方法論記事

細胞トレーサー注入を用いてラット嚢状側壁モデルにおける新内膜形成細胞の起源を調査

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DOI：

10.3791/63580

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2022年3月16日

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1Department of Neurosurgery, Kantonsspital Aarau, 2Cerebrovascular Research Group, Department for BioMedical Research, University of Bern, 3Institute of Pathology Laenggasse, 4Department of Neurosurgery, Neurocenter and Regenerative Neuroscience Cluster, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern, 5Faculty of Medicine, University of Bern

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

我々は、内皮細胞を追跡するために一点親油性細胞トレーサー注射を行い、続いて動脈切除術および腹部ラット大動脈瘤の側壁動脈瘤の縫合を行った。新内膜形成は、脱細胞化動脈瘤における親動脈に依存しているように見え、重要な細胞が豊富な壁における動脈瘤壁細胞からの動員によって促進された。

要約

顕微外科的クリッピングは、頭蓋内動脈瘤への血流のその後の障壁を作り出すが、血管内治療は新内膜および血栓形成に依存する。新内膜の内腔内層を覆う内皮細胞の供給源は不明のままである。したがって、本研究の目的は、既に十分に確立されたヘルシンキラット顕微手術側壁動脈瘤モデルにおける細胞トレーサー注射後の新前頭腫形成細胞の起源を調査することであった。

側壁動脈瘤は、雄ルイスラットにおいて大動脈に脱細胞化または重要な動脈パウチをエンドツーサイドに縫合することによって作成された。動脈瘤縫合糸による動脈切除の前に、CM-Dil色素を含む細胞トレーサー注射をクランプされた大動脈に行い、隣接する血管内の内皮細胞を標識し、フォローアップ(FU)中のそれらの増殖を追跡した。処理に続いてコイリング(n=16)またはステント留置(n=15)を行う。FU(7日間または21日間)で、すべてのラットを蛍光血管造影を受け、続いて動脈瘤採取および特定の関心領域の免疫組織学的細胞数による巨視的および組織学的評価を行った。

31の動脈瘤のいずれも、追跡調査で破裂していなかった。4匹の動物が早死にしました。巨視的に残留した灌流は、75.0%コイル状および7.0%のステント留置ラットにおいて観察された。細胞トレーサー陽性細胞の量は、7日目の血栓(p = 0.01)および21日目の新内膜(p = 0.04)に関して、コイル状動脈瘤と比較して脱細胞化ステントで有意に上昇した。重要な動脈瘤における血栓または新内膜に有意差は認められなかった。

これらの知見は、ステント留置動脈瘤と比較してコイル状の治癒パターンが悪化していることを確認している。新内膜形成は、脱細胞化動脈瘤における親動脈に特に依存するようであるが、重要な細胞が豊富な壁における動脈瘤壁細胞からの動員によって支持される。翻訳の面では、ステント治療は高度に変性した動脈瘤にはより適切かもしれないが、コイリングのみでは、ほとんどが健康な血管壁を有する動脈瘤に適切であるかもしれない。

概要

頭蓋内動脈瘤(IA)の破裂によって引き起こされるくも膜下出血は、高い罹患率および死亡率に関連する壊滅的な神経外科的状態である1、2、3、4。内皮と内皮の直接接触を提供する顕微手術クリッピングに加えて、血管内デバイスは、破裂したIAおよび偶発的に発見されたIAを治療するために、過去数十年にわたって重要性を増しています。血管内治療されたIAにおける治癒応答は、主に新内膜形成および血栓組織に依存する。どちらも相乗的なプロセスであり、隣接する血管および動脈瘤壁からの細胞遊走に依存する。5今日まで、血管内処置動脈瘤の新内膜形成における内皮細胞の起源は不明のままである。新内膜形成細胞がリクルートされる源について、文献で進行中の議論がある。

ラットの腹部大動脈にCM-Dir色素を細胞トレーサー注射( 材料表参照)することにより、2つの異なるFU時点(7日目と21日目)での新内膜形成における親動脈を起源とする内皮細胞の役割を解析することを目指しました(図1)。このモデルの利点は、動脈瘤縫合前の親動脈 におけるインビボでの 直接局所細胞トレーサーインキュベーションであり、後の時点でのFUを可能にする。細胞トレーサーインキュベーションなどの インビボ 注射技術は、文献には記載されていない。この技術の利点は、直接、一点、術中、 インビボ 注射であり、モデルを堅牢で再現性のあるものにする。

