DNAカーテンは、ハイスループットな1分子イメージング技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用をリアルタイムで可視化するためのプラットフォームを提供します。現在のプロトコルはAbo1の Schizosaccharomycesのpombe のbromodomain含んでいるAAA+ ATPaseの生物的役割そして分子メカニズムを調査するのにDNAのカーテンの技術を利用する。
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この記事について
サマリー
要約
クロマチンは、真核生物のDNAをパッケージ化する高次構造です。クロマチンは、細胞周期の段階に応じて、また環境刺激に応答して動的に変化します。これらの変化は、ゲノムの完全性、エピジェネティックな調節、および複製、転写、修復などのDNA代謝反応に不可欠です。クロマチンの集合体はクロマチンの動態に不可欠であり、ヒストンシャペロンによって触媒されます。広範な研究にもかかわらず、ヒストンシャペロンがクロマチンの組み立てを可能にするメカニズムは、とらえどころのないままです。さらに、ヒストンシャペロンによって組織化されたヌクレオソームの全体的な特徴はよくわかっていません。これらの問題に対処するために、本研究では、ヒストンシャペロンによるヌクレオソームアセンブリの分子詳細の調査を容易にするDNAカーテンと呼ばれる独自の単一分子イメージング技術について説明します。DNAカーテンは、脂質流動性、マイクロ流体工学、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を組み合わせたハイブリッド技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用のリアルタイムイメージングのためのユニバーサルプラットフォームを提供します。DNAカーテンを用いて、Abo1のヒストンシャペロン機能( Schizosaccharomyces pombe bromodomain 含有AAA+ ATPase)を調べ、Abo1のヒストン集合の分子機構を明らかにしました。DNAカーテンは、クロマチン動態を研究するためのユニークなアプローチを提供します。
概要
真核生物のDNAは、クロマチン1,2として知られる高次構造にパッケージ化されています。ヌクレオソームはクロマチンの基本単位であり、オクタメリックコアヒストンに巻き付いた約147 bpのDNAから構成されています3,4。クロマチンは真核細胞において重要な役割を果たします。例えば、コンパクトな構造は、内因性因子や外因性の脅威からDNAを保護します5。クロマチンの構造は、細胞周期の段階や環境刺激に応じてダイナミックに変化し、複製、転写、修復などのDNAトランザクションにおけるタンパク質のアクセスを制御しています6。クロマチン動態は、ゲノムの安定性やエピジェネティックな情報にとっても重要です。
クロマチンは、ヒストン尾部修飾やクロマチンリモデラー、ポリコーム群タンパク質、ヒストンシャペロンなどのクロマチンオーガナイザーなど、さまざまな要因によって動的に制御されています7。ヒストンシャペロンは、コアヒストンの堆積または剥離を介してヌクレオソームの組み立てと分解を調整します8,9。ヒストンシャペロンの欠損はゲノムの不安定性を誘発し、発達障害や癌を引き起こします9,10。様々なヒストンシャペロンは、ヌクレオソームを組み立てたり分解したりするためにATP加水分解のような化学的エネルギー消費を必要としません9,11,12,13。最近、研究者らは、ブロモドメインを含むAAA+(多様な細胞活性に関連するATPアーゼ)ATPアーゼが、ヒストンシャペロンとしてクロマチン動態に関与していることを報告しました14,15,16,17。ヒトATAD2(ATPaseファミリーAAAドメイン含有タンパク質2)は、クロマチンのアクセシビリティを促進し、遺伝子発現を増強する18。転写共調節因子として、ATAD2は発がん性転写因子のクロマチンを調節しており14、ATAD2の過剰発現は多くの種類の癌における予後不良と関連している19。ATAD2の出芽酵母(S. cerevisiae)ホモログであるYta7は、クロマチン15のヌクレオソーム密度を低下させる。対照的に、ATAD2の分裂分裂菌(S. pombe)ホモログであるAbo1は、ヌクレオソーム密度を増加させる16。独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンを用いて、Abo1がヌクレオソームの組み立てまたは分解に寄与するかどうかが取り上げられる17,20。
