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方法論記事

ラットの開腹脊髄損傷をモデル化するための低侵襲で高速な脊髄外側半断面技術

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DOI：

10.3791/63534

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2022年3月23日

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1Department of Conservative Dentistry, Faculty of Dentistry, Semmelweis University, 2Department of Oral Biology, Faculty of Dentistry, Semmelweis University, 3Centre for Translational Medicine, Semmelweis University, 4Department of Molecular Biology, Faculty of Medicine, Semmelweis University, 5Institute of Translational Medicine, Faculty of Medicine, Semmelweis University, 6Department of Anatomy, Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Semmelweis University

この記事について

サマリー

ここでは、椎弓切除術を排除するラットの開腹脊髄損傷をモデル化する新しい高速技術について説明します。側半切除は顕微鏡で見ながら行います。この技術は用途が広く、他の動物の脊髄の頸部、胸部、腰部にも使用できます。

要約

裂傷のような損傷をモデル化する開腹脊髄損傷技術は、椎弓切除術を伴うため、時間がかかり、侵襲的です。この新しい技術は、2つの棘突起を切除し、尾椎弓を持ち上げてから傾けることにより、椎弓切除術を排除します。手術領域は椎弓切除術を必要とせずに開きます。次に、側方半切除は、顕微鏡下で直接目に見える制御で行われます。外傷は最小限に抑えられ、小さな骨の傷だけで済みます。

この技術にはいくつかの利点があります:それはより速く、したがって、動物にとっての負担が少なく、そして骨の傷がより小さいです。椎弓切除術が排除されるため、脊髄に望ましくない損傷を与える可能性が低く、問題を引き起こす可能性のある骨の破片もありません(脊髄に埋め込まれた骨の破片は腫れや二次損傷を引き起こす可能性があります)。脊柱管は無傷のままです。主な制限は、半解剖が椎間腔でのみ実行できることです。

結果は、この技術が椎弓切除術(11分対35分)を使用した従来の外科的アプローチよりもはるかに速く実行できることを示しています。この手法は、広く適応可能であり、追加の特殊な機器を必要としないため、開放性脊髄損傷の動物モデルを扱う研究者にとって有用です。

概要

脊髄損傷(SCI)は、残念ながら人間に蔓延している損傷です。SCIは、感染症などによってさまざまな方法で複雑になる可能性があり、これらの損傷を研究することは臨床的に重要です1。SCIの唯一の明確な治療法は存在しないため、研究者の理解を深め、可能な治療法を前進させるためには、動物モデルが依然として必要です2,3。閉鎖性損傷は最も一般的にモデル化されますが(圧迫と挫傷)、開放性損傷でのみモデル化できる裂傷を理解することは臨床的に重要です4。離断または半切除を用いた開放創モデルは、傷害の性質(挫傷と外科的切傷)により、閉鎖傷害モデルと比較して創傷のより正確な局在を示すために使用できます。開放創実験は、制御され、信頼性が高く、再現可能な方法で、より特異的な神経損傷に光を当てることができます5。脊髄の完全または部分的な離断は、広く使用されている開腹創法であり、BrownとMartinezによる記事で詳細に見ることができます6。

ラットの開腹脊髄損傷を研究したとき、いくつかの動物は手術から生じた問題を示しました:椎弓切除術からの骨の破片が脊髄に埋め込まれて腫れを引き起こしました。大きな骨の傷は治癒するのに長い時間を必要としました。手術に時間がかかりすぎた。これらの問題を解消するために、別の外科的技術が開発されました。目標は、動物にとってより穏やかな、より速い技術を開発することでした。この新しく開発された技術は、従来のSCI技術よりもはるかに高速です。外科的アプローチは低侵襲であるため、椎弓切除術から生じる問題を排除しながら、骨の傷を小さくすることができます。

