方法論記事

発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

DOI：

10.3791/63586

⸱

2022年4月21日

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology, The George Washington University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、脊椎動物 アフリカツメガエル 胚における既知の組織運命を有する細胞系譜の質量分析ベースのプロテオミクス特性評価について述べる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞が組織や臓器を生じさせるときの分子事象の特性評価は、正常な発達をよりよく理解し、病気の効率的な治療法を設計する可能性を高めます。多様な種類と多数のタンパク質の正確な同定と定量を可能にする技術は、空間と時間における組織と生物の発達を調整する分子メカニズムに関するまだ不足している情報を提供します。ここでは、 アフリカツメガ エル(カエル)胚の同定された細胞系譜における数千のタンパク質の測定を可能にする質量分析ベースのプロトコルを紹介します。このアプローチは、再現性のある細胞運命マップと確立された方法に基づいて構築されており、脊椎動物の発生のこのモデルから細胞とその子孫(クローン)を識別、蛍光標識、追跡、およびサンプリングします。マイクロサンプリングまたは解剖または蛍光活性化細胞ソーティングによる細胞単離を使用して細胞内容物を収集した後、タンパク質を抽出し、ボトムアッププロテオミクス解析のために処理します。液体クロマトグラフィーとキャピラリー電気泳動は、高分解能質量分析(HRMS)によるタンパク質の検出と定量のためのスケーラブルな分離を提供するために使用されます。神経組織運命細胞のプロテオミクス特性評価のための代表的な例が提供されています。細胞系譜ガイド下HRMSプロテオミクスは、さまざまな組織や生物に適応できます。脊椎動物の発生中のプロテオームの時空間ダイナミクスを覗き込むのに十分な感度、特異性、定量性を備えています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞分化と組織や臓器の起源に関する私たちの理解は、遺伝子とその産物の何十年にもわたる精巧な標的スクリーニングの結果です。重要な細胞イベント中のすべての生体分子とその量に関する知識を増やすことは、脊椎動物のボディプランの空間的および時間的パターンを制御する分子メカニズムを解明するのに役立ちます。分子増幅とシーケンシングを可能にする技術は、現在、多数の遺伝子と転写物について日常的に報告できるようになり、基礎生物学およびトランスレーショナル研究における仮説主導の研究をサポートしています。発達中のシステムを理解するために、転写と翻訳の間の複雑な関係は、複数のタンパク質とその翻訳後修飾の直接分析を提唱しています。人工多能性幹細胞などのin vitro生物学的システムを使用したグローバルプロテオミクスは、組織誘導のメカニズムを描写し始めました1,2。脊椎動物の胚のような複雑な生物では、発生は空間と時間の文脈でモルフォゲン勾配に依存しています3。したがって、細胞が分化して神経組織などの特殊な組織を形成する際のプロテオミクス変化の知識を得ることは、正常および欠陥のある発生を制御する分子プログラムを解き放ち、次世代の治療法を導くための鍵を提供します。

脊椎動物の南アフリカのツメガエル(アフリカツメガエル)は、細胞および発生、神経、および再生生物学において確立されたモデルです。体細胞核の多能性の発見に対するジョン・ガードン卿の2012年ノーベル生理学・医学賞4,5は、基礎研究およびトランスレーショナル研究における発見のためのこのモデルの重要性を強調しました。アフリカツメガエル胚は母親の外部で発生するため、さまざまな発生段階にわたる細胞、細胞クローン、および遺伝子発現の直接操作が容易になります。非対称色素沈着とステレオタイプの細胞分裂により、16-6および32細胞の7,8段階の胚からの再現可能な運命マップのチャート作成が可能になりました。高分解能質量分析(HRMS)ベースのプロテオミクスでは、比較的大きなサイズ(直径~1 mm)で、分析用の豊富なタンパク質含有量が得られる(初期卵割段階の胚では~130 μg、16細胞胚の単一細胞では~10 μgのタンパク質含有量)9,10。

現在、HRMSはタンパク質の検出に最適な最先端の技術です。この技術により、複数の、通常は数百から数千の異なるタンパク質の直接的、高感度、特異的な検出と定量が可能になります11。HRMSによるボトムアッププロテオミクスには、相互に関連する一連のステップが含まれます。細胞/組織サンプルからの抽出後、タンパク質はトリプシン(ボトムアッププロテオミクス)などのタンパク質分解酵素で消化されます。得られたペプチドは、疎水性(逆相液体クロマトグラフィー、LC)、正味電荷(イオン交換クロマトグラフィー)、サイズ(サイズ排除クロマトグラフィー)、または電気泳動移動度(キャピラリー電気泳動、CE)など、さまざまな物理化学的特性に基づいて分離されます。次に、通常はエレクトロスプレーイオン化(ESI)を使用してペプチドを荷電(イオン化)し、タンデムHRMSによる気相フラグメンテーションを介してペプチドイオンを検出および配列決定します。得られたペプチドデータは、研究されている生物のプロテオームにマッピングされます。タンパク質特異的(プロテオタイプ)ペプチドイオンシグナル強度は濃度と相関するため、タンパク質定量は、ラベルフリーまたはラベルベース(マルチプレックス定量)で行うことができます。HRMSプロテオミクスは、研究中のシステムの分子状態に関する豊富な情報リソースを生成し、仮説の生成とフォローアップ機能研究を可能にします。