従来、生体分子の生化学的特性は、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)や共免疫沈降(co-IP)などのバルク実験によって調べられており、多数の分子が調べられ、それらの平均特性が特徴付けられています21,22。バルク実験では、分子のサブステートはアンサンブル平均効果によってベールに包まれ、生体分子相互作用の探索は制限されます。対照的に、単一分子技術はバルク実験の限界を回避し、生体分子相互作用の詳細な特性評価を可能にします。特に、単一分子イメージング技術は、DNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用の研究に広く使用されている23。そのような技術の1つが、マイクロ流体工学と全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)に基づく独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンです24,25。DNAカーテンでは、何百もの個々のDNA分子が脂質二重層に固定されており、脂質の流動性によりDNA分子の2次元運動が可能になります。流体力学的流れが適用されると、DNA分子は二重層上の流れに沿って移動し、拡散障壁に引っかかり、そこで整列して引き伸ばされます。DNAをインターカレート剤で染色しながら、蛍光標識タンパク質を注入し、TIRFMを使用してタンパク質-DNA相互作用を1分子レベルでリアルタイムに可視化します23。DNAカーテンプラットフォームは、拡散、転座、衝突などのタンパク質の動きの観察を容易にします26,27,28。さらに、DNAカーテンは、定義された位置、配向、およびトポロジーを持つDNAのタンパク質マッピングに使用したり、タンパク質と核酸の相分離の研究に適用したりできます29,30,31。
この研究では、DNAカーテン技術を使用して、特定のタンパク質を直接可視化することにより、シャペロンの機能の証拠を提供します。さらに、DNAカーテンはハイスループットプラットフォームであるため、統計的信頼性に十分なデータ収集が容易になります。ここでは、 S. pombe bromodomain含有AAA+ ATPase Abo1の分子的役割を調べるためのDNAカーテンアッセイの実施方法について詳細に説明する。
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プロトコル
1. フローセルの作製
- 以前に公開されたレポート25に従って、ナノトレンチパターンを含む洗浄済みの石英ガラススライドを準備します。
- ダイヤモンドコーティングされたドリルビットを使用して、洗浄済みの石英ガラススライド(図1A)に直径1 mmの穴を2つ開けます( 材料表を参照)。
- DCスパッタ32 ( 材料表参照)と10mTorrのアルゴンガスを使用して、250nmの厚いアルミニウム(Al)をスライド上に堆積させます。
- 厚さ310 nmの4%950Kポリメタクリル酸メチル(PMMA)( 材料表参照)を4,000rpmで1分間スピンコートし、180°Cのホットプレートで3分間焼きます。
- 80kVで0.724nAの電流で電子ビーム(ebeam)リソグラフィー33 を使用して、2つの穴の間のPMMA層にナノトレンチパターンを描画します。
注:ナノトレンチパターンのアーキテクチャと寸法を 図1Aに示します。 - スライドを現像液(メチルイソブチルケトンとイソプロパノールの比率が1:3、 材料表を参照)に2分間浸漬して、電子ビーム露光されたPMMAを除去します。
- 塩素(Cl2)および三塩化ホウ素(BCl3)ガスを用いた誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング(ICP-RIE)によるエッチングAl層。
注:これら2つのガスは、ビームが露出した領域からAlを除去することができます。 - 四フッ化硫黄(SF4)、テトラフルオロメタン(CF4)、および酸素(O2)ガスを使用して、スライドにナノトレンチを刻みます( 材料表を参照)。
