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方法論記事

げっ歯類における in vivoおよび ex vivo 電気インピーダンス筋電視検査の実行

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DOI:

10.3791/63513

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2022年6月8日

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1Department of Neurology, Harvard Medical School - Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Accelerating NeuroVentures, 3Charley's Fund

この記事について

サマリー

この記事では、げっ歯類の腓腹筋に対して in vivo(表面および針電極アレイを使用)および ex vivo (誘電体セルを使用)の電気インピーダンス筋電視を実行する方法について詳しく説明します。マウスとラットの両方でこの技術を実証し、利用可能な変更(すなわち、肥満動物、子犬)を詳述します。

要約

電気インピーダンス筋電図(EIM)は、筋肉組織の健康状態と疾患を評価するための前臨床試験および臨床試験で使用できる便利な技術です。EIMは、低強度で方向性に焦点を合わせた電流を、周波数の範囲(つまり、1kHz〜10MHz)にわたって対象の筋肉に印加し、結果として生じる電圧を記録することによって得られます。これらから、リアクタンス、抵抗、位相を含むいくつかの標準インピーダンス成分が得られます。切除された筋肉に対して ex vivo 測定を行う場合、組織の固有の受動的電気的特性、すなわち導電率と比誘電率も計算できます。EIMは、単純な廃用萎縮に関連して、または治療的介入の尺度として、さまざまな疾患における筋肉の変化を診断および追跡するために、動物およびヒトで広く使用されています。臨床的には、EIMは疾患の進行を経時的に追跡し、治療的介入の影響を評価する可能性を提供するため、臨床試験期間を短縮し、サンプルサイズの要件を減らす機会を提供します。EIMは、ヒトだけでなく生きた動物モデルでも非侵襲的または低侵襲的に実行できるため、前臨床開発と臨床開発の両方を可能にする新しいトランスレーショナルツールとして機能する可能性を提供します。この記事では、子犬や肥満動物での使用など、特定の条件に技術を適応させるためのアプローチを含む、マウスとラットで in vivoおよび ex vivo EIM測定を実行する方法について段階的に説明します。

概要

電気インピーダンス筋電視(EIM)は、筋肉の状態を評価するための強力な方法を提供し、神経筋障害の診断、疾患の進行の追跡、および治療に対する反応の評価を可能にする可能性があります1,2,3。動物の疾患モデルやヒトと同様に適用できるため、前臨床から臨床試験への比較的シームレスな翻訳が可能です。EIM測定は、直線的に配置された4つの電極を使用して簡単に得られ、外側の2つの電極は周波数範囲(一般に1kHzから約2MHz)にわたって痛みのない弱い電流を流し、内側の2つの電極は結果として生じる電圧を記録します1。これらの電圧から、抵抗(R)、電流が組織を通過するのがどれほど難しいかの尺度、および組織のリアクタンス(X)または「帯電性」(電荷を蓄積する組織の能力(静電容量)に関連する尺度)を含む、組織のインピーダンス特性を得ることができます。リアクタンスと抵抗から、位相角(θ)は次式で計算されます。 は、単一の総和インピーダンス測定値を提供します。 figure-introduction-1このような測定値は、任意の多周波生体インピーダンスデバイスを用いて得ることができる。筋線維は本質的に長い円柱であるため、筋肉組織も異方性が高く、線維を横切るよりも線維に沿って電流が流れやすくなります4,5。したがって、EIMはしばしば2つの方向で実行されます:電流がファイバーと平行になるようにファイバーに沿って配置されたアレイと、電流がそれらに垂直に流れるように筋肉を横切って配置されます。さらに、インピーダンス測定セル内で既知の体積の組織が測定されるex vivo測定では、筋肉の固有の電気的特性(すなわち、導電率および比誘電率)を導出することができる6。

「神経筋障害」という用語は、構造的な筋肉の変化および機能障害につながる広範囲の原発性および二次性疾患を定義する。これには、筋萎縮性側索硬化症および様々な形態の筋ジストロフィー、ならびに老化に関連するより単純な変化(例えば、サルコペニア)、廃用性萎縮(例えば、長時間のベッドレストまたは微小重力による)、さらには傷害が含まれる7。原因は豊富であり、運動ニューロン、神経、神経筋接合部、または筋肉自体に起因する可能性がありますが、EIMを使用して、これらのプロセスの多くによる筋肉の初期の変化を検出し、進行または治療への反応を追跡できます。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の患者では、EIMは疾患の進行およびコルチコステロイドに対する反応を検出することが示されている8。最近の研究では、EIMは、月や火星で経験するような分数重力9や、老化の影響10,11など、さまざまな廃用状態に敏感であることも示されています。最後に、各測定で得られたデータセット(多周波および方向依存データ)に予測および機械学習アルゴリズムを適用することにより、筋線維サイズ12,13、炎症性変化および浮腫14、結合組織および脂肪含量15,16を含む組織の組織学的側面を推測することが可能になる。

