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方法論記事

狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスにおけるタンパク質尿、白血球の腎浸潤、およびタンパク質の腎沈着の解析

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DOI:

10.3791/63506

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2022年6月8日

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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

この記事について

サマリー

本プロトコールは、マウスにおけるループス進行を追跡する方法を記載する。腎臓における細胞浸潤およびタンパク質沈着に基づいて狼瘡腎炎を特徴付けるために、2つの追加の手順が提示される。

要約

全身性エリテマトーデス(SLE)は、既知の治療法のない自己免疫疾患であり、腎臓を含む多くの器官における持続的な炎症を特徴とする。このような状況下では、腎臓は血液から老廃物をきれいにし、塩分および体液濃度を調節する能力を失い、最終的に腎不全につながる。女性、特に妊娠可能年齢の女性は、男性の9倍の頻度で診断されます。腎臓病はSLE患者の死亡率の主要な原因です。本プロトコールは、採取した尿中の排泄タンパク質レベルを測定し、時間の経過とともに狼瘡の進行を追跡する迅速かつ簡単な方法を記載している。さらに、白血球の腎浸潤を調査するために、サイズおよび密度選択に基づいて腎臓単核球を単離するアプローチが提供される。さらに、糸球体におけるタンパク質沈着および尿細管間質腔における白血球浸潤を特徴付けるために、免疫組織化学的方法が開発されている。これらの方法は、狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスの腎臓に関連する慢性炎症の進行を調査するのに役立つ可能性がある。

概要

腎臓の主な機能は、水と塩の恒常性を維持しながら、尿を通して有毒物質を排除することです1。この機能は、全身性エリテマトーデス(SLE)の患者において脅かされ、いわゆるループス腎炎(LN)につながる。LNは、免疫系が腎臓を攻撃し、持続的な腎臓の炎症を引き起こし、したがって血液から老廃物をきれいにし、塩分および体液濃度を調節する能力を失う結果である。これは最終的に腎不全につながります, これは致命的であり得る.腎炎プロセスの間、循環するB細胞、T細胞、および単球が腎臓にリクルートされ、ケモカイン、サイトカイン、および免疫複合体形成自己抗体を分泌する。これは最終的に、内皮細胞損傷、膜性傷害、腎尿細管萎縮、および線維症をもたらす2。

MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr)狼瘡を起こしやすいマウスは、ヒトSLE3に似た狼瘡様の臨床徴候を示す古典的なマウスモデルである。このモデルは、SLE患者における主要な死亡原因の1つであるループス腎炎(LN)4の理解に役立ってきました。ヒトおよびマウスSLEの両方において、LNは、免疫複合体の腎沈着によって引き起こされる漸進的な炎症、続いて補体活性化、炎症性細胞の動員、および腎機能の喪失を特徴とする5。免疫複合体沈着は、内因性腎細胞によるケモカインおよびサイトカイン産生を誘導する第1段階であり、これは免疫細胞を動員することによって炎症反応を拡大する6。現在のプロトコルは、細胞浸潤および免疫複合体沈着を分析する腎疾患の進行を追跡するためのいくつかの技術を提示する。

毎週採取された尿は、狼瘡発症前、発症中、および発症後のタンパク質尿症の経時変化の検出および可視化を可能にする。バイオマーカーとしてのタンパク尿はLNの生物学的進行を決定することができる。この技術の他の利点は、非侵襲的であり、費用対効果が高く、かつ実装が容易であることです7。腎臓が完全に機能しているとき、タンパク質尿症レベルは一貫して低いです。しかし、MRL/lprマウスでは、8〜9週齢以降、蛋白尿レベルの漸進的な上昇、すなわち最終的には腎不全を引き起こすのに十分な高さが観察される8。問題を監視するために、複数の試薬ストリップおよび比色試薬が市販されている。しかし、ブラッドフォードアッセイは安価で、タンパク質尿症の発症およびループス腎炎の経過を決定する上で非常に正確である。このアッセイは迅速であり、試薬は、サンプル9、10、11中に存在する可能性のある溶媒、緩衝液、還元剤、および金属キレート剤の存在の影響を受けません。

