ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

サマリー

ここでは、hSOD1^G93Aラットモデルにおける筋萎縮性側索硬化症の病態生理に関する研究のために、細胞内^Ca2+のタイムラプスビデオイメージングのために、ラット皮質からグリア細胞、アストロサイト、およびミクログリアの初代培養を調製する方法に関するプロトコルを紹介します。

要約

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットの皮質からグリア細胞、星状細胞、およびミクログリアの初代培養物を調製する方法と、ラットhSOD1^G93A モデルにおける筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学を研究する目的でこれらの細胞を使用する方法を示しています。まず、生後ラット皮質から星状細胞とミクログリアを単離して培養する方法を示し、次に、アストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)マーカーとイオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)ミクログリアマーカーを使用した免疫細胞化学によって、これらの培養物の純度を特徴付けて試験する方法を示します。次の段階では、培養細胞の色素ローディング(カルシウム感受性Fluo 4-AM)の方法と、生細胞のビデオイメージング実験における^Ca2+ 変化の記録について説明します。

ビデオ録画の例は、(1)ALS患者から単離された免疫グロブリンG(IgG)に急性曝露された培養アストロサイトの^Ca2+イメージングの症例で構成され、同じ実験で実証されたATPに対する応答と比較して特徴的かつ特異的な応答を示します。実施例はまた、非トランスジェニック対照と比較して、hSOD1^G93A星状細胞におけるALS IgGによって誘発される細胞内カルシウム濃度のより顕著な一過性上昇を示しています。(2)小胞体^Ca2+ ATPaseの非競合阻害剤であるタプシガルギン(Thg)によるカルシウム貯蔵の枯渇中の培養アストロサイトのCa2+イメージング、続いて記録溶液中のカルシウムの添加によって誘発される貯蔵操作によるカルシウム侵入、これはhSOD1^G93Aと非トランスジェニック星状細胞における^Ca2+貯蔵操作の違いを実証する。(3)培養ミクログリアの^Ca2+イメージングは、主にALS IgGに対する応答の欠如を示し、一方、ATP適用は^Ca2+変化を誘発した。この論文はまた、重要な細胞密度と培養物の純度、^Ca2+色素の正しい濃度の選択、および色素ローディング技術に関して考えられる警告と注意を強調しています。

概要

細胞培養技術は、健康と病気における細胞神経生理学の多様な分野で多くの進歩をもたらしました。特に、実験動物の神経組織から新たに単離された初代細胞培養により、実験者はさまざまな生化学的培地や生理学的設定での多様な細胞の挙動を綿密に研究することができます。^Ca2+感受性色素などのさまざまな蛍光生理学的指標をタイムラプスビデオ顕微鏡と組み合わせて使用 すると、細胞の生物物理学的および生化学的プロセスをリアルタイムでよりよく理解できます。

ALSは、上位および下部の運動ニューロンに影響を与える壊滅的な神経変性疾患です¹。この病気は家族型の複雑な病因を持っていますが、ほとんどが散発的な型です(症例の90%)²。非細胞自律機構がALS病態生理に寄与することはよく知られており、主にグリア細胞の本質的な役割に起因しています³。ALSはまた、炎症の体液性および細胞性因子の関与を伴う神経炎症性疾患としてよく特徴付けられる。

免疫グロブリンGは、ALSやその他の神経変性疾患の分子マーカーとして広く使用されています。このマーカーの血清レベルを研究することは、疾患における神経炎症の存在および病期を示すことができる

プロトコル

すべての実験は、科学的目的のための動物の保護に関するEU指令に従い、ベオグラード大学生物学部の倫理委員会(承認番号EK-BF-2016/08)の許可を得て実施されました。患者材料(IgGの血清)については、ヒトを対象とした実験については、世界医師会倫理綱領(ヘルシンキ宣言)に従って、患者の同意を得た日常的な臨床検査のために収集されました。プロトコルは、セルビア臨床センターの倫理委員会によって承認されました(No.850/6)。

1. 初代細胞培養の準備

1. 脳組織の分離
   注意: 分離は、氷冷溶液を使用して、氷上で実行する必要があります。
   1. 初代新生児細胞培養には、生後1〜3日の新生児の子犬を使用します³³。
      注:ここで提示された研究では、Sprague Dawley hSOD1^G93A および非トランスジェニックラットが使用されました。ジェノタイピングのために、ラットテールを後のDNA抽出およびPCRに使用した。
   2. 子犬の頭に70%エタノールを振りかけ、ハサミを使ってすぐに断頭します。
   3. 頭蓋骨を露出させるために小さな角度のはさみを使用して皮膚を切り開きます。 大孔 から軌道に向かって切り込みを入れて頭蓋骨を開きます。次に、垂直な正中線カットを行います。頭蓋骨から脳を取り出し、....