針筋電図17および磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影、および超音波18,19などの画像技術を含む、ヒトおよび動物の筋肉の健康を評価するために、他のいくつかの非侵襲的または低侵襲的方法も使用される。ただし、EIM は、これらのテクノロジーと比較して明確な利点を示しています。たとえば、筋電図検査は筋線維膜の能動的電気的特性のみを記録し、受動的特性は記録しないため、筋肉の構成や構造の真の評価を提供することはできません。ある点では、イメージング法は組織の構造と組成に関する情報も提供するため、EIMとより密接に関連しています。しかし、ある意味では、それらはあまりにも多くのデータを提供し、定量的な出力を提供するだけでなく、詳細な画像セグメンテーションと専門家による分析を必要とします。さらに、その複雑さを考えると、イメージング技術は、使用されているハードウェアとソフトウェアの両方の仕様によっても大きく影響され、理想的には、データセットを比較できるように同一のシステムを使用する必要があります。対照的に、EIM がはるかに単純であるという事実は、 EIM がこれらの技術的問題による影響が少なく、いかなる形式の画像処理や専門家による分析も必要としないことを意味します。

以下のプロトコルは、非侵襲的(表面アレイ)および低侵襲的(皮下ニードルアレイ)技術の両方を使用して、ラットおよびマウスで in vivo EIMを実行する方法、および切除したばかりの筋肉に対する ex vivo EIMを実行する方法を示しています。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、プロトコル番号(031-2019; 025-2019)でベスイスラエルディーコネスメディカルセンターの施設動物管理および使用委員会によって承認されています。動物を取り扱うために適切なPPE機器を着用し、すべての動物の作業に関するIACUCガイドラインを順守してください。

1. 生体 内表面EIM

  1. 動物を麻酔ボックスに入れて麻酔を誘発します。
    注:ラットには1.5%〜3.5%のイソフルランと2 O 2 L·min-1が使用され、マウスには2%のイソフルランと1 O2 L·min-1が使用されました。
  2. 完全に麻酔をかけたら、動物の足をつまんだ後に反応がないことによって示されるように、マウスを腹臥位でベンチに置き、1.5%イソフルランと1L·min-1の酸素流を使用して麻酔を維持するためにノーズコーンを使用します。
  3. 分析する動物の脚を股関節(膝を伸ばした状態)で45°の角度で置き、医療用テープで足を固定します。
  4. バリカンを使用して、腓腹筋を覆う毛皮を整えます。
  5. 動物の皮膚に脱毛クリームの厚い層を塗り、1分間放置します。次に、生理食塩水飽和ガーゼを使用して脱毛剤を取り除きます。腓腹筋を覆うすべての毛皮が除去されるまで、このプロセスを最大3回繰り返します。
    注意: 皮膚の脱水を防ぐために、測定値を取得していないときは、生理食塩水に浸したガーゼパッドを皮膚の上に置きます。
  6. 表面アレイ(図1)をEIMデバイスに接続し、生理食塩水に浸したガーゼの上に電極を置きます。
  7. 表面アレイを、筋線維に対して縦方向に配向した腓腹筋の上の皮膚に直接配置します。
  8. 適切な接触 (50 kHz の抵抗、リアクタンス、および位相値の安定性を示すソフトウェア上で緑色に表示されたすべてのバーで示される) を確認した後、EIM 測定値を取得します。
    注意: カーブは、適切なデータ収集を確実にするためにリアルタイムでチェックする必要があります。
  9. 表面アレイを90°回転させ、腓腹筋の上の皮膚に再配置して、横方向の測定値を取得します(安定性を示す緑色のバーを確認します)。
  10. 手順1.7、1.8、および1.9を繰り返して、筋肉ごとに合計4つの測定値(縦方向2つと横方向2つ)を取得します。
    注意: 過度の皮膚の炎症や怪我を防ぐために、脱毛剤を2週間ごとに複数回(つまり、同じインスタンスで最大3回)使用しないでください。脱毛剤によって誘発される局所的な皮膚浮腫の発症は収集されたインピーダンスデータに影響を与える可能性があるため、脱毛クリームを除去してから約5〜10分以内に測定を実行することが重要です。動物の回復はイソフルラン麻酔を止めた直後に行われ、手順は鎮痛治療を必要としません。