考慮すべき重要な側面の1つは、腎臓における細胞浸潤である。これらの浸潤物は、サイトカインなどの可溶性因子の分泌を誘発して炎症を悪化させることにより病因を促進する12。浸潤物中にどのような細胞集団が存在するかをよりよく理解するために、有用な方法は白血球を単離することである13。ここでは、B細胞の腎浸潤の検出を例に挙げて用いる。この手順は、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)およびコラゲナーゼによる消化プロセスから始まり、続いて破片、赤血球、および高密度顆粒球を除去する密度勾配分離が続く。B細胞(CD19+)および形質細胞(CD138+)を単離する理由は、狼瘡腎臓がこれらの細胞14を濃縮することができるからである。腎臓の小さな凝集体中のB細胞の存在は、クローン拡張、ひいては免疫グロブリン(Ig)産生を示すことができることが示唆される。形質細胞は、これらの凝集体と同様に15中に存在することがよく知られている。白血球が単離されると、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、異なる蛍光結合抗体による染色時に目的の細胞を分析することができます。

免疫蛍光は、厚さ4 μmの腎臓組織サンプル中のタンパク質の蛍光可視化を可能にする免疫組織化学(IHC)検出方法の1つです。他のIHC検出方法は、分析物の性質、結合化学、および他の因子に依存する16。免疫蛍光は、抗原を特定の蛍光色素(または蛍光色素)で標識された対応抗体に曝露する迅速な同定方法である。励起すると、蛍光顕微鏡が検出できる光を生成します。この技術は、補体C3およびIgG2a17の沈着を観察するために使用することができる。過剰な補体カスケード活性化は、制御不能な免疫応答および機能喪失と関連している可能性がある18。腎臓における抗二本鎖DNA(抗dsDNA)自己抗体の免疫沈着は大きな懸念事項であり19、IgG2aアイソタイプを有するものはLN20と関連している。具体的には、抗dsDNA抗体は、核物質に対してより病原性および親和性を示し、免疫複合体21を形成する。IgG2aが存在すると、C3を含む補体カスケードが活性化され、免疫複合体22を消去する。C3マーカーとIgG2aマーカーを個別に定量化することも、重ね合わせて相関関係を確立することもできます。

特に、血清クレアチニン測定は、LN23を診断するために顕微鏡的血尿および腎臓生検と共に使用することができる別の信頼できる技術である。しかし、タンパク尿症の存在は糸球体損傷の強力な指標である。その意味で、狼瘡中のタンパク尿症レベルを監視することは、疾患の発症を検出し、狼瘡を診断するための他の方法を補完することができる。さらに、糸球体に沈着した免疫複合体は、炎症反応を誘導し、補体系を活性化し、より多くの炎症細胞をリクルートすることができる。このプロトコルのもう一つの注目すべき点は、腎臓におけるB細胞浸潤である。これは、浸潤したT細胞とともに、臓器損傷を引き起こす局所免疫応答を増幅する。重要なことに、LNの分類は、顕微鏡で見られる糸球体形態学的変化だけでなく、免疫蛍光で観察される免疫沈着にも基づいている。したがって、このプロトコルでは、腎機能の分析のための正確で費用対効果の高い方法が実験室の設定で提供される。

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プロトコル

現在のプロトコルは、バージニア工科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。狼瘡疾患は雌で発生率が高いため、雌のMRL/lprマウスのみを用いた。サンプル収集は4週齢で開始し、15週齢で終了した。マウスを市販の供給源( 材料表を参照)から入手し、施設ガイドラインに従って特定の病原体のない環境で飼育および維持した。