- スライドをAlエッチング液(AZ 300 MIF現像液、 材料表を参照)に10分間浸漬して、残りのAl層を除去します。
- 製造後、スライドを脱イオン水ですすぎ、浴式超音波処理装置を使用してアセトンで30分間超音波処理します。
- スライドを2%Hellmanex III溶液( 材料表参照)で磁気撹拌で少なくとも1日間洗浄します。
- スライドをアセトンで 30 分間、1 M NaOH で 30 分間連続して超音波処理します。
- スライドを脱イオン水ですすぎ、窒素(N2)ガスで乾燥させます。
- 両面テープの中央にきれいな紙(5mm×35mm)を貼ります。スライドの上にテープを貼り、2つの穴とナノパターンを紙で覆います。
- 清潔なブレードを使用して用紙を切除します(図1A)。
- 両面テープの上にガラス製のカバーガラスを置き、ピペットチップでカバーガラスをこすり、マイクロ流体チャンバーを形成します(図1A)。
- 組み立てたフローセルを2枚の顕微鏡スライドの間に置き、クリップで留めます。
- フローセルを120°Cの真空オーブンで45分間焼きます。
- ホットグルーガンを使用して、チップベースの分析用の流体コネクタ(ナノポート)を各開いた穴に取り付け( 材料表を参照)、ルアーロックチューブの2本のラインを接続します。
- 3 mLの脱イオン水を含むルアーロックシリンジを接続し、チャンバーを洗浄します。
- 3 mLの脂質緩衝液(20 mMのTris-HCl、pH 8.0、および100 mMのNaCl)でチャンバーをドロップバイドロップ接続 で 洗浄します。
注意: ドロップバイドロップ接続は、チャンバーに気泡が注入されないように、すべてのシリンジをフローセルにリンクします。 - 脂質バッファー中の 0.04x ビオチン化脂質 1 mL をチャンバーに注入し、1 ショットあたり 5 分間のインキュベーションで 2 ショットで行います。
注:1xビオチン化脂質ストックの調製は、以前に発表されたレポート34に記載されています。 - チャンバーを3 mLの脂質緩衝液で洗浄し、20分間インキュベートして、脂質二重層をスライド表面上で成熟させます。
- 1 mL の BSA バッファー(40 mM の Tris-HCl、pH 8.0、50 mM の NaCl、2 mM の MgCl2、0.2 mg/mL の BSA)を加え、5 分間インキュベートしてスライド表面を不動態化します。
注:このステップにより、スライド表面へのタンパク質の非特異的結合を減らすことができます。 - 0.025 mg/mL のストレプトアビジンを 1 mL の BSA バッファーに 2 回のショットで注入し、1 ショットあたり 10 分間のインキュベーションを行います。
- 残留ストレプトアビジンを3 mLのBSA緩衝液で洗い流します。
- ~300 pM(30 μL)のビオチン化ラムダファージDNAを1 mLのBSAバッファーに2ショット、1ショットあたり10分間のインキュベーションでチャンバーに注入します。
注:ビオチン化ラムダDNAの調製は、以前に発表されたレポート34に記載されています。
2. フローセルをマイクロ流体システムに接続し、顕微鏡にロードする
- Abo1イメージングバッファー(50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM ATP、2 mM MgCl2、1.6%グルコース、0.1xグロキシー、材料 表を参照)を調製します。
注:グロキシーは、蛍光染料の光退色を低減する酸素掃気システムです。グルコースオキシダーゼとカタラーゼによる100倍グロキシストックの調製については、参考文献35に記載されています。 - 10 mLのイメージングバッファーを含むシリンジをシリンジポンプに接続し、マイクロ流体システムのすべてのチューブラインで気泡を除去します。
- 準備したフローセルをドロップtoドロップ接続 で マイクロ流体システムと結合し、フローセルへの気泡注入を回避します(図1B)。
- フローセルとフローセルホルダーを組み立て、カスタムメイドのTIRF顕微鏡に取り付けます(図1C)。
注意: フローセルを顕微鏡下に置くときは、対物レンズの高さを慎重に設定してください。フローセルは対物レンズに触れてはなりません。レンズが破損する恐れがあります。 - フローセルの中央にオイルに一致するインデックスを滴下し、オイルドロップにカスタムメイドのダブプリズム( 材料表を参照)を置きます。
3. DNAカーテンを用いたAbo1によるヒストン集合