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図1:発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイドHRMSプロテオミクスを可能にする時空間的にスケーラブルなプロテオミクス。 (a)標本の可視化(1)を実体顕微鏡を用いて(2)同定した細胞(挿入図)を注入し、作製したマイクロピペット(3)を翻訳段階(4)により制御する。(b)16細胞胚における同定された左D11細胞の細胞内サンプリング。(C)16細胞胚からのD11細胞全体の解剖。(D)原腸内の神経外胚葉(NE)の解剖(ステージ10)をガイドするための、32細胞胚からの左右のD111子孫の蛍光(緑色)追跡、およびFACSを使用したオタマジャクシから子孫組織の分離。スケールバー:胚の場合は200 μm、バイアルの場合は1.25 mm。図は参考文献15,19,21,59の許可を得て翻案した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここで紹介するプロトコルは、発生中のX. laevis胚で同定された細胞/組織中の多数のタンパク質のHRMSベースの定量を可能にします。このアプローチは、正確な細胞同定、再現性のある細胞運命マップ、およびこの生物学的モデルで細胞系譜を追跡するための確立された方法論に基づいています6,7,8。図1に示すように、全細胞解剖またはキャピラリーマイクロサンプリングを使用して細胞含有量を吸引することにより、単一細胞からのプロテオームを研究します。細胞の系統を監視することで、原腸形成中に細胞が組織を形成する際のプロテオームの時空間進化を研究することができます。細胞子孫は、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、またはGFP)のために不活性デキストランまたはmRNAに結合した蛍光色素を注入することによって蛍光的にマークされる。標識された子孫は、所望の発生時点で単離される。原腸形成中に、密集した細胞クローンは解剖によって単離され得る。原腸形成後、細胞クローンは移動運動のために胚内に分布し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって解離組織から単離することができます。これらの細胞および組織中のタンパク質は、分離にHPLCまたはCEを使用し、同定にESIタンデムHRMSを使用するボトムアッププロテオミクスを介して測定されます。細胞系譜ガイド下HRMSプロテオミクスは、胚内のさまざまな細胞サイズと系統に拡張可能であり、特異的、高感度、定量的です。ここに示すいくつかの例を通じて、このプロトコルがスケーラブルであり、さまざまな種類の細胞や細胞系譜に広く適応できることも示しています。

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図2:バイオ分析ワークフロー。 微小解剖および毛細血管吸引、またはFACSは、細胞およびクローンタンパク質含有量のサンプリングを容易にしました。豊富な卵黄タンパク質の枯渇とキャピラリー電気泳動(CE)またはナノフロー液体クロマトグラフィー(LC)による分離により、エレクトロスプレーイオン化(ESI)高分解能質量分析(HRMS)を使用した同定(ID)感度が向上しました。定量化により、制御不全が明らかになり、遺伝子オントロジー(GO)から入手可能な情報と組み合わせて、仮説主導の研究に新しい情報を提供しました。図は参考文献15の許可を得て翻案した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アフリカツメガエルの成体のカエルの人道的な維持と取り扱いを保証するすべてのプロトコルは、メリーランド大学カレッジパーク校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(承認番号R-DEC-17-57およびR-FEB-21-07)。

1.ソリューションを準備します

  1. 発生学用
    1. 1x、0.5x、および0.2x Steinberg溶液(SS)を調製し、標準プロトコル12に従ってオートクレーブ(120°Cで20分間)して無菌にします。
    2. 標準プロトコル12に従って滅菌された1x SSで3%(w / v)Ficollを準備します。
    3. 脱ゼリーの場合は、2%(w / v)のシステイン溶液を新たに調製し、10 M水酸化ナトリウム溶液を滴下してpHを8に調整します。
      注意: システインにさらされると、皮膚や呼吸器の損傷を引き起こす可能性があります。水酸化ナトリウムは腐食性物質であり、直接さらされると皮膚や目に深刻な損傷を与える可能性があります。手袋や白衣など、これらの化学物質を取り扱うときは、適切な個人用保護具(PPE)を使用してください。
    4. 系統トレーサーには、滅菌脱イオン水中で0.5%(v/v)の蛍光デキストランを調製します。あるいは、蛍光タンパク質用のmRNA0.2 μg/μLを滅菌脱イオン水(GFPなど)に溶解した溶液を調製します。
    5. 細胞を解離するには、0.1 Mイセチオン酸ナトリウム、20 mMピロリン酸ナトリウム、および10 mM CAPSを含むニューポート2.0バッファーを調製し、そのpHを10.513にします。
      注意: ピロリン酸ナトリウムにさらされると、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。これらの化学物質を取り扱うときは、適切なPPEを使用してください。
  2. ボトムアッププロテオミクス用
    1. 250 mMスクロース、1%ノニデットP-40代替物(w/v)、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、10 μMサイトカラシンD、および10 μMコンブレタスタチン4Aを含む細胞溶解バッファーを調製します。10%(w / v)ドデシル硫酸ナトリウム14,15のストックを準備します。
      注:トリス塩酸は、ナノフローLC(ナノLC)-HRMS中のHEPES汚染を最小限に抑えるために選択されました。
      注意: ノニデットP-40代替品にさらされると、皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。サイトカラシンDは消費されると催奇形性であり、コンブレタスタチンは直接曝露すると急性毒性である。これらの化学物質を取り扱うときは、適切なPPEを使用してください。
    2. CEでペプチドを分離するには、次の溶媒(v / v)を準備します:サンプル溶媒、水中の0.05%酢酸(AcOH)を含む75%アセトニトリル(ACN)。シース溶液、水中に0.05%AcOHを含む10%ACN;バックグラウンド電解質(BGE)、水中に1 Mギ酸(FA)を含む25%ACN。
      注意: AcOHとFAは、吸入または消費すると有毒であり、直接さらされると深刻な皮膚や目の損傷を引き起こす可能性があります。これらの化学物質を取り扱うときは、適切なPPEを使用してください。
    3. 逆相nanoLCでペプチドを分離するには、(v / v):移動相A(水性)、0.1%FAを含む水を準備します。移動相B(有機)、ACN中の0.1%FA。
      注:すべての混合物は、HRMS検出中の化学的干渉を最小限に抑えるために、LC-MSグレードの溶媒を使用して調製する必要があります。