結果

培養中の異なるグリア細胞タイプの特性評価
実験用の星状細胞を作製するのに通常15〜21日かかりますが、ミクログリア細胞は成長するのに10〜15日かかります。培養物の細胞純度を評価するために免疫染色を行った。 図1 は、それぞれの培養における星状細胞マーカーGFAPおよびミクログリアマーカーIba1の二重標識の発現を示す。

カルシウムイメージングは、健康な星状細胞と病気の星状細胞の細胞生理機能の違いを明らかにすることが知られています。以前、野生型アストロサイトでは、ALS IgGが細胞内外のプールをサイトゾル⁸に動員することにより、細胞^Ca2+に影響を与えることを実証しました。以下のプロトコルは、hSOD1^G93Aのカルシウム過渡現象と、患者からのALS IgGサンプルに急性曝露された非トランスジェニック培養アストロサイトとの間に違いがあるかどうかを決定しました。Fluo4-AMを負荷したアスト.......

ディスカッション

この論文では、ラットhSOD1^G93A モデルにおけるALSなどの細胞(病態)生理学のさまざまな側面を研究するための迅速で「予算内」のツールとして初代細胞培養の方法を紹介します。したがって、この技術は、より高い組織レベル(すなわち、組織スライスまたは生きた動物)で外挿し、さらに調査することができる単一細胞レベルでの研究に適しています。ただし、技術としての細胞培養にはいくつかの注意点があります。氷上で脳組織の分離と細胞の解離を行い、これらの段階とその後の分離と準備を可能な限り短い時間で実行することが最も重要です。汚染は常に存在するハードルであり、十分に滅菌された機器を使用し、層流フード³⁷内で組織解離を行う際に特に注意を払うことによって克服することができる。細胞の正しい密度を播種することも重要です。播種された細胞の数が所望の数より少ない場合、これは皿内での細胞増殖および増殖を支持しないであろう。しかし、細胞が密度が高すぎると、増殖培地中の栄養素をめぐって細胞間で競争が起こり、したがって細胞死が増加します。これが、少なくとも出発組織と解離量の正しい関係に関してある程度の経.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL チューブ	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL tube	Sarstedt, Germany	72.691
21 G needle	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G needle	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL syringe	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm 円形ガラス カバースリップ	Menzel Glasser,ドイツ	630-2113
60 mm ペトリ皿	ThermoFisher Sientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, ドイツ	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, ドイツ
牛血清アルブミン	Sigma-Aldrich, ドイツ	B6917
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich, ドイツ	2110
Centrifuge	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21447
Donkey-anti mouseAlexaFluor 488 IgG 抗体	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
"evolve"-EM 512 Digital Camera System	Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ Software	Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
ヤギ抗Iba1	富士フイルム和光ケミカルズ、米国	011-27991
HEPES	Biowest、フランス	P5455
高速溶液交換システム	ALA Scientific Instruments、米国
Incubator	Memmert GmbH + Co. KG、ドイツ
塩化マグネシウム	Sigma-Aldrich、ドイツ	M2393
Matlabソフトウェア	Math Works, USA
マウス 抗GFAP	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, Germany	158127
Penicilin andStreptomycin	ThermoFisher Sientific, USA	15140122
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
Potassium	chloride Sigma-Aldrich, Germany	P5405
Potassium dihydrogen phosphate	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
Shaker DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, USA
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich、ドイツ	S3817
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich、ドイツ	S5886
リン酸ナトリウム二塩基性七水和物	Carl ROTH GmbH	X987.2
ピルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich、ドイツ	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience、英国	1138
Triton X - 100	Sigma-Aldrich, ドイツ	T8787
Trypsin	Sigma-Aldrich, ドイツ	T4799
Vapro 蒸気圧浸透圧計 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System	Visitron System Gmbh, ドイツ
VisiChrome Polychromator System	Visitron System Gmbh, ドイツ
VisiView 高性能セットアップ	Visitron System Gmbh, ドイツ
キセノンショートアークランプ	牛尾, 日本