すべての開創手技は、硬膜7を開くことを含みます。最近のいくつかの研究では、以前の方法を改善することを目的として、さまざまな新しく開発された技術が検討されています8,9。この新しい技術を使用して硬膜の開口部を排除することはできませんが、脊髄の信頼性が高く制御された損傷を提供しながら、硬膜に小さな傷を引き起こします。脊髄損傷技術に関する文献を参照して、多くの著者は、元の技術にわずかな変更を加えることによって手術の時間を最小化しようとしました10。椎弓切除術は常にこれらの外科的処置の一部ですが、時間がかかり、より大きな骨創傷を作る必要があります6。この手術技術は、開放創脊髄損傷モデル、特に椎間腔で行われる完全離断または側方半切断を使用する研究者に適しています(図1)。

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プロトコル

すべての動物実験は、EU指令(2010/63/EU)に従って実施され、ハンガリー国家食品連鎖安全局の動物倫理委員会(PEI/001/2894-11/2014)によって承認されました。この研究では、動物の倫理的使用に関するすべての該当する機関および政府の規制が守られました。

1.手術前の準備

  1. 手順中に使用されるすべての器具を滅菌し( 材料表を参照)、手順の前に作業を行う表面を消毒します。
  2. 皮下抗生物質の単回投与を予防的に注射します。.
    注:抗生物質の投与量の詳細については、材料表を参照してください。
  3. 手術前に動物を手術室に1時間置いて順応させ、ストレスを軽減します。
  4. ケタミンとキシラジンの組み合わせの筋肉内注射でラットを麻酔します(ケタミン80 mg / kg体重(bw)およびキシラジン8 mg / kg bw)。
    注:麻酔に加えて、kエタミンとキシラジンの組み合わせは、この手順に十分な鎮痛を提供します。鎮痛レジメンは、施設の動物使用ガイドラインに従って変更できます。
  5. 処置中は加熱テーブルまたは赤外線を使用してラットを暖かく保ち、眼科用軟膏を使用して麻酔中は目を湿らせます(必要に応じて再塗布します)。
  6. 前足と後足、尻尾にサージカルテープを使用して手術台に固定し、怪我の部位によっては首にも固定します。必要に応じて、ラットを脳定位固定装置フレームに入れて、手術中にラットを安定させます。
  7. 滅菌外科用縫合糸を使用して、ラットの上部前歯の周りにループを配置し、これを手術台の端に固定します。
  8. 気道確保のために舌を横に引き出します。
  9. 背中の毛皮を、切開する場所の各方向に少なくとも2cm剃ります。
  10. ポビドンヨード溶液と滅菌ガーゼを使用して、手術部位の皮膚を少なくとも3回消毒します。周囲の毛皮を浸すように特に注意してください。滅菌ドレープで手術部位を固定します。
  11. 動物のつま先と尾をつまんで最初の切開を行う前に、麻酔の妥当性を評価します。処置全体を通して麻酔の妥当性を監視し続けます。

2.手術

  1. メスの刃20を用いて皮膚切開部を載置する。手術部位を開くには、脊椎に沿って2〜2.5cmの長さの切開を行い、皮膚のすべての層を切り裂きます。L1椎骨を中点として、この切開部を脊柱と平行に配置し、脊柱に沿って頭蓋方向と尾側の両方に~1cm延長させます。
  2. 筋肉を取り巻く結合組織を切断することにより、創傷の側面を動員します。
  3. 脊椎に沿って2つの平行な切開を行い、骨膜を貫通します。Th13椎骨とL1椎骨の間の距離にまたがって、両側の脊椎突起のすぐ隣に切開部を配置します。
  4. すべての脊椎靭帯が見えるまで、ラスパトリウムの助けを借りて椎骨に付着している筋肉を解剖します。リトラクターを設置します。
  5. 第13胸椎と第1腰椎の脊椎突起を歯科用骨鉗子で除去し、手術部位全体を可視化します。ここで、拡大(4倍〜16倍の倍率)顕微鏡画像を見ることによって手順を制御します。
  6. 必要に応じて、滅菌ガーゼを使用して、処置中の出血をコントロールします。
  7. L1脊椎突起の残りの部分を慎重に持ち上げ、L1椎弓を持ち上げます。脊髄にアクセスするために靭帯を切断します。尾側脊椎突起をさらに上げ、これも切断されている脊髄硬膜にアクセスできるようにします。尾側脊椎突起を頭蓋方向に傾けて、軟膜を視覚化します。
  8. 脊椎の正中線を示す後正中静脈を軟膜から探します。
  9. 静脈を二等分線として使用し、静脈を温存しながらマイクロサージェリーメスを使用して切開します。切開部を静脈の下、脊髄の前後直径を通る横面に置きます。脊髄の半分を切断するには、ブレードを中心線から横方向に動かします。
    注:切開は片側で、右側、4番目の 腰椎セグメントにあります。
  10. 前脊髄動脈を切らないように切開してみてください。脊髄を切断するときは、脊髄の腹側にある前脊髄動脈を温存するために、椎体に過度の圧力がかからないようにします。

