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方法論記事

バース症候群の迅速な診断のための質量分析による白血球中のカルディオリピンのフィンガープリント

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DOI:

10.3791/63552

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2022年3月23日

 ,  ,  , 
1Medical School, Swansea University, 2Department of Basic Medical Sciences, Neuroscience and Sense Organs, University of Bari Aldo Moro

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、バース症候群の診断のために白血球カルジオリピンの質量分析学的「指紋」を得る方法を示す。増加したモノリソカルジオリピン対カルジオリピン比の評価は、100%の感度および特異性を有する対照心不全患者からバース症候群の患者を区別する。

要約

カルディオリピン(CL)は、その構造中に4つの脂肪酸鎖を有する二量体リン脂質であり、ミトコンドリアの脂質マーカーであり、内膜の機能に重要な役割を果たしている。その代謝産物モノリゾカルジオリピン(MLCL)は、動物細胞の脂質抽出物中に生理学的にほとんど存在せず、その外観は、乳児期に重度の心筋症を引き起こすまれでしばしば誤診される遺伝性疾患であるバース症候群(BTHS)の特徴である。ここで記載される方法は、「カルジオリピン指紋」を生成し、細胞脂質プロファイルにおけるCLおよびMLCL種の相対レベルの簡単なアッセイを可能にする。白血球の場合、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 - 飛行時間/質量分析(MALDI-TOF/MS) を介して MLCL/CL比を測定するために必要な血液はわずか1mLです。このアッセイは簡単で、臨床生化学研究所のルーチンワークに簡単に統合してBTHSをスクリーニングできます。この試験は、BTHSに対して100%の感度と特異度を示し、適切な診断試験となっています。

概要

バース症候群(BTHS)は、早期発症心筋症、骨格筋ミオパチー、成長遅延、好中球減少症、可変ミトコンドリア呼吸鎖機能障害、および異常なミトコンドリア構造1、2、3、4、5を特徴とするまれなX連鎖疾患である。BTHSの罹患率は100万人の男性につき1例で、現在世界中で知られている症例は250例未満ですが、この疾患が過小診断されていることは広く受け入れられています2,6。BTHSは、染色体Xq28.12 7,8に局在するタファジン(TAFAZZIN)遺伝子の機能喪失変異から生じ、ミトコンドリアリン脂質カルジオリピン(CL)の欠損リモデリングを引き起こし、通常は高度に対称で不飽和なアシル組成物9,10をもたらすプロセスである。CLはミトコンドリアのシグネチャー脂質と考えられており、そこでは内膜の重要な構成成分であり、酸化的リン酸化(すなわち、ミトコンドリアのエネルギー代謝)、スーパーコンプレックス形成、タンパク質輸入、およびミトコンドリア動態、ミトファジー、およびアポトーシスに関与する11、12、13、14、15、16.TAFAZZINの機能喪失時に、CLリモデリングが失敗し、BTHS患者のミトコンドリアに特異的なリン脂質異常が生じる:成熟CLレベル(CLm)が低下し、一方、モノリソカルジオリピン(MLCL)および変化したCLアシル組成物(すなわち、未成熟CL種、CLi)のレベルの増加が起こる。これにより、MLCL/CL比17が劇的に上昇します。

BTHSの診断は、障害が非常に可変的な臨床的および生化学的特徴を示し、同じ家族の罹患した個人間および時間の経過とともに患者内で異なる可能性があるため、しばしば困難である3,5。多くのBTHSの男の子は、3-メチルグルタコン酸(3-MGCA)の尿中排泄の非常に高いレベルを示していますが、尿中レベルは正常であるか、時間の経過とともに患者ではわずかにしか増加しません3。しかし、3-MGCAの増加は、3-メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ欠損症(AUH欠損症)、3-メチルグルタコン酸尿症、ジストニア - 難聴、脳症、リー様(MEGDEL)症候群、コストフ症候群、および運動失調症を伴う拡張型心筋症(DCMA)症候群などの、他の様々なミトコンドリアおよび非ミトコンドリア障害の特徴である18,19.したがって、BTHSのマーカーとしての3-MCGAの特異性が低く、患者のばらつきが大きいため、生化学的診断は曖昧になります。