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プロトコル

獣医支援は、機関のガイドラインに従って実施された。実験はスイスの地方倫理委員会(BE 60/19)によって承認された。ARRIVEガイドラインと3Rの原則は厳密に守られています6,7。生後12週、体重492±8gの31匹の雄ルイスラットが含まれていた。すべてのラットを23°Cの室温で12時間の明暗サイクルで飼育する。水とペレットへの無料アクセスを提供します。統計解析は、ノンパラメトリックなウィルコクソン-マン-ホイットニーU検定を用いて行われている。≤0.05および/または≤0.01の確率値(p)は有意であると考えられた。

1.術前期 - 一般的な準備と麻酔学的側面

  1. ラットをコイルまたはステント治療群のいずれかにランダム化(図2)し、ウェブベースのランダム化システムを使用します。次に、23±3°Cの室温を維持する静かで無菌の手術室の隣に手術を計画しているすべての動物の術前臨床検査を行う。 動物の行動を分析し、術前臨床検査の一環として粘膜とターガーを検査します。
  2. 各動物の体重を記録します。
  3. 手術前に、ドナーラット由来の動脈嚢を0.1%ドデシル硫酸ナトリウム中で37°Cで10時間インキュベートし、脱細胞化動脈瘤8を得た。手術の数日前にドナー動物からこれらの袋を収集します。
    1. 腹部大動脈の全長をマイクロハサミおよび鉗子で準備し、3〜4mmの間隔で6〜0個の非吸収性合字を適用する。
    2. ドナー動物の胸部から予め結紮した動脈血管パウチにより術中に重要な動脈瘤を直接生成する9。示されたFU時点ではさみおよび外科用鉗子で開胸術を行い、所望の長さで血管パウチを結紮する。
  4. パウチをレシピエントに直接移植し、ドナー動物から動脈瘤を採取して、さらなる巨視的分析および組織学的処理を行う。
  5. 麻酔誘導のために、5〜10分後に意識を失うまで、酸素(O2)を備えたクリーンボックスにすべてのラットを置く。フェンタニル0.005mg / kg、メデトミジン0.15mg / kg、およびミダゾラム2mg / kgの混合物の皮下(SC)注射でラットを麻酔する。
    注:これにより、少なくとも45分の手術面が保証されます。
  6. ペダル離脱反射の不在により麻酔の深さを確認する。
  7. ラットを仰臥位に置き、胸腹部を電気シェーバーで剃る。
  8. ラットの4本の足をボード上のテープで固定し、自動調節直腸プローブに接続された加熱パッドで覆われた。ラットの肛門に直腸プローブを挿入し、加熱パッドの助けを借りて37°Cの所望の温度を維持する。
  9. 次に、コンピュータ化されたシステムに接続された右後肢にセンサーを設置し、バイタルサインを術中にチェックします。
  10. ラットの鼻と口をフェイスマスクで覆います。長期間の麻酔が必要な場合は、イソフルラン(1.0〜2.0%滴定して100%O2で効果を発揮する)を開始します。
  11. ポビドンヨードまたは交互の消毒剤で手術野を消毒し、手術野を滅菌方法でドレープする。
  12. 麻酔周囲ケアのために、滅菌眼科用潤滑剤を眼に塗布し、不透明なホイルマスクでそれらを覆い、外科用ランプからの乾燥および損傷を防止する。
  13. 手術中は、フェイスマスクを介して継続的に酸素を供給し、体温を監視し、加熱パッドを使用して熱を供給し、正常熱を維持します。
  14. 他のバイタルサイン(脈拍と呼吸の膨満、心臓と呼吸数、酸素飽和度)を継続的に監視します。

2.手術期 - 細胞 - トレーサー注入

注:ヘルシンキラット顕微手術側壁動脈瘤モデル9 における詳細な外科的アプローチおよびコイルおよびステント移植のための技術は、他の場所8、10、11に記載されている。