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図1:ラットにおける新しいオープンSCI技術のステップを示すアートワーク。 (A)露出した椎骨。(B)脊椎突起の除去(Th13およびL1)。(C)L1椎骨の持ち上げられて傾いた椎弓。(D)片側半切除を行い、半切除した脊髄を別々に示し、ズームインした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

  1. 創傷閉鎖中は硬膜を直接閉じないでください。脊椎突起に沿って筋肉をしっかりと縫合し(縫合サイズ4-0)、硬膜の小さな傷を間接的に閉じます。
  2. 背側結合組織層を縫合糸で閉じます。
  3. 最後に、切開部位の周りの皮膚を縫合します。

3. 術後の経過観察

  1. 動物がケージの中で目覚めるのを許します。温度管理された部屋に加えて、ヒートランプを使用して動物を暖かく保ちます。手術後に目覚めたラットを放っておいたり、他のラットと一緒に同じケージに入れたりしないでください。
  2. 完全に目覚めるまで、少なくとも10分ごとに呼吸数を監視します。必要に応じて、麻酔からの覚醒を助けるために穏やかな刺激(頭をこするなど)を適用します。
  3. 動物が警戒し、適切に活動しているときは、安全に動物小屋に戻します。
  4. 手術後最初の24時間はラットを綿密な監視下に置きます。術後24時間後、実験が終了するまで少なくとも1日2回、動物をチェックし、苦痛の兆候を観察します。
  5. 関連する施設の動物福祉プロトコルを使用して、苦痛の兆候がないか1日1回徹底的に評価し、感染や炎症の兆候がないか傷口をチェックするために特別な注意を払ってください。
    注:ストレスと感染は、動物の福祉と実験の結果に影響を与えます。
  6. 実験が終了するまで、毎日抗生物質を皮下投与します。動物を無菌ケージに入れ、ケージごとに1匹ずつ飼育し、以前と同じように餌と水を 自由に与えます。実験の終了時(または実験期間中に重篤な副作用が観察された場合)に、関連する施設の動物福祉プロトコルに従って、動物を人道的に安楽死させます。
    注:ここでは、動物を安楽死させました(ケタミンとキシラジンの組み合わせによって誘発された深い睡眠で)、最初に生理食塩水灌流(1/3 mL / g bw)を投与し、続いて4%パラホルムアルデヒド灌流(1 mL / g bw)を投与しました。

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結果

半解剖後、ラットは同側後肢に麻痺を示します(半切除が成功したことのin vivo 証明)。徹底的な標本評価は、脊髄の除去後にのみ行うことができます( 図2を参照、除去された脊髄は腹側と背側の両方から見ることができます)。

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図2:半解剖後の切除した脊髄の腹側および背側図。切除した脊髄全体を腹側(A)と背側(B)から見たものを並べて示した。こ...

