成体涙腺(LG)幹細胞の三次元無血清培養法は、LGオルガノイドの形成および腺房または腺管様細胞への分化の誘導のために十分に確立されている。
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この記事について
サマリー
要約
涙腺(LG)幹細胞ベースの治療は、涙腺疾患のための有望な戦略です。しかしながら、十分な数のLG幹細胞(LGSC)を得るための信頼性の高い無血清培養方法の欠如は、さらなる研究および応用のための1つの障害である。成体マウスLGSCsの三次元(3D)無血清培養法は十分に確立されており、ここに示されている。LGSCsを連続的に継代し、腺房または乳管様細胞に分化誘導することができた。
LGSC初代培養のために、6〜8週齢のマウスからのLGsを、ディスパーゼ、コラゲナーゼI、およびトリプシン−EDTAで消化した。合計1個×104個の単一細胞を、24 ウェルプレートの各ウェル中のマトリックスゲル涙腺幹細胞培地(LGSCM)マトリックス80μLに播種し、20μLのマトリックスゲルLGSCMマトリックスでプレコートした。この混合物を37°Cで20分間インキュベートした後に固化し、LGSCMを600μL添加した。
LGSC維持のために、7日間培養したLGSCsを、ディスパーゼおよびトリプシン−EDTAによって単一細胞に脱凝集させた。この単一細胞を移植し、LGSC初代培養に用いた方法に従って培養した。LGSCは40回以上継代することができ、ステム/前駆細胞マーカーKrt14、Krt5、P63、およびネスチンを連続的に発現することができる。LGSCMで培養されたLGSCCは自己複製能を有し、インビトロおよびインビボで腺房または乳管様細胞に分化し得る。
概要
涙腺幹細胞(LGSC)は、涙腺(LG)細胞の再生を維持し、腺房および乳管細胞の供給源である。したがって、LGSC移植は、重篤な炎症性損傷および水性欠損ドライアイ疾患(ADDED)1、2、3を治療するための代替的アプローチと考えられている。Tiwariらは、コラーゲンIおよびいくつかの成長因子を添加したマトリックスゲルを用いて初代LG細胞を分離および 培養した。しかしながら、LG細胞を連続的に培養することができなかった4。二次元(2D)培養を用いて、マウスLG由来幹細胞を、Youら5 およびAckermannらによって単離した。図6から、幹/前駆細胞マーカー遺伝子、 Oct4、 Sox2、 Nanog、および ネスチンを発現することが見出され、継代培養することができた。しかしながら、これらの細胞が腺房細胞や乳管細胞に分化しうるという明確な兆候はなく、 生体内での分化能を検証する移植実験もない。
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プロトコル
このプロトコルのすべての実験は、Sun Yat-sen Universityの動物実験に関する倫理委員会の動物ケアガイドラインに従っていました。すべてのセル関連操作は、セル操作室の超クリーンワークベンチで実行されます。キシレンを使用するすべての操作は、ヒュームフード内で行われるべきである。
1. LGSCの初代文化
- LG電子絶縁
- 生後6〜8週のBALB/cオスマウスを入手し、耳の後ろの皮膚を切ってLGとその周りの結合組織を露出させます。ピンセットの助けを借りて鈍い解剖によって結合組織を剥がし、LGを除去します。
- LGを4 mLの滅菌10 mM PBS溶液で2回すすぎ、6 cmディッシュ内の血液を除去します。LGsを6cmの皿に4mLの75%エタノールで10秒間浸漬し、直ちに10mM PBSで2回すすいでください。
- LG電子の単一セルを取得する
- HEPES緩衝液(50 mM Hepes/KO、pH 7.4;超純水中の150 mM NaCl)を使用して、25 U/mLのディスパーゼを調製する。超純水で0.1%コラゲナーゼI溶液を調製した。
- LGsを小さな断片(約1mm3)に切断し、滅菌した15mL遠沈管に移し、500μLの25U/mLディスパーゼおよび500μLの0.1%コラゲナーゼI....