- 5 nM の Abo1 と 12.5 nM の Cy5 標識 H3-H4 ヒストン二量体(Cy5-H3-H4)( 資料表参照)を 150 μL のイメージングバッファー中で混合します。すべてのタンパク質は、以前に発表されたレポート17に従って調製されました。
- 混合物を氷上で15分間インキュベートします。
注:Cy5の光退色を避けるために、インキュベーションは暗所で行う必要があります。 - ~20 pM(2 μL)のYOYO-1色素をイメージングバッファーに注入し、100 μLのサンプルループを通してラムダDNA分子を染色します。
- イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を実行し、488 nmレーザーをオンにして、DNAカーテンが整形されているかどうかを確認します。
注:DNAカーテンが整形されている場合、YOYO-1で染色されたDNA分子は、流れの存在下でバリアに整列した線として表示されます。引き伸ばされたラインは、流れがオフになると反動してバリアから拡散します。 - 2 mLの高塩バッファー(200 mMのNaClと40 mMのMgCl2)を注入して、DNAからYOYO-1色素を除去します。
- YOYO-1色素を除去した後、インキュベートしたタンパク質サンプルを注入します。
- タンパク質がDNAカーテンに到達したら、シリンジポンプをオフにし、シャットオフバルブをオフにし、15分間インキュベートしてAbo1によるヒストンローディングを行います。
- 結合していないAbo1タンパク質とヒストンタンパク質を5分間洗い流します。
- シャットオフバルブをオンにして、フローインジェクションを再開します。
- 637 nmレーザーをオンにし、バッファーフローがオンの状態で蛍光タンパク質をイメージングします。
- バッファーフローを一過性にオフにして、ヒストンタンパク質がDNAにロードされているかどうかを確認します(図2C)。
- 画像取得プログラムでDNAカーテン画像を収集します( 材料表を参照)。
注:バッファーフローが一過性に停止すると、DNAは全反射のエバネッセントフィールドから反跳し、DNAに結合した蛍光標識タンパク質は消失します。
4. データ分析
- 画像取得プログラムで撮影した画像を画像シーケンスとしてTIFF形式に変換します。
注:すべてのデータは、参考文献20に記載されているように、Image J(NIH)を使用して分析されました。 - 画像シーケンスから単一のDNA分子を選択し、キモグラフを描きます。
注:キモグラフは、単一のDNA分子に結合した各ヒストンタンパク質の蛍光強度の変化を時間の関数として表示することができます。 - キモグラフから蛍光強度プロファイルを作成し、複数のガウス関数で当てはめます。
- 蛍光強度プロファイルからピークの中心座標を収集します。この工程では、ヒストン蛍光の最小強度を得ることができる。
- プロファイルから収集したすべてのピーク強度を最小強度で割ります。DNAに結合したH3-H4二量体の数は、このステップで推定されます。
- 他のDNA分子について、ステップ4.2〜4.5を実行します。
- ビンサイズが 1 kbp の H3-H4 二量体の結合分布のヒストグラムを作成します。分析された分子の数は少なくとも300です。
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結果
この研究では、DNAカーテンアッセイ用のフローセル調製手順について説明します(図1A)。DNAカーテンアッセイは、Abo1によるDNA上のヒストンH3-H4二量体集合の研究を容易にしました。まず、インターカレート色素であるYOYO-1でDNA分子を染色することにより、DNAカーテンの形成を確認しました。緑色の線が平行に配列され、YOYO-1がDNA分子に挿入され、流体力学的流れ下で拡散障壁でよく整列し、引き伸ばされたことを示しています(図2A)。YOYO-1がDNAとヒストンタンパク質の相互作用を阻害する可能性を排除するために、ヒストンタンパク質を添加する前に、高塩バッファーでDNAからYOYO-1を除去しました。Abo1の非存在下でCy5-H3-H4二量体をDNAカーテンに注入すると、Cy5-H3-H4はDNAに結合せず、H3-H4二量体がDNAに自発的に結合していないことが示されました(図2B)。Cy5-H3-H4にAbo1を注入すると、DNA分子に赤色蛍...