さらに、120種類以上のTAFAZZIN変異が障害5 を引き起こすことが記載されているため、遺伝子診断は複雑で、遅く、高価になる可能性があります。さらに、TAFAZIN遺伝子の分子分析は、非コード配列または調節配列3における変異の存在において偽陰性の結果をもたらし得る。BTHSは、(モノリソ)CL種の相対量および分布を決定することによって明確に試験することができ、TAFAZZIN遺伝子シーケンシングによって、またはその逆によって確認することができる。

診断のための実用的なテストは、血液スポット20,21における高速液体クロマトグラフィー(HPLC)およびエレクトロスプレーイオン化/質量分析(ESI/MS)分析によるMLCL/CL比の測定である。CLレベルのみを測定することは、一部の患者がCLのほぼ正常レベルを有するがMLCL/CL比が変化しているため、診断には不十分である。したがって、MLCL/CL比の測定は、BTHS診断に対して100%の感度および特異度を有する21。白血球22では、HPLCおよびESI/MS分析に基づく別の検証方法がセットアップされていますが、以前に抽出された脂質を分離するための複雑なクロマトグラフィー技術と機器の高価さにより、この分析はいくつかの臨床検査室に限定されています。これらすべての要因は、簡単な診断テストの欠如とともに、状態の過小診断に寄与している。

MALDI−TOF/MSは、脂質分析23,24においてさらに有効なツールである。この分析技術は、様々な生物学的試料の脂質プロファイルを直接取得するために使用することができ、したがって、MSイメージングアプリケーション30のための組織切片を含む抽出および分離ステップ25、26、27、28、29をスキップする。この利点を考慮して、無傷の白血球中のミトコンドリアCLをMALDI−TOF/MSでプロファイリングすることによってBTHSを診断する簡単で迅速な方法が開発された28。赤血球沈降および溶解によるわずか1mLの全血からの白血球単離は簡単で、特別な装置または試薬を必要としない。さらに、微量の白血球に適用可能な高速脂質「ミニ抽出」プロトコルは、無傷の白血球から得られたものよりも高い信号対雑音比(S/N)を有するよりクリーンなMS信号を有するスペクトルの獲得の成功を保証することが記載された28。このさらなるステップは、ほとんど時間がかかりませんし、感度の低いMS機器で実施した場合でも分析を再現することができます。要約すると、ここで説明する分析方法は、時間と労力のかかるクロマトグラフィー脂質分離をスキップできるため、最小限のサンプル調製しか必要とせず、それによって試験をスピードアップします。

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プロトコル

健康なドナーと心不全患者の血液サンプルはバーリのポリクリニック病院(イタリア)で収集され、BTHS患者のサンプルはブリストル王立小児病院(英国)の国民保健サービス英国BTHSクリニックで入手されました。健康なドナー、患者、および両親(適切な場合)の書面によるインフォームドコンセントと、それぞれの倫理委員会による承認が得られた。

