組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

サマリー

刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、強力で非破壊的でラベルフリーのイメージング技術です。新しい用途の1つは刺激ラマン組織学であり、タンパク質および脂質ラマン遷移における2色SRSイメージングを使用して、擬似ヘマトキシリンおよびエオジン画像を生成する。ここでは、組織診断のためのリアルタイムの2色SRSイメージングのためのプロトコルを実証します。

要約

刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、組織診断のための強力な光学イメージング技術として浮上している。近年、2色SRSは、脳腫瘍の迅速かつ信頼性の高い診断を可能にするヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)と同等の画像を提供できることが示されている。このような能力により、刺激的な術中がん診断アプリケーションが可能になりました。組織の2色SRSイメージングは、ピコ秒またはフェムト秒レーザー光源のいずれかで行うことができます。フェムト秒レーザには、高速ハイパースペクトルイメージングやリアルタイムの2色SRSイメージングなど、柔軟なイメージングモードを可能にするという利点があります。チャープレーザーパルスによるスペクトル集束アプローチは、通常、高いスペクトル分解能を達成するためにフェムト秒レーザーで使用されます。

直交変調とロックイン検出により、2色SRS集録を実現できます。パルスチャーピング、変調、および特性評価の複雑さは、この方法の広範な採用のボトルネックです。この記事では、スペクトル集束SRSとエピモードでのマウス脳組織のリアルタイム2色イメージングの実装と最適化を実証するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、SRSの高速および分光イメージング機能を活用する幅広いSRSイメージングアプリケーションに使用できます。

概要

従来の組織診断は、染色プロトコルに続いて光学顕微鏡下での検査に依存していました。病理学者によって使用される1つの一般的な染色方法はH&E染色である:ヘマトキシリンは細胞核を紫がかった青色に染色し、エオジンは細胞外マトリックスおよび細胞質をピンク色に染色する。この単純な染色は、多くの組織診断タスク、特に癌診断のための病理学におけるゴールドスタンダードのままです。しかし、H&E組織病理学、特に術中設定で使用される凍結切片化技術には、依然として限界があります。染色手順は、組織の埋め込み、切片化、固定、および染色¹を含む面倒なプロセスである。一般的な所要時間は 20 分以上です。凍結切片化中にH&Eを実行することは、マージン評価のために細胞の特徴または成長パターンを3Dで評価する必要があるため、複数の切片が一度に処理される場合、より困難になることがあります。さらに、術中の組織学的技術は、熟練した技術者および臨床医を必要とする。多くの病院における理事会認定病理学者の数の制限は、多くの場合、術中診療の制約である。このような制限は、デジタル病理学および人工知能ベースの診断²における急速な発展の関心によって緩和され得る。しかし、H&E染色の結果は技術者の経験に応じて変動するため、コンピュータベースの診断にはさらなる課題があります²。

これらの課題は、....

プロトコル

すべての実験動物の手順は、ワシントン大学の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコル(#4395-01)に従って、200μmの固定された切片化されたマウス脳を用いて実施した。野生型マウス(C57BL/6J株)を_CO2で安楽死させる。次に、開頭術を行い、リン酸緩衝生理食塩水中の4%パラホルムアルデヒド中で固定するために脳を抽出する。脳を3%アガロースと0.3%ゼラチン混合物に埋め込み、ビブラートームによって厚さ200μmのスライスに切断する。

1. 初期アライメント

メモ: 最適な感度と解像度が得られるように、両アームのビームサイズと発散が一致していることを確認してください。ポンプとストークスビームをコリメートし、レーザー走査顕微鏡に入る前にサイズを調整します。これを行うには、ダイクロイックミラーでそれらを結合する前に、各ビームに一対の無彩色レンズを使用します。ビームアライメントのために、常に適切なレーザーゴーグルを着用してください。

1. ビームコリメーション
   1. ポンプビーム用の無彩色レンズのペアを取り付けます。出発点として、100mmレンズと200mmレンズを使用して、レーザービームサイズを2倍に拡大します。2 つのレンズの距離が約 300 mm であることを確認します。ポンプビームを両方のレンズの中心に合わせま....

結果

スペクトル分解能の最適化:
材料を介した分散は、分散媒(長さおよび材料)および波長によって影響を受ける。分散ロッドの長さを変更すると、スペクトル分解能と信号サイズに影響します。これはギブアンドテイクの関係であり、アプリケーションに応じて異なる重み付けが可能です。ロッドは、ビームパルスを周波数が広く、時間が狭いことから、周波数が狭く、時間が広い状態に伸ばします。 図7は 、スペクトル分解能に対するロッドの長さの変化の影響を示しています。 図7Aは、 非常に低いスペクトル分解能を示しています。このセットアップにはガラスのチャーピングロッドがなく、DMSOからの2つのラマンピークはまったく解決されません。 図7B、Cでは、ガラスチャーピングロッドの数の増加が2つのピークを解決し始める。最後に、 図7D は、マッチングチャーピングが両方.......