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ディスカッション

この低侵襲脊髄損傷法は、脊髄損傷ラットの研究中に開発されたもので、チームは手術自体から生じる問題に直面しました(椎弓切除術による骨の破片が圧迫を引き起こして脊髄を損傷する、手術に時間がかかりすぎる、大きな骨の傷の治癒が遅い)。椎弓切除術をなくすことで、手術ははるかに速くなり(11分対35分)、脊柱管の構造は損なわれず、骨の傷ははるかに小さくなり、脊髄を損傷する可能性のある骨の破片はありませんでした。

上部(頭蓋)棘突起の除去は、下部(尾側)棘突起を後方に傾けるために必要であるため、棘突起の除去を排除することはできない。下部棘突起の除去により、脊髄の視認性が大幅に向上し、半解が容易になります。

半切開は、プロトコルの最も重要な部分です。ここでは、半切除はフリーハンドで行われますが、これは前提条件ではありません。代わりに脳定位固定装置を使用できます。また、ラットを脳定位固定装置フレームに装着して、手術中に動物を安定させることもできる6。この手順では、ここで概説する手法を少し変更す...

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開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる競合する金銭的利害関係や個人的関係は知られていないと宣言しています。

謝辞

著者は、オリジナルのアートワークを提供してくれたGergely Ángyánに感謝します。この研究は、ハンガリーのブダペストにあるセンメルワイス大学から資金提供を受けました。この研究は、ハンガリーの人材開発運用プログラム(EFOP-3.6.2-16-2017-00006)の支援も受けました。センメルワイス大学のセラピーテーマ別プログラムの枠組みの中で、ハンガリーのイノベーション技術省のテーマ別エクセレンスプログラム(2020-4.1.1.-TKP2020)から追加の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オーグメンチン(1,000 mg / 200 mg粉末)グラクソ・スミスクライン、英国的皮下抗生物質の1回投与(アモキシシリン10 mgとクラブラン酸2 mg;オーグメンチン1,000 mg / 200 mg粉末)。.手術後毎日、動物1匹あたり10mgのアモキシシリンと2mgのクラブラン酸(オーグメンチン1,000mg / 200mg粉末)
BetadineEGIS、ハンガリーポビドンヨード溶液を使用して手術部位の皮膚を消毒
カリプソール(50mg / mL)リヒターゲデオン、ハンガリー<ストロング>麻酔:ケタミン80 mg / kgとキシラジン8 mg / kgの組み合わせを筋肉内
CP キシラジン 2% (20 mg/mL)Produlab Pharma B.V., the Netherlands麻酔: ケタミン 80 mg/kg とキシラジン 8 mg/kg の併用 筋肉内
歯科用骨鉗子デンテック、ハンガリーBS 012713th胸椎と 1st の棘突起を除去します 歯科用骨鉗子
歯科外科用マイクロモーターW&H, AustriaMF-TECTORQUE歯科外科用マイクロモーターを使用して、L1椎骨光学顕微鏡で椎弓切除術を行います
ツァイス、ドイツOPMI19-FC拡大(16倍倍)顕微鏡画像
生理食塩水(0.9%NaClゼニウス・カビ、ドイツ生理食塩水滴を使用して、麻酔全体を通してラットの目を湿らせてください(必要に応じて再適用)
ラスパトリウムデンテック、ハンガリーFK 1164ラスパトリウムの助けを借りて、すべての脊椎靭帯が見えるまで、椎骨に付着した筋肉を解剖します。
retractorDentech, HungaryRT 1253
scalpelDentech, HungaryBB 173
scalpelDentech, HungaryBB 184
scalpel blade 12B. Braun, Germany12
scalpel blade 20B. Braun, Germany20
sterile cut gauz 10 x 10 cmSterilux, Hartmann, Germany
縫合糸(モノフィラメント、合成、吸収性および非吸収性)、サイズ:4-0B.ブラウン、ドイツ
セット(13 cm)デンテック、ハンガリーBD 1555
ピンセット(繊細な組織鉗子)デンテック、ハンガリーBD 1670
予防します )を見て手順を制御しますフレピン

参考文献

  1. Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
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