1. 蛋白尿検査

  1. 以下の手順に従って尿を収集します。
    1. 70%エタノールを噴霧してフードを滅菌します。表面に滅菌プラスチックシートを置きます。チップ、1.5 mLチューブ、およびピペットを準備して、約20 μLの液体を回収します。
      注:チップとチューブは滅菌され、前処理が施されていない必要があります。
    2. ケージを取り、フードの中に入れる前に70%エタノールをスプレーしてください。
    3. 片手でマウスを持ち、もう片方の手で腹側領域を上から下に優しくマッサージします。
    4. 1.5 mLのチューブまたはピペットを使用して尿を直接採取するか、サンプルが落ちた場合はプラスチックシートから採取します。各サンプルには、新鮮な手袋、シート、チップを使用してください。
      注:これでうまくいかない場合は、滅菌ビーカーを使用してマウスを隔離し、マウスが排尿した後にビーカーから尿を収集します。
    5. マウスをケージに戻します。別のマウスを取り出し、手順1.1.3-1.1.4を繰り返します。
      注:各マウスのサンプルを採取した後、プラスチックシートとビーカーを70%エタノールで必ず清掃してください。統計的有意性のためには、1群あたり少なくとも5匹のマウスが必要である。尿サンプルは、最大12ヶ月間使用するまで-80°Cで保存することができます。
  2. ブラッドフォード法24によりタンパク質を定量する。
    1. 尿サンプル、アルブミン標準、およびブラッドフォード試薬を冷凍庫の外に10〜20分間保管することにより、室温(RT)に近づけます。
      注:ブラッドフォード試薬およびアルブミン標準は、市販のキットに含まれています( 材料表を参照)。アルブミン標準物質の開始濃度は2mg/mLである。連続希釈(1:2 6回)は水で行わなければなりません。
    2. ブラッドフォード試薬を希釈せずに96ウェルプレート(200 μL/ウェル)に加えます。
    3. 1ウェルあたり5 μLの希釈されていない尿サンプルをピペットし、チップを使用して数回ピペットを上下にピペットで繰り返し、適切に混合します。
    4. 標準(400、200、100、50、25、12.5 mg / dL)を重複して追加します。いくつかの井戸を空白のままにしておきます。
      注:サンプルと標準品の追加は迅速に行う必要があります。
    5. RTで5〜10分間放置します。
    6. プレートリーダーで595nmのプレートを、製造元のプロトコルに従って読み取ります( 材料表を参照)。

2. 腎臓細胞の単離

  1. チャンバー内でマウスをCO2 (流量:30%〜70%体積/分、無意識または死を達成するために)で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。両方の腎臓を収集するために解剖を続行します。氷のように冷たいC10培地に1.5腎臓を置きます。もう片方の腎臓を10月に入れます(ステップ3.1.1)。
    注:C10は、10%ウシ胎児血清、1mMのピルビン酸ナトリウム、100x MEM非必須アミノ酸1%、10mMのHEPES、55μMの2-メルカプトエタノール、および100U/mLのペニシリン - ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640で作られています( 材料表を参照)。
  2. 腎臓を粒径(1~2mm3 個)に切断し、10mmol/LのHEPESを含むRPMI 1640培地で、1mg/mLのコラゲナーゼと0.2mg/mLのDNase I( 材料表参照)を含む5mLの消化緩衝液中で、37°Cで1時間連続して穏やかに振とうしながら消化する。
    注:滅菌2mLチューブに1mL消化バッファーを加え、滅菌はさみを使用して腎臓をみじん切りにします。
  3. 10mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む1x氷冷PBSを10mL加え、氷上で10分間インキュベートする。次いで、懸濁液を2回ボルテックスする。
  4. 細胞懸濁液を100 μMストレーナーでろ過し、10 mLのHBSSフルで洗浄します。
    注: HBSS フルには、5 mM の EDTA、0.1% BSA、および 10 mM の HEPES が含まれています。
  5. RTで10分間、350 x g で遠心分離します。
  6. 30%、37%および70%のストック等張パーコール(SIP)溶液を調製する。
    注: 10x PBS の 1 部容量と Percoll の 9 部ボリュームを混ぜて SIP を準備します ( 材料表を参照)。HBSS フルを使用して、SIP を 30%、37%、および 70% SIP に希釈します。
  7. 細胞を30%SIPの5mLに再懸濁し、5mL(上)の37%および5mL(下)の70%を負荷し、パスターピペットでゆっくりとSIPグラジエントを作ります。
  8. Up9 down0(またはブレーキ0)で1000 x g でRTで30分間遠心分離機。
  9. 37%〜70%界面から白血球を収集し、5mLのC10に再懸濁する。
  10. 350 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
  11. 細胞ペレットを3mLのFACS緩衝液に再懸濁する。細胞はFACS染色の準備ができています。
    注:FACSバッファーには、1x PBSおよび0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)が含まれています。
  12. 350 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清(SN)を捨て、約50 μLを残した。
    注:上清を除去するには、溶液を慎重に注ぎ込むかピペットで固体から遠ざけるか、半自動真空を使用して上清を吸引します。
  13. チューブあたり50μLのFcRブロック( 材料表を参照)を加える(1x PBSで1/50に予め希釈する)。混合し、暗闇の中で氷上で10分間インキュベートする。
  14. 2 mLのFACSバッファーを加えて洗浄する。
  15. 350 x g で4°Cで5分間遠心分離し、SNを捨て、約50μLを残した。
  16. 適切な蛍光色素を20μL加え(1x PBSで1/100を希釈し、 材料表を参照)、氷上で15〜30分間放置する。
  17. チューブあたり50 μLの抗体15 ミックスを加える:CD138-BV711(1x PBS中1/200)およびCD45-AF700(1x PBS中1/200)( 材料表を参照)。
  18. 氷上で暗所で15〜30分間インキュベートし、3mLのFACSバッファーを加えます。
  19. 350 x g で遠心分離機を 4 °C および真空 SN で 5 分間、約 50 μL を残します。これは今、フローサイトメトリーによって分析する準備ができています。