2.マイクロインジェクションと解剖のためのツールを準備します

  1. 胚を穏やかに動かして方向付けるには、他の場所で説明されているように、きれいな髪をパスツールピペットに固定してヘアループを作ります16。
  2. マイクロインジェクションの場合、他の場所16に記載されているように、ピペットプラーを使用してホウケイ酸キャピラリー(1 mm / 500 μmの外径/内径)を引っ張ることによって針を作製します。
    注:ここでは、次の設定のP-1000ピペットプラーが針の製造に使用されました:熱、495;プル、30、速度、60;時間、150;圧力、200。
  3. 実体顕微鏡下で観察しながら、一対の鋭利な鉗子を使用して毛細血管の先端を切断し、本質的に毛細血管を(マイクロ)針に作製する(例えば、Dumont #5)16。
    注意: 引っ張られた毛細血管は非常に鋭利であるため、取り扱いには注意が必要です。
    注:針の先端は、細胞内内容物が漏れず、細胞が治癒して生存し続けることができるように、細胞膜への損傷を最小限に抑えて細胞を突き刺すことができる十分に鋭利(外径10〜15μm)でなければなりません。
  4. マイクロインジェクション中に胚を保持するには、粘土で満たされた皿にウェルを準備します。15 mmのペトリ皿に、直径~1 mm×~0.5 mmの深さのウェルを、他の場所に記載されているように、無毒の粘土粘土に刻印します16。
  5. マイクロダイセクションの場合は、アガロースコーティングされた皿を準備します。1x SSで2%アガロースを作り、オートクレーブして溶液を滅菌します(120°Cで20分間)。60 mmのペトリ皿を半分満たし、プレートを固めます。前述のように、ボール状のパスツールピペットツールを使用して、直径~1 mm x ~0.5 mmの深さのウェルを作成します16。

3. 細胞系譜を分離する

注:次の手順を実行して、同定された単一細胞および/またはその子孫細胞系譜を分離します。通常、胚は16細胞または32細胞期に培養され、各細胞の組織運命が再現性よくマッピングされます6、7、17。胚細胞は、形態、位置、およびそれらの運命マップを参照して識別されます。シングルセル解析では、同定した細胞を手動解剖で単離するか、細胞内内容物をキャピラリーピペットに回収して5 μLの0.5 mM重炭酸アンモニウムに沈着させます。得られたサンプルは、分析(図1)18、19、20、21まで-80°Cで保存される。細胞系譜解析では、同定された細胞に系統トレーサーを注入し、その後のクローンを発生の重要な段階で単離します(例:組織誘導を研究するための原腸形成中、組織コミットメントを研究するための神経形成中)。以下では、解剖またはFACSによる単離のために同定された細胞の系統を蛍光標識するための手順を概説する。