ディスカッション

このプロトコルで提示される2色SRSイメージング方式は、1色SRSイメージングの適切な実装にかかっています。単色SRSイメージングでは、重要なステップは空間アライメント、時間アライメント、変調深度、位相シフトです。2つのビームを空間的に結合することは、ダイクロイックミラーによって達成される。ビームをダイクロイックミラーに送る際の微調整には、いくつかのステアリングミラーが使用されています。ビームがダイクロイックミラーと組み合わされると、ミラーで結合ビーム経路を拾い上げて>1m離れた壁に向かって送り、結合ビームがIRカードと重なっているかどうかを確認することで、空間的アライメントを確認できます。顕微鏡による空間的アライメントに続いて、時間的オーバーラップは、空間的アライメントを維持する利点を有する再帰反射器ベースの遅延ステージで経路長を調整することによって行われる。1,040nmアームは、このプロトコルの遅延ビームです。遅延段に 2 つのビームが時間的に重なり合う範囲がない場合、時間的なオーバーラップは不可能です。その場合、時間的なオーバーラップが遅延スキャンの途中の範囲に近くなるように、遅延ステージ全体を別の場所に移動する必要がある場合が.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 mm アクロマティックレンズ	THORLABS	AC254-100-B	ブロードバンド、650 - 1,050 nm、アクロマティックレンズ焦点距離、100 mm
20 MHz バンドパスフィルター	Minicircuits	BBP-21.4+	集中 LC バンドパスフィルター、19.2 - 23.6 MHz、50 & オメガ;
200 mm アクロマティックレンズ	THORLABS	AC254-200-B	ブロードバンド、650 - 1,050 nm、アクロマティックレンズ焦点距離、200 mm
アクロマティック半波長板	ユニオン オプティック	WPA2210-650-1100-M25.4	広帯域半波長板
アクロマティック 1/	ユニオン オプティック	WPA4210-650-1100-M25.4	ブロードバンド 1/4 波長板
ビームサンプラー	THORLABS	BSN11	10:90プレートビームスプリッター
ダイクロイックミラー	THORLABS	DMSP1000	その他、中心波長が1,000nm前後のダイクロイックが使用可能です。
DMSO(ジメチルスルホキシド)	Sigma Aldrich	472301	ラマンシフトのキャリブレーション用溶媒です。ラマンピークがわかっている他の溶媒も使用できます。
電気光学振幅変調器	THORLABS	EO-AM-NR-C1	直交変調とデュアルチャネルイメージングには、2つのEOMが必要です。より低い駆動電圧を使用できるように、共振バージョンをお勧めします。
偽のH&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for the Generating the EOM Driving Frequency and the Reference to the Lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise
Time Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL周波数分周器(f / 2、f / 4、f / 8、f / 16)、レーザー出力から20MHzを生成するためのもの。
高分散ガラスロッド	ユニオンオプティック	CYLROD01	高分散 H-ZF52A ロッドレンズ 120 mm、SF11 ロッドレンズ 100 mm
Insight DS+	Newport		レーザーシステムは、2つの同期パルスレーザー(1, 040 nmの固定ビームと680-1,300 nmの範囲の1つのチューナブルビーム)を80 MHzの繰り返し周波数で出力できます。
ロックインアンプ	リキッドインスツルメン	Moku Lab	フォトダイオードからSRS信号を抽出するロックインアンプです。チューリッヒインストゥルメントHF2LIまたは同様の機器も使用できます。
ミラーTHORLABS		BB05-E03-10	帯域誘電体ミラー、750 - 1,100 nm。シルバーミラーも使用できます。
電動ディレイステージ	Zaber	X-DMQ12P-DE52	ディレイステージで、ポンプとストークスレーザーの時間的なオーバーラップを細かく制御します。他の電動ステージは機能するはずです。
油浸コンデンサ	ニコン	CSC1003	1.4NA。NA>1.2の他のコンデンサーを使用できます。
オシロスコープ	Tektronix	TDS7054	400MHz以上のバンドwdithを備えた他のオシロスコープは機能します。
移相器	SigaTek	SF50A2	変調周波数の位相シフト用
フォトダイオード	浜松製作	S3994-01	シリコンPINダイオード 大面積 (10 x 10 cm2)その他、大面積で低容量のダイオードも使用可能です。
偏光ビームスプリッター	ユニオンオプティック	PBS9025-620-1000	広帯域偏光ビームスプリッター
再放射屈折率データベース			refractiveindex.info
レトロリフレクター	エドモンド・オプティクス	34-408	BBAR 直角プリズム。他のプリズムまたは再帰反射器を使用できます。
RFパワーアンプ	Minicircuits	ZHL-1-2W +	ゲインブロック、5 - 500 MHz、50 Ω
スキャンミラー	ケンブリッジテクノロジー	6215H	銀コーティングを施した5mmミラーセットを使用しました
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	レーザー走査型顕微鏡制御ソフトウェア
ショートパスフィルター	THORLABS	FESH1000	25.0mm プレミアムショートパスフィルター、カットオフ波長:1,000nm。ストークスを効率的に抑制するには、2つのフィルターが必要になる場合があります。
直立顕微鏡	ニコン	エクリプス FN1	他の顕微鏡フレームも使用できます。レーザー走査型顕微鏡が利用可能な場合は、直接使用できます。それ以外の場合は、ガルボスキャナーとスキャンレンズを顕微鏡に追加する必要がありました。
水浸対物レンズ	オリンパス	XLPLN25XWMP2	多光子25倍対物レンズのNAは1.05です。他の同様の目的を使用することができます。

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