注:すぐに使用しない場合、血液(K-EDTAゲルチューブ内)は4°Cで最大24〜48時間保存できます。

1. 赤血球(RBC)のデキストラン沈降による白血球の単離

  1. 血液サンプル(K-EDTAで)を眼窩シェーカーに10分間入れて血液を混合する。
  2. 1.5 mLチューブ中の0.9 mLの全血に、0.1 mLの20%デキストラン溶液(分子量>100 kDa、0.9%NaCl中)を加える。ピペットで懸濁液を20回穏やかに分散させ、チューブの上部にRBCを保持する気泡を避けます。赤血球を室温で約1時間沈降させる。
  3. シリンジを使用して、黄色の上清を集めて15mLチューブに移し、次いで室温で400 x g で15分間遠心分離する(ブレーキなし、スイングバケットローター)。
  4. 上清を捨て、主に白血球および残留赤血球を含むペレットを0.6mLの氷冷二重蒸留水(ddH2O)に再懸濁する。
  5. 〜15秒後、0.2mLの0.6M KClを細胞懸濁液に加え、正しいオスモル濃度を回復させた。短い浸透圧ショックはRBCを溶解し、白血球をそのまま残します。最終容量を1x PBSで2.5mLに調整します。
  6. 懸濁液を室温で400 x g で15分間遠心分離します(ブレーキなし、スイングバケットローターなし)。上清を捨て、白血球ペレットを2.5mLの1x PBSで再度洗浄する。
  7. ステップ1.6のように遠心分離し、上清を捨てる。白血球を含むペレットを200μLの滅菌ddH2Oに再懸濁する。
    注:著者らの経験では、これは200μgから400μgの範囲のタンパク質含有量に相当する。
  8. 懸濁液を-80°Cで凍結するか、そのまま以下のように脂質抽出を行う。

2. 単離された白血球からの脂質の「ミニ抽出」

  1. 20 μLの白血球懸濁液(約20~40 μgのタンパク質)を1.5 mLチューブに移し、16,000 x g で30秒間スピンする。
  2. 上清を捨て、残りのペレットにCHCl3を10 μL加え、ピペットを繰り返して脂質抽出を促進した。
  3. 最後に、10 μL の 9-アミノアクリジン (9-AA) マトリックス溶液 (10 mg/mL 9-AA in 2-プロパノール/アセトニトリル、60:40 v/v) を CHCl3 のペレットに加えます。ピペットと分散を繰り返して混合する。
  4. CHCl3および9-AA中の脂質を含む溶液を16,000 x gで30秒間スピンさせ、次いで上清を0.35 μLの液滴として堆積させ(各サンプルについて3回の反復)、分析対象のMALDI標的(サンプルプレート)上に堆積させる(「乾燥液滴」堆積法)。
  5. 液滴を少なくとも10〜15分間空気乾燥させます。

3. マルディ-TOF/MSによる脂質分析

  1. MALDI-TOF質量分析計でサンプルの質量スペクトルを3連で取得します。
  2. 脂質標準物質( 材料表を参照)による校正後、分析をマイナスイオンモードに設定し、小分子分析用に検出 m/z 範囲を200Th~2,000Thの範囲に最適化します。
  3. レーザーフルエンスを(CLとMLCLの)閾値より5%高く保ち、S/N(少なくとも2)を得てください。
  4. 遅延パルス抽出を使用してリフレクターモードでスペクトルを取得します。各マススペクトルについて、平均2,000回のシングルレーザーショット(合計4 x 500)です。ゲート付きマトリックス抑制を400Thに適用して、検出器の飽和を防ぎます。

4. (MLCL + CLi)/CLm比の計算方法

  1. MALDI-TOF/MS 機器ソフトウェア( 材料表を参照)を実行して、取得したスペクトルを分析します。
  2. 「 開く 」コマンドを使用して、「スペクトラムブラウザ」ダイアログを開き、目的の スペクトラム を選択してロードします。
  3. メニューバーで、スムーズマススペクトルとマススペクトルベースラインの減算アイコンをクリックします。
  4. [ファイル> マススペクトル>エクスポート]をクリックし、スペクトルをデータポイントのペア(m / z(x)と強度(y))を含む2列のテーブルとしてエクスポートするためのASCII形式を選択します。座標をコピーしてスプレッドシート・プログラム (*.xls) に貼り付けます。
  5. 分析した各サンプルの 3 連に対して手順 4.2 ~ 4.4 を繰り返し、 図 1 (手順 1) に示すように、同じスプレッドシート プログラム ファイルに座標を貼り付けます。
  6. リストされている各種の図1(ステップ2)に示すx範囲に従って、SUM関数によってy1、y2、およびy3の値の合計(3連)を計算してピーク面積を取得します(図1;ステップ3)。
  7. AVERAGE関数による3連の面積値の平均を行う(図1;ステップ3)。
  8. 各種の平均面積値を 図1 に示すように欄に入れる(ステップ2)。
  9. 図1に示すようにCLm 72:7種の第1同位体のみを考慮するには、図1に示すように、CLm 72:8のM+2同位体とCLm72:7のモノアイソトピックピークとの重なりに対する同位体補正を計算する(ステップ4)。
  10. 最後に、 図1 に示すように(MLCL + CLi)/CLm比を計算します(ステップ5)。