3. 免疫蛍光染色

  1. サンプル収集を実行します。
    1. 最適な切断温度(OCT)コンパウンドで小さなプラスチッククライオモールドに腎臓の半分を埋め込みます( 材料表を参照)。
    2. ポリスチレンフォームの箱にドライアイスを入れ( 材料表を参照)、ドライアイスの上にクライオモールドを慎重に置きます。クライオモールドが平らに置かれていることを確認します。
      注:OCTコンパウンドが固化して白くなるまでに3〜4分かかります。
    3. クライオモールドを取り出し、アルミホイルで包みます。さらに使用するまで-80°Cで保存してください。
      注:これは、少なくとも1年間、-80°Cで保存することができます。
  2. 試料の切片化と固定を行う。
    1. サンプルを4 μmのセクションに切断し、少なくとも2〜3時間待ってから、冷たいアセトン(4°C)で10分間固定します。
      注:アセトンを使用する場合は、特殊な化学フードが必要です。
    2. スライドを固定した後、0.5~1時間風乾し、-20°Cで短時間、または-80°Cで長時間保管してください。
  3. サンプルを染色します。
    1. スライドを冷たいアセトンに5〜10分間固定します。
    2. セクションを RT までウォームアップさせます。セクションの周囲に PAP ペン ( 材料表を参照) を使用して乾かします。
      注:ネイルエナメルも使用できます。このステップにより、抗体希釈液がスライド全体に浮遊するのを防ぎます。
    3. スライドをコプリン瓶( 材料表を参照)の1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)に入れて20分間置き、瓶をシェーカーに置き、静かに振る。
    4. 1x TBSを注ぎ、1x TBS、5%BSA、および0.1%Tween 20で瓶を満たします。シェーカーで20分間インキュベートし、静かに振る。
    5. スライドを取り出し、スライドの底を拭き取って乾かします。必要に応じて、スライドを振って乾かします。100 μLのコンジュゲート抗体25 C3-FITC(1/100)およびIgG2a-PE(1/100)をセクションに追加します( 材料表を参照)。加湿チャンバー内でRTで1時間インキュベートする。
    6. シェーカーで1x TBS、5% BSA、および0.1% Tween 20でセクションを3回、10分間洗浄します。
    7. スライドを振って乾かし、退色防止試薬( 材料表を参照)とカバースリップでセクションを取り付けます。
    8. スライドを顕微鏡(例えば、共焦点顕微鏡またはイメージングシステム顕微鏡)下で見るまで4°Cで保存する。ソフトウェアを使用して画像を定量化し、領域間の蛍光強度を比較するときにバックグラウンド信号を減算します。
    9. ImageJソフトウェア( 材料表を参照)を使用した画像解析の場合は、目的の領域を概説します。
    10. 標準パラメータを設定するには、[ 分析]をクリックし、[ 測定値 と 測定領域の設定] をクリックして結果を取得します。
    11. メジャーウィンドウから取得したデータをスプレッドシートに転送します。
      メモ: 小さな領域を背景として画像から選択できます。蛍光があってはなりません。
    12. 完了したら、[ 分析] をクリックして地域を測定し、前のスプレッドシートにデータを再度転送します。
    13. いくつかのリージョンについて、手順 3.3.11-3.3.12 を繰り返します。
    14. 補正済み細胞蛍光(CCF)=積分密度(選択された細胞領域×平均バックグラウンド蛍光-)として平均蛍光を計算します。
    15. 各地域について計算し、グラフおよび統計ソフトウェアを使用してデータを分析します( 材料表を参照)。

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結果

このプロトコルは、MRL/lprマウスのループス腎炎を評価するために複数の方法を使用しています。まず、腎臓機能障害による経時的なタンパク尿症レベルの上昇を研究する手順が記載されている。図1に示すように、雌マウスを、対照群として200μLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を、治療群としてプロバイオティクス・ラクトバチルス・ロイテリを109cfu/mLの濃度で週2回経口経管栄養で治療した。治療は生後3週で始まり、15週齢で終了しました。L. reuteriで処置したマウス群は、対照群よりも攻撃的なタンパク尿症進行を有していた。

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図1:MRL/lprマウスの尿中...