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ディスカッション
単一分子イメージング技術として、DNAカーテンはDNA代謝反応を調べるために広く使用されている43。DNAカーテンは、脂質流動性、マイクロ流体工学、TIRFMを連結したハイブリッドシステムです。他の単一分子技術とは異なり、DNAカーテンはタンパク質-DNA相互作用のハイスループットなリアルタイム可視化を可能にします。したがって、DNAカーテン法は、配列特異的な会合、DNAに沿ったタンパク質の移動、DNA上でのタンパク質間衝突など、分子相互作用の背後にあるメカニズムを調べるのに適しています17,20,26。さらに、DNAカーテンのハイスループットな性質により、統計的信頼性を確保するのに十分なデータを収集できます。DNAカーテンは、速度論的パラメータ、拡散係数、速度、処理能力など、タンパク質の生物物理化学的特性の調査を容易にします17,26,27,30。
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
著者らは、韓国のKAISTのJi-Joon Song教授、Carol Cho博士、Juwon Jang博士によるAbo1およびCy5-H3-H4への親切な支援に感謝します。この研究は、国立研究財団助成金(NRF-2020R1A2B5B01001792)、蔚山科学技術研究所の学内研究費(1.210115.01)、基礎科学研究所(IBS-R022-D1)の支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mLルアーロックシリンジ | BecktonDickinson 301321 | ||
| 1' x 3' 溶融シルカスライドグラス | G. Finkenbeiner | 1インチ x 3インチ 長方形、厚さ1 mm | |
| 10 mLルアーロックシリンジ | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-CIS) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | ビオチン化脂質ストックの成分です |
| 18:1 ビオチニルキャップ PE | アバンティ | 870273 | ビオチン化脂質ストックの成分 |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | ビオチン化脂質ストックの成分 |
| 3mL ルアーロックシリンジ | BecktonDickinson | ||
| 6ウェイサンプル注入バルブ | IDEX | MX シリーズ II | |
| 950K PMMA | オールレジスト | 671.04 | |
| アセトン | SAMCHUN | A1759 | |
| アデノシン 5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (ATP) | シグマ | A2383 | |
| アルミニウム (Al) | TASCO, 韓国 | LT50AI414 直径 | 4 インチ、厚さ 1/4 インチ |
| アミコン ウルトラ遠心フィルター、MWCO 10 kDa | ミリポア | Z648027 | |
| アンピシリン | Mbcell | MB-A4128 | 抗生物質 |
| AZ 300 MIF開発者 | メルク | 10454110521 | アルミニウム |
| ブレード | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| の除去に使用されます 三塩化ホウ素(BCl3) | UNIONGAS | 純度:>99.99% | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | シグマ | A7030 | |
| カタラーゼ | シグマ | C40-1g | これは100xグロキシストック |
| 塩素(Cl2) | UNIONGAS | の成分です純度:>99.99% | |
| クリア両面テープ | 3M | 313770 | |
| D-(+)-グルコース | シグマ | G7528 | |
| DCスパッタ | リングソロナ | SRM-120 | スライド上のアルミニウムの堆積に使用 |
| ダイヤモンドコーティングされたドリルビット | Eurotool | DIB-211.00 | fusced silica スライドに穴を開けるために使用されます |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| ダブプリズム | Korea Electro-Optics Co., Ltd. | 1906-106 | 反射防止コーティングを施したカスタムメイドの溶融シリカ鳩プリズム |
| ドリル | ドレメル | ドレメル 3000 | フスキングシリカスライドに穴を開けるために使用されます |
| 電子豆リソグラフィー | ナノビーム株式会社 | NB3 | |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| フィンガータイト継手 | IDEX | F-300 | 「PFA Tubing Natural」と接続してルアーロックチューブを形成 |
| フランジレスオスナット | IDEX | P-235 | 「PFA Tubing Natural」と接続してルアーロックチューブを形成 |