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結果
3D無血清培養システムの確立
本研究では、マウスLGSCs用のEGF、Wnt3A、FGF10、Y-27632を含むLGSCMを開発し、3D培養法によるLGSCCsの単離・培養に成功しました(図1A)。この方法を用いて、C57BL/6マウス、NOD/ShiLtJマウス、BALB/cマウス、およびROSA26mT/mG マウスからのLGSCの3D無血清培養系が成功裏に確立されました16。雄マウスの場合、解離により2つのLGsから1.5-2×106 個の細胞が得られた。1週間の培養後、培養開始時に1〜104 個のLG細胞を播種すると、30〜60個のスフィ×が形成された。また、この方法で培養した細胞は、Epcam、Krt5、Krt14、P63、ネスチン、その他の幹細胞マーカー16を発現し、得られた細胞がLGSCの性質を有していたことを示しており、Krt14およびKi67は、LGSCsを7.......
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ディスカッション
涙腺幹細胞培養およびLG傷害修復のための涙腺幹細胞の単離および体外培養のための十分に確立された方法がある。Shatos et al.17 および Ackermannet al.6ラット及びマウスの涙道幹細胞をそれぞれ2D培養法により培養及び継代培養することに成功し、ADDの治療のために涙道幹細胞を移植することが可能となった。2Dで培養されたLGsの幹細胞18および間葉系幹細胞19,20に関する研究は、これらの細胞の移植がADDの症状をある程度緩和できることを示した。蛍光活性化細胞選別による、Gromovaら。マウスLGsからLG前駆細胞マーカーを発現する幹細胞を2個選択し、インビトロでダクトやアシニに分化させ、成体幹細胞のLGsの機能細胞への分化に成功しました。.......
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開示事項
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学財団(第31871413号)と広東省科学技術の2つのプログラム(2017B020230002と2016B030231001)からの助成金によって支援されました。研究中に私たちを助けてくれた研究者と、動物ケアのサポートのために動物センターで働くスタッフに本当に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 動物(マウス) | |||
| Bal B/C | 南京大学 | ||
| C57 BL/6J | 中山大学 | ||
| NOD/ShiLtJ | 南京大学 | ||
| ROSA26mT/mG | 南京大学 | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | ザルトリウス | ||
| 自動脱水機 | サーモ | ||
| 血液計数チャンバー | BLAU | ||
| セルカウンター | CountStar | ||
| CO2恒温インキュベータ | サーモ | ||
| ECLゲルイメージングシステム | GEヘルスケア | ||
| 水浴用電気浴 | Yiheng Technology | ||
| 電気泳動装置 | BioRad | ||
| 蛍光定量PCR装置 | ロシュ | ||
| 凍結組織スライサー | レシア | ||
| 横型遠心分離機 | CENCE | ||
| 倒立型蛍光顕微鏡 | ニコン | ||
| 倒立顕微鏡 | オリンパス | ||
| レーザーラメラ走査型顕微鏡 | カールツァイス | ||
| 液体窒素容器 | サーモ | ||
| 低温 高温速度遠心分離機 | エッペンドルフ | ||
| マイクロピペッター | ギルソン | ||
| 電子レンジ | パナソニック | ||
| ナノドロップ 紫外線分光光度計 | サーモ | 測定 RNA濃度 | |
| パラフィンスライシングマシン | サーモ | ||
| PCRアンプ | エッペンドルフ | ||
| pH値テスター | ザルトリウス | ||
| 4 °C冷却装置 | ハイアール | ||
| のサーモスタットの文化の発振器 | ZHICHENG | ||
| ティッシュ パラフィンの包埋器 | 械Thermo | ||
| -80°C 超低温冷蔵庫 | サーモ | ||
| -20°C 超低温冷凍機 | サーモ | ||
| 超純水製造装置 | ELGA | ||
| u>試薬 | |||
| 動物実験 | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Σ | 14158-65-7 | |
| ペントバルビタール ナトリウム Σ | 57-33-0 | ||
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| コラゲナーゼ I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| マウス Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| マウス Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| マウス EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| トリプシン阻害剤 (TI) | < | T6522 | プシン、キモトリプシン、およびプラスミナーゼをより少ない程度で阻害できます。1 mgは1.0〜3.0 mgのトリプシンを阻害します。. |
| トリプシン | シグマ | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE染色 &免疫染色 | |||
| Alexa Fluor 488ロバ抗マウスIgG | サーモ | A-21202 | 使用希釈:IHC)2 μg/mL, (IF) 0.2 &μ;g/mL |
| Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ IgG | サーモ | A-21206 | 使用希釈: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 &μ;g/mL |
| Alexa Fluor 568 ロバ抗マウス IgG | Thermo | A-10037 | 使用希釈: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 &μ;g/mL |
| Alexa Fluor 568 ロバ抗ウサギ IgG | Thermo | A-10042 | 使用希釈: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| 抗 AQP5 ウサギ抗体 | Abcam | ab104751 | 使用希釈率: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 &μ;g/mL |