  1. 胚を培養する
    1. 確立されたプロトコル12に従って、自然交配または体外受精(IVF)を介して胚を取得します。
      注:自然交配はロジスティック的に単純で、成体のオスのカエルを免れ、さまざまな発生段階で胚を生成しますが、IVFは正確な病期分類を必要とする実験のために発生的に同期した胚を提供します。
    2. 胚をデゼリーします。他の12、16に記載されるような脱ゼリー溶液による処理を介して胚を囲むゼリーコートを除去する。
      注:マイクロインジェクションと解剖には細胞と組織へのアクセスが必要であり、 X. laevis 胚の脱ゼリーが必要です。
    3. 常同型色素沈着16,22を有する2細胞胚を選択する。
      注:このステップは、細胞とその系統の同定における正確さと再現性を確保するために重要です。
    4. 胚を所望の発生段階に培養する。脱ゼリーした胚を1x SSを含むペトリ皿に移し、14〜25°Cでインキュベートして発生速度を制御します。
      注:X . laevisの発達の温度依存性は再現可能で、Xenbase23 (www.xenbase.org)で入手可能です。異なる温度で胚のバッチを培養することで、驚異的な発生段階が可能になります。そうすることで、実験のために特定の時間に利用可能な胚の数を分散させることができます。
    5. 胚の切断パターンを監視し、マイクロインジェクション用の定型色素沈着および切断パターンを有する胚を選択する16。
      注:16細胞および32細胞の胚を選択するときは、再現性のある系統追跡のために細胞切断が対称であることを確認してください。
  2. 目的のセルにラベルを付ける
    1. 系統トレーサー溶液を含む注射針をセットアップします。マイクロインジェクションニードルを多軸マイクロマニピュレーターで制御するマイクロピペットホルダーに取り付けます。
    2. マイクロピペットホルダーをマイクロインジェクターに接続します。他の場所16で説明されているように負圧を適用することにより、針に系統トレーサーを満たします。 図1A は、セットアップの例です。
    3. 針を調整します。針先のサイズと注入時間を調整して、他の場所で利用可能なプロトコルに従って(ミネラル)オイルで測定された~1nLの系統トレーサー溶液を送達します16。
      注:先端の広い毛細血管は細胞膜を傷つける傾向があり、細胞内内容物と注入された系統トレーサーが漏れ出しますが、先端が小さい毛細血管は詰まりやすくなります。先端外径が~10 μmのキャピラリーが理想的で、~1 nLを供給するには~300 msにわたって40 psiの圧力パルスが必要です。
    4. マイクロインジェクション粘土皿に3%Ficoll溶液を浸し、トランスファーピペットを使用して~10個の胚を粘土皿に移します。ヘアループを使用して各胚をウェルに導き、目的のターゲット細胞がマイクロニードルに対して直角になるようにゆっくりと配置します。
    5. X. laevis組織運命マップに従って、目的の系統の前駆細胞を特定します。例えば、図1は、32細胞胚(左右のD111細胞)におけるその前駆細胞の注入に基づく神経外胚葉クローンの標識を示す。
      注:16-6および32細胞の7,8胚の詳細な運命マップは、Xenbase23を介してインタラクティブなプラットフォームで利用できます。胚を系統追跡実験に使用する際には、胚の定型色素沈着と切断を確実にすることが重要です。
    6. 目的の細胞に、~1 nLの蛍光デキストランまたは~200 pgのmRNAを注入します(前述のように16)。
      注意: 10,000〜40,000MWのデキストランコンジュゲートを使用してください。小さなデキストランコンジュゲートはギャップ結合を通過する可能性がありますが、大きなデキストランコンジュゲートは注入された細胞に均一に拡散しない可能性があります。プロテオミクス解析に十分な組織を持つために、~10個の胚に細胞を注入することを計画します。
    7. 実体顕微鏡で細胞標識の成功を確認します。目的のセルのみが注入されていることを確認してください。損傷した細胞や誤ってラベル付けされた細胞を含む胚は、施設の方針に従って廃棄してください。
      注: X. laevis は多くの非自然環境で侵襲的であるため、胚を廃棄する前に致死性を確保するために胚を凍結することができます。
  3. 標識された細胞子孫を分離する
    1. 注入した胚をペトリ皿の0.5倍SSに移し、目的の発生段階に達するまで14〜25°Cの間で培養します。
      注:Xenbaseで報告された胚を病期分類するには、確立されたプロトコルを参照してください。
    2. 3〜5個の胚を、マイクロダイセクション用の0.2x SS溶液を含む寒天ディッシュに移します。
      注:SS溶液の塩濃度を0.5倍から0.2倍に下げると、解剖中に細胞を分離するのに役立ちます。
    3. 2つの鋭利な鉗子を使用して、胚を囲む卵子膜をそっと取り除きます。
      注:目的のクローンを損傷から守るために、蛍光標識されたクローンの反対側からメンブレンをはがします。
    4. 以下のように、手動解剖(ステップ3.3.5-3.3.6)またはFACS(ステップ3.3.7-3.3.8)によって標識クローンを分離します。
    5. 鉗子を使用して、標識されたクローンを胚から解剖します。
      注:他の場所で詳述されているように、顕微手術用はさみ、タングステン針、または眉毛ヘアナイフなどの他のツールは、標識されたクローンの解剖に使用できます16。
    6. 解剖した組織を0.5〜10 μLのピペットで採取し、マイクロ遠心バイアルに入れます。トランスファーピペットを使用して、採取した組織を取り囲む媒体を吸引し、後のステップでのHRMS分析を妨げるサンプル中の塩分を制限します。
      注:プラスチック表面へのタンパク質吸着を最小限に抑えるバイアルを使用して、ワークフローの後のステップでのバイアル表面でのタンパク質損失を最小限に抑えます。
    7. FACSで単離するには、~5-8個の脱落胚を、~5 mLのニューポート2.0バッファーを含む12ウェルプレートの各ウェルに移します。プレートを80rpmで室温で20〜30分間ナットすることにより、胚を解離します13。
      注:ステージ22より古い胚/幼虫は細胞外マトリックスタンパク質が豊富であるため、別々の細胞への解離が困難になります。さらなる酵素的アプローチは、他の箇所に記載されるように、より古い胚から組織を解離するために適合させることができる24。
    8. 蛍光標識された細胞を、他の箇所24に記載されるようにFACSを用いて懸濁液から精製する。
    9. 遠心分離によりペレット細胞、上清を廃棄する。
      注:細胞の溶解を防ぐために、低い遠心分離速度(400 × g)と温度(4 °C)を使用してください。FACSにウシ血清アルブミン(BSA)を使用する場合は、HRMS検出中のBSA干渉を減らすために細胞ペレットを洗浄してください。細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に穏やかに再懸濁し、再度遠心分離してすすぎ細胞をペレット化します。上澄みPBS液を取り除きます。
    10. サンプルバイアルをドライアイスまたは液体窒素の上に置いて、単離した細胞を迅速に凍結します。
      注意: 処理ステップ中は、サンプル(組織または細胞)を冷却(氷上など)に保ちます。下流処理を容易にするために、サンプルの周りの培地をできるだけ少なくして細胞を凍結します。
    11. HRMS分析までサンプルを-80°Cで保存します。