  1. 蛍光親油性細胞トレーサーを≤-20°Cで常時保管し、光から保護する。
  2. ラット大動脈および騎手静脈を準備し、続いて両方の分離、ならびに大動脈の近位および遠位一時クランプを調製することによって手術を行う。
    注: この手法については、以前にも説明しました9.
    1. 大動脈の近位部と遠位部を2つの一時的なタイタンクリップでクランプします。
  3. 動脈のよりよい視覚化のために大動脈の近位および遠位部分の下にそれぞれ紫色のパディングが付いている1つのマイクロスワブを置く。
  4. 今、濡れたガーゼで腹部を保護します。
  5. 手術当日、2 μLの細胞トレーサーを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にピペッティングして溶解する。
  6. 混合物を、27-1/2 G(0.4 x 13 mm)の滅菌カニューレを取り付けた1mLシリンジに移す。
    メモ: 手順 2.5 および 2.6 の実行中は、光が当たらないように注意してください。
  7. 手術室の照明を消します。顕微鏡下を見ながら、マイクロ鉗子を用いて大動脈の中央腹部に一点注射を行い、ヘパリン処理した0.9%生理食塩水1mLを注意深く注入する。
  8. 細胞トレーサーを慎重に注入し (ビデオ1)、 すぐに手術用顕微鏡の電源も切ってください。再び、濡れたガーゼで腹部を保護します。
  9. 染料を少なくとも15分間インキュベートさせます。潜伏期間の後、顕微鏡と手術室の照明をオンにします。
  10. 動脈瘤の縦動脈切除術および縫合を、他の箇所11に記載されているように行う。
    1. 微小鉗子とマイクロハサミを使用して動脈切除術を行い、その長さが収穫された動脈瘤の直径の平均になるようにします(ステップ1.3)。正しい長さを確保するために、動脈瘤を大動脈の横に置いてから関節切除術を行います。非吸収性の10-0縫合糸を用いて8〜10本のシングルステッチで動脈瘤を縫合し、ヘパリン化生理食塩水で遠位的に開始する一時的なクランプを慎重に除去する。傷口を層状に閉じます。注目すべきは、1cmのコイルパッキング密度を使用してください。
      注:コイルまたはステント注入の技術は、他の場所8,10で説明されています。

3.術後フェーズモニタリングと鎮痛ケア

  1. 手術の終わりに、ブプレノルフィン0.05mg / kg、アチパメゾール0.75mg / kg、およびフルマゼニル0.2mg / kgのSC注射混合物で麻酔を逆転させる。手術を受けた各動物を清潔なケージに入れ、完全に目を覚まし、必要に応じて加熱ランプで暖めるまで回復させます。
  2. 3日間、1mg / kgメロキシカム(1日1回の注射または経口適用)およびブプレノルフィン(0.05mg / kgを1日4回)SCを投与し、一晩、同じ用量で飲料水中にブプレノルフィンを連続的に提供する:6mLブプレノルフィン0.3mg / mL、360mL飲料水、10mLの5%グルコース。
  3. 術直後の段階では、保護のために各動物を1つのケージに入れてください。24時間後に動物を再編成する。
  4. ラットがSC注射後に苦痛または攻撃的な行動を示す場合は、日中飲料水中にブプレノルフィンを投与する。
  5. ケージの床に柔らかい飼料を提供し、術後の摂食と回復をサポートします。
  6. 健康状態と痛みのスコアシートに従ってすべての動物を観察し、世話をしてください。
  7. 必要に応じて、レスキュー鎮痛SC(メロキシカム1mg / kgおよび0.05mg / kgブプレノルフィン)を投与する。

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結果

合計31匹の動物が実験室の設定に含まれた:27匹のラットが最終的な統計分析に含まれた。4匹のラットが早死にした(死亡率12.9%)。術中、呼気膨満は、コイル処理(13.5μm±0.6)ラットと比較して、ステント(12.9μm±0.7)において有意に減少した(p = 0.03)。蛍光血管造影は、最終FUの終了時にラットごとに実施した。再灌流は6匹のコイル処理動物すべてで示されたが、再灌流は8匹のステント処理動物のうちわずか12.5%で観察された。

7日目と21日目のプールされたベースライン動脈瘤体積は、コイルまたはステント治療群間で有意に異ならなかった(脱細胞化(p = 0.9)動脈瘤でも生命性(p = 0.1)動脈瘤でも)。脱細胞化動脈瘤のプールされたFU容積は、ステント留置動脈瘤(p = 0.28)と比較してコイル状動脈瘤において有意でない動脈瘤成長を示し、ステント留置群よりも有意に大きい(60.1mm3±31.1mm3対20.5mm3±<...

