorlabsS121C
パワーメーターThorlabs Inc.PM100D
精密クリーバーFITELS326ファイバースライサーツール
プリズムGraphPad5.01バージョン
メスフェザー™#20メスの刃、長さ 100mm メス ハンドル
ネジNASA 韓国ステンレス鋼直径: 1.2 mm、長さ: 3 mm
銀線ニラコ コーポレーションAG-401265Ø 200 µm
Stereotaxic FxrameStoelting Co.51500Dデジタル新標準定位固定装置、ラットおよびマウス
縫合ETHICONW9106縫合糸サイズ:4-0、長さ:75 cm、線径:4-0
セリンユニリーバPLCオリジナル100%純粋なワセリン
Wave_ClusN/AN/A
デジタル #C3314 糸ワ https://github.com/csn-le/wave_clus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86(2016).
  2. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp r....

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