2. 生体内 ニードルアレイEIM

  1. 動物を麻酔し、手順1.1〜1.4で説明されているのと同じ手順を使用して脚を準備します。但し、ニードルアレイを用いて 生体 内EIMを行う場合には脱毛剤を使用する必要はない。
  2. ニードルアレイ(図2A-F)をEIMデバイスに接続し、生理食塩水を入れた計量ボートに入れます。接続と信号の安定性を確認します(緑色のバーで示されます)。
  3. 皮膚と針をアルコールで消毒します。針アレイを筋線維と比較して縦方向に置き、すべての針が皮膚とその下の筋肉をアレイのプラスチックガードまで貫通するまで、皮膚にしっかりと押し込みます。データを取得します。
  4. アレイをゆっくりと取り外し、最初の測定に対して横方向に90°の角度で皮膚から筋肉に再挿入します。データを取得します。
    注意: ニードルアレイを使用する場合、針電極が皮膚や筋肉組織に与える影響を減らすために、測定値は各方向に一度だけ取得する必要があります。出血が発生した場合は、2回目の測定を行う前に血液をそっと拭き取ってください。動物の回復はイソフルラン麻酔を止めた直後に行われ、手順は鎮痛治療を必要としません。

3. 生体外 EIM

  1. ex vivo誘電体セル(図2G、H)を準備し、チャンバーに生理食塩水を追加し、セルをEIMデバイスに接続して基準値を取得します。
    注意: 生理食塩水の位相とリアクタンスの値はゼロまたはゼロに近い状態で一定に保たれ、生理食塩水の抵抗値は100kHzから25MHzの周波数範囲で約1±1 Ω一定に保たれる必要があります。
  2. それぞれのIACUCガイドラインに従って動物を安楽死させます。
  3. はさみを使用して、アキレス腱の近くの皮膚を切ります。ピンセットを使用して、皮膚を上向きに引っ張って、下にある筋肉と筋膜を明らかにします。腓腹筋に重なっている大腿二頭筋をそっと解剖し、坐骨神経を切片します。
  4. アキレス腱を切って腓腹筋とヒラメ筋の遠位端を解放し、はさみを使って付着物を取り除きながら腱をゆっくりと上に引き上げます。すべてのアタッチメントが取り外されたら、ハサミを使用してヒラメ筋の吻側端を切断し、取り外します。
  5. はさみを使用して、膝蓋骨の周りの腓腹筋の頭を解剖します。
    注:腓腹筋を除去した後、筋線維の元の向きを覚えておくことが重要です。
  6. 腓腹筋を歯科用ワックスのシートの上に置き、かみそりの刃と定規を使用してそれを切断し、腓腹筋の中心から10 mm x 10 mmの切片を取得します。
    注意: 誘電体セルのサイズはカスタマイズできます。ラットには10 mm x 10 mmの細胞を使用し、マウスには5 mm x 5 mmの細胞を使用しました。
  7. ピンセットを使用して、腓腹筋を誘電体セルにそっと置き、繊維が縦方向に向けられていることを確認します(つまり、尾側と吻側の四肢が電極に接触している必要があります)。筋肉が金属電極と完全に接触していることを確認してください。
  8. 誘電体セルの上部を取り付け、2本のモノポーラ針(26 G)を2本の穴に挿入します。EIMデバイスから ex vivo セルに次の順序でワイヤを接続します:(1:I +、2:V +、3:V-、4:I-、ここでIは電流電極を表し、Vは電圧電極を表します)。縦方向の測定値を取得します。
  9. 誘電体セルを開き、筋肉を90°回転させて横方向に再配置します。誘電体セルの上部を再度取り付けます。横方向の測定値を取得します。

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結果

EIMは、表面インビボアレイ(図1)、ニードルインビボアレイ(図2A-F)、および生体外誘電体細胞(図2G、H)を含む多くの条件で取得できます。

EIM は、測定されたインピーダンス値に基づいて、筋肉の状態のほぼ瞬時のスナップショットを提供します。測定値は迅速に取得され、特別なソフトウェアを必要としないシンプルな出力データファイルになります(図3A)。実際、個々の周波数のデータを提供するマルチ周波数インピーダンスデバイスは、独立して開くことができる標準.csv出力を生成することができます。このプロトコルで説明されているシステムは、実験の名前と条件、測定された各周波数での各試行の位相、リアクタン...

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ディスカッション

この記事では、 インビ ボと エキソビボの両方でげっ歯類でEIMを実行するための基本的な方法について説明します。信頼性の高い測定値を取得するには、一連のステップを実行することが重要です。まず、各筋肉は病気、治療、および病理に対して異なる反応を示すため、関心のある筋肉を適切に特定する必要があります。ある筋肉(腓腹筋など)で取得したデータは、別の筋肉(前脛骨筋など)と同じ情報を提供しないことに注意する必要があります。次に、インピーダンス測定を実行するための最適な電極アレイを慎重に選択する必要があります。各アレイタイプには長所と短所の両方がありますが、疾患の進行と解剖学的構造への影響(重度の萎縮など)を考慮しながら、実験計画に適合するアレイを選択することが重要です。最後に、EIMを使用すると、調査員は数秒で信じられないほどの量のデータを収集できますが、アーティファクトがないことを確認するために品質管理を適切に実行する必要があります。

EIM システムは、いくつかのレベルで高度にカスタマイズ可能です。ここで使用されるシステムは臨床および前臨床データ収集用...