| 凍結乾燥機、HyperCOOL | Labogene | HC3110 | 液体タンパク質の凍結乾燥に使用される |
| グルコースオキシダーゼ | Sigma | G2133-50KU | これは 100x グロキシストックのコンポーネントです |
| 塩酸グアニジニウム | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton シリンジ | ハミルトン カンパニー | 80065 | このシリンジはサンプル注入 |
| Hellmanex III | Sigma | に使用されます Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | FPLCに使用(サイズ除外) |
| ホットプレート攪拌機 | コーニング | PC-420D | |
| 塩酸 | シグマ | H1759 | Tris-HCl |
| インデックスマッチングオイル | に使用 ZEISS | 444970-9000-000 | |
| 誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング | トップテクノロジー株式会社 | FabStar | |
| イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG) | グレンサムライフサイエンス | GC6586-100g | β-ガラクトシダーゼ活性 |
| ラムダファージDNAの誘導に使用されます ラムダファージDNA | NEB | N0311 | |
| LBブロス | BD difco | 244610 | 大腸菌細胞増殖用培地 |
| ルアーアダプター10-32 | IDEX | P-659 | これはルアーロックを接続しますシリンジ・チューブ |
| 塩化マグネシウム六水和物 | フィッシャーバイオ試薬 | BP214 | |
| メチルイソブチルケトン (MIBK) | カヤク 先端材料 | ソリューション開発に使用 | |
| 顕微鏡 (Eclipse Ti2) | ニコン | Eclipse Ti2 | 倒立蛍光顕微鏡 |
| 顕微鏡ガラスカバースリップ | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| 顕微鏡スライド | DURAN GROUP | DU.2355013 | スライドガラス グランドエッジ 45°C;、プレーン 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| 対物レンズ | ニコン | CFI プラン アポクロマート VC 60XC WI | 浸漬型:水、倍率:60倍、補正:18、作動距離:0.29 (0.31-0.28) |
| ワンショット BL21 (DE3)pLysS ケミカルコンピテント大腸菌 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | C6060-03 | を過剰発現するためのコンピテントセル酸素 |
| (O2) | NOBLEGAS、韓国 | 純度:>99.99% | |
| PFAチューブ天然 | IDEX | 1512L | 「フィンガータイトフィッティング」と接続してルアーロックチューブを形成しますフ |
| ッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF) | ロシュ | 11359061001 | プロテアーゼ阻害剤 |
| Sephacryl S-200 高分解能 | Cytiva | 17-0584-01 | FPLCに使用(サイズ除外) |
| 遮断弁 | IDEX | P-732 | |
| 酢酸ナトリウム | Sigma 791741 | ||
| 塩化ナトリウム(NaCl) | Sigma | S3014 | |
| 水酸化ナトリウム(NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| ストレプトアビジン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S888 | |
| 四フッ化硫黄 (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | 純度: >99.99% | |
| シリンジポンプ | KD Scientific | 78-8210 | |
| テトラフルオロメタン (CF4) | NOBLEGAS, 韓国 | 純度:>99.99% | |
| TritonX-100 | Σ | T9284 | |
| Trizmaベース | Σ | T1503 | Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | FPLC(イオン交換)に使用 |
| ユニオン組立 | IDEX | P-760 | これはチューブを接続します |
| 尿素 | Σ | U5378 | |
| 真空オーブン | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Y3601 | |
| ;-メルカプトエタノール(BME) | Sigma | M6250 |
参考文献
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