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結果

本研究では、1mLの全血から白血球を単離し、MALDI−TOF/MSによってCLフィンガープリンティングを得るための簡便かつ迅速な方法が記載されている( 図2参照)。 図3 は、対照被験者およびBTHS若年男子から得られた白血球の代表的なCLフィンガープリンティングをCLおよびMLCL質量(m / z)範囲で比較したものである。 表1は、 これらの質量スペクトルにおいて検出されたCLおよびMLCL種を列挙する。

TAFAZZIN遺伝子の欠陥は、典型的には、BTHSに特異的な脂質プロファイル、すなわち、CLフィンガープリントにおけるCLm形態の減少とともにMLCLおよびCLi形態の出現を決定する。対照対象の白血球の脂質プロファイルは、典型的には、CLmの2つの分子種のみを示す(図3の上パネル)。このマススペクトルに存在する唯一の関心のあるピークはCLm種で...

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ディスカッション

バース症候群は、先天的な代謝の誤りであり、過小診断される可能性が高い人生を変える状態である2,6。前述のように、直接的な診断テストの欠如が要因である可能性があります。ここでは、BTHSスクリーニングのために白血球中のMALDI−TOF/MSによってMLCL/CL比を測定するための簡便かつ迅速な方法が記載された。さらに、MALDI-TOF質量分析計は世界中の臨床検査室に広く普及しており、高い分析専門知識を必要としません31,32。

現在の方法は、単離された白血球の総脂質プロファイル中のCLおよびMLCL種をMS分析の1回の実行で同時に検出することができ、HPLCを介した標準的な脂質抽出および分離の時間のかかるステップ を 回避できるという点で、既存のアプローチよりも大きな利点を有する。時間要因に加えて、ワークフロ...

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開示事項

すべての著者は、この研究は、潜在的な利益相反として解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない場合に実施されたと宣言しています。

謝辞

私たちの研究に参加してくださったBTHSの個人とその家族に感謝しています。我々は、バース症候群財団米国及びバース症候群UKトラストの支援及びブリストルでの年次総会における血液サンプルの採取を支援してくれたことに感謝します。この研究は、Barth Syndrome Foundation US、Barth Italia Onlus、およびApulia Regionから資金提供を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,1′,2,2′-テトラテトラデカノイルカルジオリピンAvanti極性脂質750332MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,1′2,2′-tetra-(9Z-octadecenoyl) cardiolipinAvanti Polar Lipids710335MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジ-(9Z-ヘキサデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンAvanti Polar Lipids878130MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-リン酸Avanti Polar Lipids830845MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジテトラデカノイル-スニセロ-3-ホスホ-(1′-rac-グリセロール)Avanti Polar Lipids840445MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリンAvanti Polar Lipids840033MALDI-TOFキャリブレーション用脂質標準
2-プロパノール、ACS試薬、≥99.5%:メルクライフサイエンス
9-アミノアクリジン半水和物、98%Acros Organics134410010
アセトニトリル、ACS試薬、≥99.5%:メルクライフサイエンス
クロロホルム、ACS試薬、≥99.8%:メルクライフサイエンスS.r.l.
319988 Leuconostoc spp. Mr. 450,000-650,000Merck Life Science S.r.l.31392
Flex Analysis 3.3Bruker DaltonicsSoftware
MALDI-TOF 質量分析計 Microflex LRFBruker Daltonics
Microsoft ExcelMicrosoft OfficeSoftware
OmniPur 10X PBS Liquid ConcentrateMerck Life Science S.r.l.6505-OP
塩化カリウム、ACS 試薬、99.0-100.5%Merck Life Science S.r.l.P3911
塩化ナトリウム、ACS試薬、≥99.0%:メルクライフサイエンス S.r.l.S9888
190764360457

参考文献

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