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開示事項

S. B. Rutkoveは、臨床および研究用のインピーダンスデバイスを設計するMyolex、Inc.、およびここで使用されるmViewシステムに出資し、コンサルタントおよび科学アドバイザーを務めています。彼はまた、会社の取締役会のメンバーでもあります。同社はまた、S. B. Rutkoveが発明者として指名された特許取得済みのインピーダンス技術をライセンスするオプションを持っています。他の著者は、開示されているものを除いて、原稿で議論されている主題または資料に金銭的利益または金銭的対立を持つ組織または団体と他の関連する提携または財政的関与を持っていません。

謝辞

この作業は、チャーリーズ基金とNIH R01NS055099の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3DプリンターFormlabs Inc.フォーム2 デスクトップ3Dプリンター
3Dプリンター深セン Creality 3D Technology Co. LtdCreality Ender 3 V23Dプリンター
3M マイクロポア手術用テープフィッシャー19-027761および19-061655モデル1530-0および1530-1
3M TRANSPOREサージカルテープフィッシャー18-999-380および18-999-381モデル1527-0および1527-1
コネクターヘッダー垂直10 POS 1mm間隔Digi-Key(Sullinsコネクタソリューション)S9214-ND(SMH100-LPSE-S10-ST-BK)図2Aに表示されたラットのinvivoアレイ用のプラスチックスペーサー1mm穴
アプリケーターフィッシャー22-363-172
タルワックスフィッシャー NC9377103
脱毛剤NAIRNA軟化ベビーオイルデュ
モン #7b 鉗子ファイン科学ツールNo. 11270-20解剖に使用、 スタイル:#7b、 先端形状:湾曲、 先端:標準、 先端寸法:0.17 mm x 0.1 mm、合金/材質:イノックス、長さ:11 cm
電子デジタルキャリパーフィッシャー14-648-17腓腹筋の寸法を測定するために使用
エポキシ接着剤デュアルカートリッジ 4分間の作業寿命Devconシリーズ14265、モデル2217図2Aに示されているラットの生体内アレイで使用された接着剤
Ex vivo誘電体インピーダンスセルカスタムNA誘電体細胞は、Rutkove研究室で3Dプリントされました
Graefe鉗子ファインサイエンスツールNo.11051-10配置および調整する筋肉に使用、長さ:10 cm、先端形状:湾曲、先端:鋸歯状、先端幅:0.8 mm、先端寸法: 0.8 mm x 0.7 mm、合金/材料
バリカンAmazonNAWahl プロフェッショナルアニマル BravMini+
インピーダンス アニマルデバイスMyolexEIM1103mView システム - 動物研究で使用するための治験用電気インピーダンス筋電図装置
In vivo ニードルアレイカスタムNAAmbuの27G皮下針を使用したカスタムアレイ。建設は、Rutkove研究室の3Dプリンタを使用して完成しました
生体内表面アレイカスタムNA生体内表面アレイは、Rutkove研究室で印刷され、組み立てられました
イソフルランパターソン獣医用品07-893-8441 (NDC:46066-755-04)Pivetal - 250 mLボトル
不織布ガーゼフィッシャー22-028-5592 x 2インチ
ポリスチレン計量皿フィッシャーS67090A寸法(長さx幅x高さ):88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
カミソリ刃フィッシャー12-640を正しい寸法に切断するために使用され、片刃炭素鋼ブレード学生
ファインはさみファインサイエンスツールNo.91460-11剖に使用、ヒント:シャープシャープ、合金/材質:学生ステンレス鋼、鋸歯状:いいえ、先端形状:ストレート、刃先: 20 mm、長さ:11.5 cm、特徴:学生品質の
皮下針 27 G NeurolineAmbu745 12-50/24図2Aに表示されたラットの生体内アレイで使用される針
手術用ハサミ-シャープファインサイエンスツールNo.14002-13皮膚を切るために使用、 ヒント:シャープシャープ、合金/材質:ステンレス鋼、鋸歯状:いいえ、先端形状:ストレート、刃先:42 mm、長さ: 13 cm
TECA ELITEモノポーラ針電極Natus902-DMG50-S直径0.46mm(26G)。ブルーハブ
Teknova 0.9% 生理食塩水FisherS58151000 mL 滅菌済み
綿先端デン筋肉解

参考文献

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