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ディスカッション

LNはSLE患者の死亡率の主要な原因であり、この疾患を悪化させる要因は依然として不明である。このプロトコルの適用は、タンパク尿症の測定、単離された腎臓白血球のFACS分析、および凍結腎臓切片の免疫蛍光染色を含む複数の方法を使用して腎機能を特徴付けることである。

尿を採取する際に考慮すべき重要な点の1つは、時刻と尿収集の場所と一致しなければならないということです。マウスは夜行性の動物であるため、最も正確なサンプルは、マウスが活動し始める前の午後遅くに収集されます。今回を選んだもう一つの理由は、MRL/lprマウスが夜間に大量の水を飲む傾向があり、尿が希釈される傾向があることです。したがって、間違った時間に収集すると、尿の濃度および/または体積変動が増加する可能性がある。正確な結果を得るためには、できるだけ多くの尿を収集することも重要です。

ブラッドフォードアッセイは、どれだけのタンパク質が存在するかの推定値を提供します。これはSLEマーカータンパク質に特異的ではありませんが、疾患の進行のアイデアを与えるのに十分です

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開示事項

著者らは、利益相反は存在しないと宣言しています。

謝辞

フローサイトメトリーコア施設、病理組織研究所、バージニア工科大学のフラリンイメージングセンター、州立大学の技術サポートに感謝します。この作業は、さまざまなNIHおよび内部助成金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x トリス緩衝生理食塩水(TBS)サーモフィッシャーサイエンティフィックJ60764。K2
2-メルカプトエタノールサーモフィッシャーサイエンティフィック21985-023
抗ヒト/マウス C3シダーランCL7632F
抗マウス CD138 BV711バイオレジェンド142519
抗マウス CD45 AF700バイオレジェンド103127
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA9418-100G
コラゲナーゼ DSigma-Aldrich11088882001
共焦点顕微鏡 LSM 880ZeissLSM 880
Coplin jarFisher Scientific50-212-281
CryomoldFisher ScientificNC9511236
Density gradient mediumGE Healthcare17-1440-02Percoll
DEPC-Treated waterThermoフィッシャーサイエンティフィックAM9906
DNase ISigma-AldrichD4527
dsDNA-ECInvivoGentlrl-ecdna
エチレンジアミン四酢酸フィッシャーサイエンティフィックS311-500EDTA
EVOS M5000 顕微鏡イメージングシステムサーモフィッシャーサイエンティフィックAMF5000
FACS フュージョン セルソーターBD バイオサイエンスFACS Fusion
Fetal Bovine Serum - プレミアム、熱不活化R&DシステムS11150H
フィッシャーブランド 96ウェルポリスチレンプレートフィッシャーサイエンティフィック12-565-501
グラフパッドプリズムGraphPadN/A
ハンクs Balanced Salt SolutionThermo Fisher Scientific14175-079
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
ImageJ, software, National Institutes of Health,N/A
, Lactobacillus reuteri Kandler et al.ATCC23272
MEM 非必須アミノ酸サーモフィッシャーサイエンティフィック11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J マウス (MRL/lpr)ジャクソンラボ485
ネイルエナメルN/A N/A任意の従来の店舗
O.C.T 化合物Tisse-Tek4583
PAP ペンSigma-AldrichZ377821
Peel-A-Way 使い捨て埋め込み金型PolysciencesR-30
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック15140-122
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック70011069
Pierce 20x TBS Bufferサーモフィッシャーサイエンティフィック28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) アッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック23236アルブミン標準品
含まれる ProLon ゴールド 退色防止マウンタンタントサーモフィッシャーP36934
精製ラット 抗マウス CD16/CD32BD バイオサイエンス553141FcR ブロック
RPMI 1640サーモフィッシャーサイエンティフィック11875-093
ピルビン酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック11360-070
SpectraMax M5Molecular DevicesN/ASoftMax Pro 6.1 ソフトウェア
滅菌細胞ストレーナー 100 & マイクロ;MFisher Scientific22363549
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
バンコマイシン塩酸塩GoldbioV-200-1
Zombie AquaBiolegend423102フローサイトメトリー分析用蛍光色素
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