4. 質量分析によるタンパク質の分析

単離された組織または細胞のプロテオミクス特性評価は、HRMSの一連の確立されたステップに基づいています。 図2 は、バイオ分析ワークフローのステップを示しています。ここで使用されるサンプル収集プロトコルは、プロテオミクスのボトムアップ11、ミドルダウン25、またはトップダウン26 のワークフローと互換性があります。以下では、この研究で使用されたボトムアップ戦略について説明し、感度、定量性、および多様なタイプの質量分析計に適応可能であることが証明されています。タンパク質を抽出して酵素消化した後、得られたペプチドを分離し、HRMS分析を行います。

  1. 組織/単一細胞を処理する
    1. CEによるシングルセル分析では、サンプルを60°Cに~15分間加熱してタンパク質を変性させ、サンプルを室温(RT、~5分)に平衡化します18,21。
      注:組織での作業中とは異なり、単一細胞からのサンプル調製中のタンパク質損失を制限するために、還元およびアルキル化のステップはスキップされます。フィルター支援サンプル調製(FASP)27,28、他のシングルポット戦略29、およびマイクロ流体アプローチ30を採用して、サンプル調製中のタンパク質損失を最小限に抑えることができます。
    2. nanoLCによる分析では、50 μLの溶解バッファー(~100 μgの総タンパク質)で最大5つの解剖組織を溶解します。サンプルを数回上下にピペッティングして、プロセスを容易にします。
    3. ライセートを4°Cで10分間インキュベートし、次に4°Cで4,500 × g で遠心分離することにより、細胞破片と卵黄血小板をペレット化します。 上清を清潔な微量遠心バイアルに移し、10%SDSを加えて、ライセート中の最終濃度1%SDS(v / v)を取得します。
    4. ティッシュの場合は、手順4.1.5〜4.1.7に従います。
    5. ライセートに0.5 Mジチオスレイトールを加えて最終濃度~25 mM(例:0.5 Mジチオトレトール2.5 μLとライセート50 μL)を得て、ライセートを60°Cで30分間インキュベートして、タンパク質中のジスルフィド結合を化学的に還元します。
    6. 0.5 Mヨードアセトアミドを加えてライセート中の最終濃度~75 mMとし、暗所でRTで15分間インキュベートします(図2)。
    7. 初期容量と同じ0.5 Mジチオスレイトール(例:.、0.5 Mジチオトレトール2.5 μLを溶解液50 μL)に加えて、アルキル化反応から残っている反応物をクエンチします。
      注意: ヨードアセトアミドとジチオスレイトールは、直接さらされると深刻な皮膚や目の損傷を引き起こす可能性があります。.これらの化学物質を取り扱うときは、適切なPPEを使用してください。
    8. 沈殿によってタンパク質を精製します。クロロホルム・メタノール系沈殿はよく31を行う。このプロトコルは、他のタイプの沈殿アプローチにも適応可能である32。
      注:タンパク質の損失が懸念されるシングルセル分析では、CE-HRMSの沈殿ステップをスキップしてください。
    9. タンパク質沈殿物を真空濃縮器(4-37°C)で乾燥させ、抽出したプロテオームを50 μLの50 mM重炭酸アンモニウムに再懸濁します。消化に必要な酵素の量を決定するために、総タンパク質比色アッセイ(ビシンコニン酸タンパク質アッセイなど)を使用してタンパク質濃度を推定します。
    10. タンパク質をペプチドに消化します。トリプシン(1 μg/μLストック)を加えてプロテアーゼ:タンパク質比1:50を取得し、混合物を37°Cでシングルセルサンプルの場合は最大5時間、組織サンプルの場合は最大14時間インキュベートします。反応については、ベンダー固有の推奨事項を参照してください。
      注:14時間以上濃度のトリプシンによる消化は、タンパク質の配列に非特異的な切断を導入する可能性があり、したがってタンパク質の同定が困難である33。
    11. 比色アッセイを用いて総ペプチド濃度を定量する。
    12. オプション:マルチプレックス定量では、ベンダー固有の指示に従って、各サンプルのペプチドに異なる同重体質量タグを付けます。バーコード化されたペプチドをペプチドサンプルごとに等しい割合で混合します。
      注:定量的なバイアスを避けるために、正確なラベル付けと混合を確認してください。量制限のあるサンプルまたはシングルセルサンプルの場合、プールされた組織/細胞で構成されるTMTベースのキャリアチャネルを含めて、後続の分離ステップ中のサンプル損失を最小限に抑え、存在量の低いタンパク質の感度を高めることができます34。
    13. オプション:ペプチドを脱塩して、C18逆相スピンカラム/チップ上の塩や汚染物質(未反応の同重体質量タグ試薬など)を除去し、LC-MSシステムを保護します。
    14. オプション:ペプチド混合物を分画(中pHまたは高pH逆相分画など)して、手動または自動プラットフォームを介してプロテオームをより深く検出します。チップを含むC18固定相を使用して、少量(1〜10 μg)のペプチド消化物を分画します。
    15. ペプチド混合物を真空濃縮器で60°Cで乾燥させる。
    16. 測定までペプチド混合物を-80°Cで保存します。
  2. ペプチドを分離する