| 抗E-カドヘリンラット抗体 | アブカム | ab11512 | 使用希釈率: (IF) 5 μg/mL |
| 抗ケラチン14ウサギ抗体 | Abcam | ab181595 | 使用希釈率:(IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 &μ;g/mL |
| 抗Ki67ウサギ抗体 | アブカム | ab15580 | 使用希釈率:(IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 &μ;g/mL |
| 抗 mCherryマウス抗体 | Abcam | ab125096 | 使用希釈率: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 &μ;g/mL |
| 抗mCherryウサギ抗体 | Abcam | ab167453 | 使用希釈率: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| クエン酸 | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB キット (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| 蛍光マウントミディア | ダコ | S3023 | |
| ホルマリン | サンゴン バイオテック | A501912-0500 | |
| ヤギ抗マウス IgG 抗体 (HRP) | アブカム | ab6789 | 使用希釈: 2 μg/mL |
| ヤギ抗ウサギIgG抗体(HRP) | Abcam | ab6721 | 使用希釈率:2 &μ;g/mL |
| ヘマトキシリン | BASO | 517-28-2 | |
| ヒストゲル(埋め込みヒドロゲル) | サーモ | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | 広州化学 | KD10 | |
| 30% 過酸化水素溶液 | 広州化学 | 7722-84-1 | |
| メタノール | 広州化学 | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| ニュートラルバルサム | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| 非免疫ヤギ血清 | BOSTER AR0009 | ||
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| パラホルムアルデヒド | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物 | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| ショ糖 | 広州化学 | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. 化合物 | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| TritonX-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| アルコール | 広州化学 | 64-17-5 | |
| クロロホルム | 広州化学 | 865-49-6 | |
| エチジウムブロマイド | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| イソプロピルアルコール | 広州化学 | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR グリーン I マスターミックス | ロシュ | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT マスターミックス | TOYOBO-Taq | ||
| DNAポリメラーゼ | タカラ | R10T1 | |
| Goldview (核酸染色) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction &細胞トランスフェクション | |||
| 寒天 | OXID | - | |
| アンピシリン | Sigma | 69-52-3 | |
| クロラムフェニコール | Sigma 56-75-7 | ||
| エンドトキシンフリープラスミド抽出キット | Thermo | A36227 | |
| カナマイシン | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 プラスミドトランスフェクションキット | Thermo | L3000015 | |
| LR 反応キット | Thermo | 11791019 | |
| プラスミド抽出キット | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5αケミカルコンピテントセル | TRANSGEN | CD201-01 | |
| トライトン | OXID | 酵母 | |
| エキス | OXID | - | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F:CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCCCATCCCCCC | Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCCTCCCT | Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGGagg R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC | Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT | Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA | Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT | Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC | Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 レンチウイルス無負荷ベクター | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin 研究室, 中山大学 |
参考文献
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al.
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