このプロトコルでは、マイクロ流体チップに基づいて連続フローポリメラーゼ鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。ラボでの核酸分析のための簡単な方法を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、生体分子診断において重要な役割を果たしてきた標的遺伝子の増幅に用いられる従来の方法です。しかし、従来のPCRは温度変化効率が低いため、非常に時間がかかります。本研究では、マイクロ流体チップを用いた連続フローPCR(CF-PCR)システムを提案します。増幅時間は、異なる温度に設定されたヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を流すことで大幅に短縮できます。さらに、キャピラリー電気泳動(CE)は、陽性および偽陽性のPCR産物を区別するための理想的な方法であるため、DNA断片の効率的な分離を達成するためにCEシステムが構築されました。本稿では、自社構築のCF-PCR装置による大腸菌の増幅過程と、CEによるPCR産物の検出について述べる。その結果、大腸菌の標的遺伝子を10分以内に増幅することに成功し、核酸の迅速な増幅・検出に利用できることが示されました。
概要
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、特定のDNA断片を増幅するために使用される分子生物学的手法であり、それによって微量のDNAを数億倍に増幅します。臨床診断、医学研究、食品安全、法医学的識別などの分野で広く使用されています。PCRプロセスは、主に90〜95°Cでの変性、50〜60°Cでのアニーリング、72〜77°Cでの伸長の3つのステップで構成されています。 サーマルサイクリングはPCRプロセスの重要な部分です。しかし、従来のPCRサーマルサイクラーはかさばるだけでなく、非効率的でもあり、25サイクルを完了するのに約40分かかります。これらの制限を克服するために、マイクロ流体チップをベースにした連続フローPCR(CF-PCR)システムが社内で構築されました。CF-PCRは、異なる温度のヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を駆動することにより、時間を大幅に節約できます1,2,3,4,5。
キャピラリー電気泳動(CE)は、高分解能、高速、優れた再現性6,7,8,9,10,11など、多くの利点があるため....
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プロトコル
注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. CF-PCRマイクロ流体チップの作製
- シリコンウェーハを200°Cで25分間加熱し、水分を除去します。
- ウェーハの1インチあたり1mLのSU-8-2075フォトレジストを分注します。スピンコーターを使用してシリコンウェーハ上で500rpmで5〜10秒間、100rpm/sの加速度でスピンし、次に2,000rpmで30秒間、500rpm/sの加速度でスピンします。
- シリコンウェーハを65°Cで3分間、次に95°Cで15分間ソフトベークします。
- フォトリソグラフィ装置の露光エネルギーを150〜215mJ/cm²に設定し、フォトリソグラフィマスクでフォトレジストにデザインしたパターンを彫刻します。シリコンウェーハとマスクを露光する準備をします。
- 露光後、シリコンウェーハを65°Cで2分間焼き、次に95°Cで7分間焼きます。
- シリコンウェーハを現像液に浸して余分なフォトレジストを除去し、マイクロチャネルが見えたら取り出します(図1)。イソプロパノールを使用して、....
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結果
図5は、PCR産物とDNAマーカーのエレクトロフェログラムを表しています。トレース(図 5A)は CF-PCR 増幅産物の CE 結果、トレース(図 5B)はサーマルサイクルで増幅した産物の CE 結果、トレース(図 5C)は 100 bp DNA ラダーの CE 結果です。まず、CF-PCRシステムで大腸菌の標的遺伝子を増幅しました。PCR溶液は、チップの入口から出口まで10~30秒かかりました。大腸菌の標的アンプリコンのサイズは544bpであった。増幅したPCR産物をCEシステムで分析し、100 bpのDNAラダーのCEも同じ実験条件で行いました。PCR産物のサイズは、DNAラダーのエレクトロフェログラムに従って評価できます。各実験は再現性のために3回行った。図5のデータは、大腸菌のP.......
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ディスカッション
PCRとCEはどちらも、核酸の分析において人気のある2つのバイオテクノロジーです。本稿では、自社で構築したCF-PCRシステムとCEシステムを用いた 大腸菌 の増幅とPCR産物の検出について述べる。 大腸菌 の標的遺伝子は、熱伝達率が高いため、10分以内に増幅することに成功しました。1,500 bp 未満の DNA 断片は 8 分以内に分離されました(図 5)。これら2つの技術の大きな利点は、従来のPCRおよびスラブゲル電気泳動法と比較して時間を大幅に節約できることです。研究者は、CF-PCRマイクロ流体チップは使用後に洗浄する必要があり、CEシステムはサンプルの汚染を避けるために清潔で黒い家に構築する必要があることを念頭に置く必要があります。本研究で紹介したマイクロ流体チップとCEシステムをベースにしたCF-PCRシステムは、製造が容易であり、ラボでの核酸分析のための簡便な方法を提供する可能性がある。しかし、CF-PCRの限界は、一度に1つのサンプルしか増幅および検出できないことであり、その幅広い用途が制限される可能性があります。これに対抗.......
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開示事項
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
謝辞
本研究は、中国上海市科学技術委員会(No.19ZR1477500、No.18441900400)の支援を受けて行われました。上海大学科学技術支援(No.2017KJFZ049)の助成に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100 bp DNAラダー | タカラバイオ(株) | 3422A | |
| 10倍速速バッファー I | タカラバイオ | RR070A | |
| 10x TBE | 北京ソーラーバイオサイエンス&テクノロジー株式会社 | T1051 | |
| 開発者ソリューション | Alfa Aesar、米国 | L15459 | |
| dNTP 混合物 (2.5 μM) | タカラバイオ(株) | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec社 ドイツ | MJB4 | |
| 光電子増倍管 | 浜松ホトニクス、日本 | R928 | |
| フォトレジスト | MicroChem、米国 | SU-8 2075 | |
| PID温度調節器 | 中国・上海 | XH-W2023 | |
| プラズマクリーナー | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| ポリビニルピロリドン(PVP) | アラジン、上海、中国 | P110608 | |
| ポンプ | ハーバード装置 | PHD2000 | |
| シリコーンチューブ | BIO-RAD,USA | ||
| 7318210固体リレー | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | タカラバイオ株式会社 | RR070A | |
| 鋼針 | zhongxinqiheng、蘇州、中国 | ||
SYBRグリーン | Solarbio、北京、中国 | SY1020 | |
| 温度 | センサーEasyShining Technology、成都、中国 | TCM-M207 | |
| テンプレート(大腸菌) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin、上海、中国 | T104863 | |
| 電圧電源 | アメリカ・ニューヨーク州メディナ | トレックモデル610E |
参考文献
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
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再版と許可