    注:タンパク質を抽出して酵素的に消化した後、得られたペプチドはnanoLCまたはCEによって分離され、タンデムHRMSによるシーケンシングのためにESIによってイオン化されます。逆相ナノLC分離は、分析ごとに~150 ngから~1 μgを蓄積するペプチドに最適です。CEは、フェムトグラムから <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 シングルセル解析にますます使用されています18,36,37.
    1. CE を使用して分離するには、手順 4.2.2-4.2.7 に従います。
      注:以下では、ペプチドを測定するためのカスタムビルドのCEプラットフォームの使用について説明します。このCE装置を構築して使用するためのプロトコルは、低分子の使用に関する視覚化された実験とともに38以前に提供されました20。あるいは、これらの測定は、AB SCIEX CESI、Agilent 7100、または同等のものなどの商用CEシステムで実行できます。
    2. タンパク質消化物を1〜2 μLのサンプル溶媒で再構成し、ボルテックスでサンプルを混合し、10,000 x g で2分間遠心分離して細胞破片をペレット化します。
      注:細胞破片を除去することで、CEキャピラリーを詰まらせる可能性が最小限に抑えられるため、分離システムの寿命が延び、測定スループットが向上します。
    3. CEキャピラリーをBGEでフラッシュして、CE-ESI機器を初期化します。
    4. 既知の標準物質(シトクロムCまたはBSA消化物、アンジオテンシンペプチドなど)を使用して機器の性能を検証します。
      注:貴重なサンプルを測定する前に、質量精度、検出感度、再現性、および定量の線形ダイナミックレンジの観点から機器を評価することをお勧めします。CE-ESI-MSパフォーマンスの検証とトラブルシューティングに関する追加の注意事項は、他の場所に記載されています18、20、38。
    5. サンプルの~1-10 nLをCE分離キャピラリーに注入します。
      注:この研究では、動電ポンプシースフローセットアップで、長さ~1 mの溶融シリカキャピラリー(内径/外径40 / 110 μm)を使用します。市販のCE機器では、通常、注射用のマイクロバイアルに5〜10μLのサンプルを提示する必要があります。カスタムビルドのCEプラットフォーム18,38は、サンプルローディングマイクロバイアルに堆積した~250 nLから1 μLのサンプルと互換性があります。
    6. CE分離キャピラリーの入口端をBGEに移します。
    7. 電気泳動分離を開始するには、アースグランドからCE分離電圧を徐々に上昇させます(たとえば、1分間にわたって段階的に)。20-28 kVの電位、電流が~10 μA未満であるため、安定した再現性のある機器性能を確保します。
    8. nanoLCを使用して分離するには、手順4.2.9〜4.2.12に従います。
    9. ペプチドサンプルを移動相Aに再懸濁します。サンプルの濃度と注入量は、利用可能なLCシステムとカラムによって異なります。この研究では、~250 ng-1 μgのタンパク質消化物を1-20 μLのサンプル容量にC18充填床カラム(内径75 μm、粒子径2 μm、細孔100 Å、長さ25 cmの分離カラム)に注入します。
    10. サンプルをLCバイアルに移します。
      注意: 分析カラムを損傷する可能性のある気泡がバイアルに含まれていないことを確認してください。インサート付きのバイアルは、少量の組織または単一細胞サンプルに使用できます。
    11. ~200 ngから2 μgのペプチドサンプルをC18分析カラムにロードします。
      注:オプションで、ペプチドをトラップカラムにロードして、分析分離の前に脱塩することができます。例えば、内径0.1 mm、粒径5 μm、孔径100 Å、長さ20 mmのC18トラップカラムなどです。分離勾配が始まる前に、100%バッファーAで5 μL/minの流速で5分間ペプチドを脱塩します。
    12. グラジエント溶出を使用してペプチドを分離します。300 nL/分の流量で、この研究で使用される120分の勾配は次のとおりです:0-5分2%B、5-85分2-35%B、86-90分70%B、91-120分2%B。
  3. ESIによるペプチドのイオン化
    注:CEまたはnanoLCキャピラリーは、最も一般的にはイオン化のためにESIソースに結合されます。超高感度検出用のマイクロフロー(平滑チップ)およびナノフロー(テーパーチップ39 および動電ポンプシースフロー36 設計)CE-ESIインターフェースは以前に開発されました。
    1. 分離ペプチドをエレクトロスプレーイオン源に供給し、市販またはカスタムビルドのESIインターフェースを使用してイオン化します。 アフリカツメガエル 胚の単一細胞CE-ESI-MS分析には、CEキャピラリー出口がプルドホウケイ酸エミッターで囲まれている動電ポンプ式低流量インターフェースを使用します。
    2. カメラを使用してエレクトロスプレーエミッターを通る液体の流れを確認し、漏れの可能性がないかセットアップを視覚的に検査します。
    3. エレクトロスプレー電圧を~2.5kVに設定して、ESIソース(アースグランド対)を開始します。
