バース症候群の迅速な診断のための質量分析による白血球中のカルディオリピンのフィンガープリント

サマリー

このプロトコルは、バース症候群の診断のために白血球カルジオリピンの質量分析学的「指紋」を得る方法を示す。増加したモノリソカルジオリピン対カルジオリピン比の評価は、100%の感度および特異性を有する対照心不全患者からバース症候群の患者を区別する。

要約

カルディオリピン(CL)は、その構造中に4つの脂肪酸鎖を有する二量体リン脂質であり、ミトコンドリアの脂質マーカーであり、内膜の機能に重要な役割を果たしている。その代謝産物モノリゾカルジオリピン(MLCL)は、動物細胞の脂質抽出物中に生理学的にほとんど存在せず、その外観は、乳児期に重度の心筋症を引き起こすまれでしばしば誤診される遺伝性疾患であるバース症候群(BTHS)の特徴である。ここで記載される方法は、「カルジオリピン指紋」を生成し、細胞脂質プロファイルにおけるCLおよびMLCL種の相対レベルの簡単なアッセイを可能にする。白血球の場合、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 - 飛行時間/質量分析(MALDI-TOF/MS) を介して MLCL/CL比を測定するために必要な血液はわずか1mLです。このアッセイは簡単で、臨床生化学研究所のルーチンワークに簡単に統合してBTHSをスクリーニングできます。この試験は、BTHSに対して100%の感度と特異度を示し、適切な診断試験となっています。

概要

バース症候群(BTHS)は、早期発症心筋症、骨格筋ミオパチー、成長遅延、好中球減少症、可変ミトコンドリア呼吸鎖機能障害、および異常なミトコンドリア構造^1、2、³、^4、5を特徴とするまれなX連鎖疾患である。BTHSの罹患率は100万人の男性につき1例で、現在世界中で知られている症例は250例未満ですが、この疾患が過小診断されていることは広く受け入れられています^2,6。BTHSは、染色体Xq28.12 ^7,8に局在するタファジン(TAFAZZIN)遺伝子の機能喪失変異から生じ、ミトコンドリアリン脂質カルジオリピン(CL)の欠損リモデリングを引き起こし、通常は高度に対称で不飽和なアシル組成物^9,10をもたらすプロセスである。CLはミトコンドリアのシグネチャー脂質と考え....

プロトコル

健康なドナーと心不全患者の血液サンプルはバーリのポリクリニック病院(イタリア)で収集され、BTHS患者のサンプルはブリストル王立小児病院(英国)の国民保健サービス英国BTHSクリニックで入手されました。健康なドナー、患者、および両親(適切な場合)の書面によるインフォームドコンセントと、それぞれの倫理委員会による承認が得られた。

注:すぐに使用しない場合、血液(K-EDTAゲルチューブ内)は4°Cで最大24〜48時間保存できます。

1. 赤血球(RBC)のデキストラン沈降による白血球の単離

1. 血液サンプル(K-EDTAで)を眼窩シェーカーに10分間入れて血液を混合する。
2. 1.5 mLチューブ中の0.9 mLの全血に、0.1 mLの20%デキストラン溶液(分子量>100 kDa、0.9%NaCl中)を加える。ピペットで懸濁液を20回穏やかに分散させ、チューブの上部にRBCを保持する気泡を避けます。赤血球を室温で約1時間沈降させる。
3. シリンジを使用して、黄色の上清を集めて15mLチューブに移し、次いで室温で400 x g で15分間遠心分離する(ブレーキなし、スイングバケットローター)。
4. 上清を捨て、主に白血球および残留赤血球を含むペレットを0.6mLの氷冷二重蒸留水(_ddH2O

結果

本研究では、1mLの全血から白血球を単離し、MALDI−TOF/MSによってCLフィンガープリンティングを得るための簡便かつ迅速な方法が記載されている( 図2参照)。 図3 は、対照被験者およびBTHS若年男子から得られた白血球の代表的なCLフィンガープリンティングをCLおよびMLCL質量(m / z)範囲で比較したものである。 表1は、 これらの質量スペクトルにおいて検出されたCLおよびMLCL種を列挙する。

TAFAZZIN遺伝子の欠陥は、典型的には、BTHSに特異的な脂質プロファイル、すなわち、CLフィンガープリントにおけるCLm形態の減少とともにMLCLおよびCLi形態の出現を決定する。対照対象の白血球の脂質プロファイルは、典型的には、CLmの2つの分子種のみを示す(図3の上パネル)。このマススペクトルに存在する唯一の関心のあるピークはCLm種で.......

ディスカッション

バース症候群は、先天的な代謝の誤りであり、過小診断される可能性が高い人生を変える状態である^{2,6。前述のように、直接的な診断テストの欠如が要因である可能性があります。ここでは、BTHSスクリーニングのために白血球中のMALDI−TOF/MSによってMLCL/CL比を測定するための簡便かつ迅速な方法が記載された。さらに、MALDI-TOF質量分析計は世界中の臨床検査室に広く普及しており、高い分析専門知識を必要としません31,32。}

現在の方法は、単離された白血球の総脂質プロファイル中のCLおよびMLCL種をMS分析の1回の実行で同時に検出することができ、HPLCを介した標準的な脂質抽出および分離の時間のかかるステップ を 回避できるという点で、既存のアプローチよりも大きな利点を有する。時間要因に加えて、ワークフロ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,1′,2,2′-テトラテトラデカノイルカルジオリピン	Avanti極性脂質	750332	MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,1′2,2′-tetra-(9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジ-(9Z-ヘキサデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン	Avanti Polar Lipids	878130	MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-リン酸	Avanti Polar Lipids	830845	MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジテトラデカノイル-スニセロ-3-ホスホ-(1′-rac-グリセロール)	Avanti Polar Lipids	840445	MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン	Avanti Polar Lipids	840033	MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
2-プロパノール、ACS試薬、≥99.5%	:メルクライフサイエンス
9-アミノアクリジン半水和物、98%	Acros Organics	134410010
アセトニトリル、ACS試薬、≥99.5%	:メルクライフサイエンス
クロロホルム、ACS試薬、≥99.8%	:メルクライフサイエンスS.r.l.
319988 Leuconostoc spp. Mr. 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF 質量分析計 Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
塩化カリウム、ACS 試薬、99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
塩化ナトリウム、ACS試薬、≥99.0%	:メルクライフサイエンス S.r.l.	S9888

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