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ディスカッション

この研究は、新内膜形成が動脈瘤複合体の親動脈を起源とする内皮細胞を介して媒介されるが、重要な動脈瘤における動脈瘤壁に由来する細胞の動員によって支持されることを実証する。それにもかかわらず、動脈瘤治癒における循環前駆細胞の役割は依然として議論の余地がある12,13。全体として、31匹の雄ルイスラットがこの調査に含まれていた。早死にしたのはわずか4人(死亡率12.9%)。

その後の内皮間接触を促進する外科的クリッピングとは対照的に、血管内治療の成功は遅延した生物学的応答に依存する。流れ転換、生理活性血管内デバイス、または管腔内細胞ベースの療法などの新しく開発された技術は、血管内治療デバイス14、15に関して注目に値する。この文脈において、成功した動脈瘤根絶における治療の成功は、動脈瘤壁自体からの生物学的応答と相加的に関連していることを示す証拠

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開示事項

著者らは、提示された研究の設計と実施について単独で責任を負い、競合する利益を宣言しません。

謝辞

著者らは、長期の動物衛生の献身的な監督に対して、Alessandra Bergadano、DVM、PhDに感謝している。この研究は、研究評議会、カントンスピタル・アーラウ、アーラウ、スイス、スイス国立科学財団SNF(310030_182450)の研究資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-0 吸収性縫合糸Ethicon Inc., USAVCP428G
4-0 非吸収性縫合B. Braun, ドイツG0762563
6-0 非吸収性縫合糸B. Braun, ドイツC0766070
9-0 非吸収性縫合糸B. Braun, GermanyG1111140
AtipamezolArovet AG, Switzerland
バンドパスフィルター青ThorlabsFD1B他の
バンドパスフィルター緑ThorlabsFGV9
バイポーラ鉗子他の
自転車スポットライト他の
ボード(20 x 10 cm)他の
BuprenorphineIndivior、スイス1014197
カメラSony NEX-5R, Sony Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)any other
Cell count softwareImage-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dyeThermoFisher SCIENTIFIC, USAC7000
Coil-DeviceStyker,カラマズー、ミシガン州、米国2 cm の Target 360 TM Ultra、直径 2 mm
その他の
Eye-lubricant他の
FentanylSintetica、S.A.、スイス98683ジェネリック
FlumazenilLabatec-Pharma、Switerzland
FluoresceineCuratis AG5030376汎用
蛍光顕微鏡リンパスBX51、ハンブルク、ドイツ;Cell Sens Dimension Imagingソフトウェアv1.8
ルマスク他の
グルコース(5%)他の
加熱パッド恒温制御ユニット、ハーバード大学、エデンブリッジ、イギリス
等張性塩化ナトリウム溶液(0.9%)ゼニウスKABI336769任意のジェネリック
イソフルラン任意の一般的な
Longuettes、他の
メロキシカム、ベーリンガーインゲルハイム、P7626406、任意の一般的な
メデトミジン、ビルバック、スイスQN05CM91
マイクロニードルホルダー、その他の
ミダゾラムロシュ、スイス
のモニタリングシステムStarr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
ニードルホルダーその他
O2-Face マスク
手術用顕微鏡OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germanyその他
その他の直
腸温プローブその他の
スキャルペル、スワン・モートン、210その他の
小動物、シェーバーその他の
スマートフォン、その他の
ドデシル硫酸ナトリウム(0.1%)、シグマ・アルドリッチ11667289001
、ソフトフィードエメレイド、雑食動物、任意の汎用
ソフトティッシュ鉗子他の
任意の軟部組織スプレッダー、他の
任意のステンレス鋼スポンジボウル、任意の他の
ステントデバイスBiotroni、Bülach、スイスのマグマリス装置、ポリマーコーティングを施したAMS、長さ6mm、直径2mm
の滅菌マイクロスワブ他の
ストレートおよび湾曲したマイクロ鉗子
ストレートおよび湾曲したマイクロハサミ他の
ストレートおよび湾曲した鉗子他の
手術用ドレープその他の
外科用ハサミその他の
シリンジ 1 mL、2 mL、5 mLその他の
テープその他の
血管クリップ アプリケーターB. ブラウン、ドイツFT495T
Yasargil titan 標準クリップ (2x)B. Braun Medical AG、Aesculap、スイスFT242T一時
糸 他の 消毒 オホイその他のフレ その他 酸素 、、、 他の 的

参考文献

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