    4. 総イオン電流を監視することにより、HRMS分析用の安定したナノスプレーを確保します。エレクトロスプレー電圧とエミッターからHRMSインレットまでの距離を調整して、安定したスプレーを実現します(合計強度の<15%相対標準偏差)。
  4. ペプチドの検出
    注:ペプチドの検出は、同重体質量タグ付きペプチドとタグなしペプチドのさまざまな機器の考慮事項に従い、利用可能な質量分析計の種類によって異なります。本研究では、以下の手順に従ってorbitrapトライブリッド質量分析計を使用します。
    1. 設定でMS1 イベントを取得します:アナライザー、オービラップ;スペクトル分解能、半値で120,000全幅(FWHM)。最大注入時間(IT)、50ミリ秒;自動ゲイン制御(AGC)、4 x 105 カウント。マイクロスキャン、1。
    2. ペプチドを配列決定するには、フラグメンテーションモード、高エネルギー衝突解離(HCD)の設定を使用してイオントラップアナライザで検出するためのフラグメント前駆体イオン。衝突ガス、窒素;衝突エネルギー、32%正規化衝突エネルギー(NCE);最大IT、70ミリ秒。AGC、1 x 104 カウント;マイクロスキャン、1。
    3. オプション:タンデム/多段階HRMS(MS2/MS3)を使用してTMTタグ付きペプチドを定量します。同期プリカーサー選択を採用したMS3 の場合、一般的な機器設定は次のとおりです。最も豊富なイオンを調査する単段階(MS1)スキャンは、パラメータを使用したデータ依存取得を介して解離されます:MS2 フラグメンテーションモード、衝突誘起解離(CID)。衝突ガス、ヘリウム;衝突エネルギー、35%NCE;フラグメントイオン用分析装置、イオントラップ以下の設定:最大IT、50ミリ秒;AGC、5 x 104 カウント;マイクロスキャン、1。10 MS2 フラグメントイオンを選択し、窒素(65%NCE)中のHCDでフラグメント化します。次の設定を使用してMS3 フラグメントイオンを検出します:Orbitrap分解能15,000 FWHM、最大IT、120ミリ秒;AGC、1×105 カウント。マイクロスキャン、1。
      注:他の場所で説明されているように、さまざまなMS取得方法とパラメーターをタグ付けされたサンプルに使用できます11,40。
  5. データを分析する
    注:タンパク質は、高度なバイオインフォマティクスパッケージを使用して同定および定量されます。同定の忠実度は、ペプチドおよびタンパク質のレベルでの偽発見率(FDR)として表されるおとりデータベースを使用して計算されます。
    1. 商用またはオープンソースのソフトウェアパッケージを使用してデータを処理します(参考文献41でレビュー)。 アフリカツメガエル プロテオーム9.2とmRNA由来のPHROGデータベース42を連結して調製したデータベースと生データを照合する。
      注:検索パラメータは次のとおりです:消化酵素、トリプシン;胸の谷間を逃した、最大2つ。可変修飾、メチオニン酸化;静的修飾、システインカルバミドメチル化;前駆体質量許容誤差、10ppm;フラグメント質量公差、0.6 Da;最小ペプチド長、5;同定フィデリティ、ペプチドおよびタンパク質の<1%FDR。ペプチドへのアルキル化がなければ、静的修飾としてのカルバミドメチル化は、データベース検索中(例えば、単一細胞解析用)から除外される。
    2. ラベルフリー43またはラベルベースの戦略44,45を介してタンパク質の存在量を定量します。
    3. オプション:遺伝子オントロジーのためにタンパク質に注釈を付けます。PantherDB46、Reactome47、またはXenbase23 を使用できます。
    4. オプション:トランスプロテオミクスパイプライン48、ペルセウス49、Orange50などのソフトウェアパッケージ/Webツールを使用して、タンパク質の存在量と細胞/組織タイプ間のタンパク質存在量の違いを定量化します。
      注:実験計画とソフトウェアオプションに関する追加の考慮事項は、他の場所でレビューされました41,51。
    5. オプション:既知のタンパク質間相互作用についてはSTRING52やBioPlexディスプレイ53、リン酸化についてはPhosphoSiteplus54などのナレッジベースを使用して、結果をさらに評価します。プロテオームで表されるモチーフとドメインを分析するには、Simple Modular Architecture Research (SMART)55などのWebツールを使用します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルにより、X. laevis胚の組織を確立する際の単一細胞とその系統のタンパク質の研究が可能になりました。図1は、神経組織運命細胞および胚の新たに誘導された神経外胚葉におけるタンパク質を研究するためのアプローチのそのような応用の1つを示しています。図1Aに示すように、バイオアナリシスワークフローは、細胞および発生生物学の従来のツールを統合して、細胞の同定、注入/吸引、および検体の収集を行いました。図1Bは、マイクロインジェクターを用いたインビボでの16細胞胚における左背側動物(D11)細胞のマイクロプローブサンプリングを示す;実験後、胚は正常な解剖学的構造56でオタマジャクシにうまく発達しました。大きな胚細胞(直径100~250μm)も手作業による微小解剖に役立ちました。右背部動物正中線(D11)細胞の解剖は、

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルにより、 アフリカツメガエル 種の胚における同定された細胞系譜におけるタンパク質発現の特性評価が可能になります。HRMSに由来するこの方法論は、分子同定における絶妙な特異性、分子プローブ(通常は数百から数千の異なるタンパク質)を使用しないマルチタンパク質検出能力、および定量能力を兼ね備えています。細胞および発生(神経)生物学における古典的なツールとワークフローへの適応性は、HRMSプロテオミクスを脊椎動物 X. laevis 胚における幹細胞分化の全体的な特性評価を含むエキサイティングなアプリケーションに拡大します。

この手順では、 X. laevis 胚における細胞系譜ガイド下プロテオミクスについて説明します。例として、神経運命の単一細胞とその系統の解析を示し、公開データリポジトリを通じて対応するCEおよびnanoLC HRMSデータセットを提供します(PRIDEを参照)。このアプローチは、複数の細胞型(および系統)におけるタンパク質の時空間制御に関する研究に容易に適応できます。発生中の胚における時空間ガイドプロ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は競合する利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚の解離とFACSに関する貴重な議論をしてくれたJie Li(メリーランド大学カレッジパーク校)に感謝します。Vi M. QuachとCamille Lombard-Banekには、このプロトコルで強調されているプロテオミクスアプリケーションを例示する以前の研究におけるサンプル調製とデータ収集を支援していただき、感謝します。この研究の一部は、国立科学財団(賞番号IOS-1832968 CAREER)(P.N.)、国立衛生研究所(賞番号R35GM124755)(P.N.)、メリーランド大学-国立がん研究所パートナーシッププログラム(P.N.)、およびCOSMOSクラブ財団研究賞(A.B.B.およびL.R.P.)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトニトリル(LC-MSグレード)Fisher ScientificA955
アガロース ThermoFisher ScientificR0492
重炭酸アンモニウムFisher ScientificA643-500
分析カラムThermo Scientific164941
分析用マイクロバランスメトラー・トレドXSE105DU
自動ペプチド分画プラットフォームAgilent1260 Infinity II
ホウケイ酸毛細血管Sutter Instruments Co.B100-50-10
ホウケイ酸毛細管(エミッタ用)サッター機器B100-75-10
C18 スピンカラム(脱塩用)サーモフィッシャーサイエンティフィック89870
カメラロモニター エレクトロスプレーエドモンド・オプティクスEO-2018C
Combretastatin A4Millipore SigmaC7744
Commercial CESI systemAB SCIEXCESI
（シクロヘキシルアミノ（シクロヘキシルアミノ）-1-プロパンスルホン酸 (CAPS)VWR97061-492
Cytochalasin DMillipore SigmaC8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, アニオン性、固定可能なサーモフィッシャーScientificD22910
DiotholeitolFisher ScientificFERR0861
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-30
EDTAFisher ScientificAAJ62786AP
Epifluorescence 光源LumencoreAURA III
Eppendorf LoBing 微量遠心分離機  チューブ: タンパク質フィッシャーScientific13-698-793
ギ酸 (LC-MS グレード)Fisher ScientificA117-50
フリーザー (-20 °C;C)フィッシャーサイエンティフィック97-926-1 
フリーザー(-80°C;C)Thermo ScientificTSX40086A
溶融シリカキャピラリーMolex1088150596
Heat BlockBenchmarkBSH300
高圧液体クロマトグラフィーシステムThermoFisher ScientificDionex Ultimate 3000 RSLC ナノシステム
高電圧電源スペルマンCZE1000R
高分解能質量分析計ThermoFisher ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計
HPLCキャップThermo ScientificC4013-40A
HPLCバイアルThermo ScientificC4013-11
イルミネーター(例:グースネックス、ニコンC-FLED2
インジェニュイティパスウェイ解析Qiagen
ヨードアセトアミドフィッシャー・サイエンティフィAC122275000
メタノール (LC-MSグレード)フィッシャー・サイエンティフィA456
メタノール (LC-MSグレード)フィッシャー・サイエンティフィA456-4
マイクロキャピラリープーラーサットー・インスツルメンツP-2000
マイクロインジェクターワーナー・インスツルメンツ ハンデムPLI-100A
マイクロピペット引き手Sutter Instruments Co.P-1000
MSデータ解析ソフトウェア、商用ProteomeDiscoverer
MSデータ解析ソフトウェア、オープンソースMaxQuant
non-idet 40 substituteMillipore Sigma11754599001
Petri dish 60 mmおよび80 mmFisher ScientificS08184
Pierce 10 & micro;Lベッド ジップチップ(脱塩用)サーモフィッシャーサイエンティフィック87782
ピアスビシンコニン酸タンパク質アッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック23225
ピアス定量的比色ペプチドアッセイサーモフィッシャーサイエンティフィック23275
ピアストリプシンプロテアーゼ(MSグレード)フィッシャーサイエンティフィックPI90058
プロテインローバインドバイアルエッペンドルフ0030108434
、0030108442
冷蔵遠心分離機エッペンドルフ5430R
冷蔵インキュベーターサーモサイエンティフィックPR505755R/3721
セチオン酸ナトリウムミリポアシグマ220078
ロリン酸ナトリウムシグマアルドリッチ221368-100G
ステンレス鋼BGEバイアルカスタムメイド
ステンレス鋼のサンプルバイアルカスタムメイド
の実体顕微鏡(対物レンズ10x)ニコンSMZ 1270、SZX18
ショ糖VWR97063-790
シリンジポンプ(2)ハーバード704506
リンジ(気密):500–1000 &マイクロ;LHamilton1750TTL
トランスファーピペット (プラスチック、使い捨て)Fisher Scientific13-711-7M
トラップカラムThermo Scientific164750
Tris-HCl (1 M 溶液)Fisher ScientificAAJ22638AP
4&ndash での操作が可能な真空濃縮器。10 度;CLabconco7310022
ボルテックスミキサーベンチマークBS-VM-1000
水 (LC-MS グレード)フィッシャーサイエンティフィックW6
水 (LC-MS グレード)フィッシャーサイエンティフィW6
XYZ トランスレーションステージThorlabsPT3
XYZ トランスレーションステージカスタムメイド
ック ック ック のイピの装置シック

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