ここでは、脊椎動物 アフリカツメガエル 胚における既知の組織運命を有する細胞系譜の質量分析ベースのプロテオミクス特性評価について述べる。
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この記事について
サマリー
要約
細胞が組織や臓器を生じさせるときの分子事象の特性評価は、正常な発達をよりよく理解し、病気の効率的な治療法を設計する可能性を高めます。多様な種類と多数のタンパク質の正確な同定と定量を可能にする技術は、空間と時間における組織と生物の発達を調整する分子メカニズムに関するまだ不足している情報を提供します。ここでは、 アフリカツメガ エル(カエル)胚の同定された細胞系譜における数千のタンパク質の測定を可能にする質量分析ベースのプロトコルを紹介します。このアプローチは、再現性のある細胞運命マップと確立された方法に基づいて構築されており、脊椎動物の発生のこのモデルから細胞とその子孫(クローン)を識別、蛍光標識、追跡、およびサンプリングします。マイクロサンプリングまたは解剖または蛍光活性化細胞ソーティングによる細胞単離を使用して細胞内容物を収集した後、タンパク質を抽出し、ボトムアッププロテオミクス解析のために処理します。液体クロマトグラフィーとキャピラリー電気泳動は、高分解能質量分析(HRMS)によるタンパク質の検出と定量のためのスケーラブルな分離を提供するために使用されます。神経組織運命細胞のプロテオミクス特性評価のための代表的な例が提供されています。細胞系譜ガイド下HRMSプロテオミクスは、さまざまな組織や生物に適応できます。脊椎動物の発生中のプロテオームの時空間ダイナミクスを覗き込むのに十分な感度、特異性、定量性を備えています。
概要
細胞分化と組織や臓器の起源に関する私たちの理解は、遺伝子とその産物の何十年にもわたる精巧な標的スクリーニングの結果です。重要な細胞イベント中のすべての生体分子とその量に関する知識を増やすことは、脊椎動物のボディプランの空間的および時間的パターンを制御する分子メカニズムを解明するのに役立ちます。分子増幅とシーケンシングを可能にする技術は、現在、多数の遺伝子と転写物について日常的に報告できるようになり、基礎生物学およびトランスレーショナル研究における仮説主導の研究をサポートしています。発達中のシステムを理解するために、転写と翻訳の間の複雑な関係は、複数のタンパク質とその翻訳後修飾の直接分析を提唱しています。人工多能性幹細胞などのin vitro生物学的システムを使用したグローバルプロテオミクスは、組織誘導のメカニズムを描写し始めました1,2。脊椎動物の胚のような複雑な生物では、発生は空間と時間の文脈でモルフォゲン勾配に依存しています3。したがって、細胞が分化して神経組織などの特殊な組織を形成する際のプロテオミクス変化の知識を得ることは、正常および欠陥のある発生を制御する分子プログラムを解き放ち、次世代の治療法を導くための鍵を提供します。
脊椎動物の南アフリカのツメガエル(アフリカツ....
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プロトコル
アフリカツメガエルの成体のカエルの人道的な維持と取り扱いを保証するすべてのプロトコルは、メリーランド大学カレッジパーク校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(承認番号R-DEC-17-57およびR-FEB-21-07)。
1.ソリューションを準備します
- 発生学用
- 1x、0.5x、および0.2x Steinberg溶液(SS)を調製し、標準プロトコル12に従ってオートクレーブ(120°Cで20分間)して無菌にします。
- 標準プロトコル12に従って滅菌された1x SSで3%(w / v)Ficollを準備します。
- 脱ゼリーの場合は、2%(w / v)のシステイン溶液を新たに調製し、10 M水酸化ナトリウム溶液を滴下してpHを8に調整します。
注意: システインにさらされると、皮膚や呼吸器の損傷を引き起こす可能性があります。水酸化ナトリウムは腐食性物質であり、直接さらされると皮膚や目に深刻な損傷を与える可能性があります。手袋や白衣など、これらの化学物質を取り扱うときは、適切な個人用保護具(PPE)を使用してください。 - 系統トレーサーには、滅菌脱イオン水中で0.5%(v/v)の蛍光デキストランを調製します。あるいは、蛍光....
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結果
このプロトコルにより、X. laevis胚の組織を確立する際の単一細胞とその系統のタンパク質の研究が可能になりました。図1は、神経組織運命細胞および胚の新たに誘導された神経外胚葉におけるタンパク質を研究するためのアプローチのそのような応用の1つを示しています。図1Aに示すように、バイオアナリシスワークフローは、細胞および発生生物学の従来のツールを統合して、細胞の同定、注入/吸引、および検体の収集を行いました。図1Bは、マイクロインジェクターを用いたインビボでの16細胞胚における左背側動物(D11)細胞のマイクロプローブサンプリングを示す;実験後、胚は正常な解剖学的構造56でオタマジャクシにうまく発達しました。大きな胚細胞(直径100~250μm)も手作業による微小解剖に役立ちました。右背部動物正中線(D11)細胞の解剖は、
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ディスカッション
このプロトコルにより、 アフリカツメガエル 種の胚における同定された細胞系譜におけるタンパク質発現の特性評価が可能になります。HRMSに由来するこの方法論は、分子同定における絶妙な特異性、分子プローブ(通常は数百から数千の異なるタンパク質)を使用しないマルチタンパク質検出能力、および定量能力を兼ね備えています。細胞および発生(神経)生物学における古典的なツールとワークフローへの適応性は、HRMSプロテオミクスを脊椎動物 X. laevis 胚における幹細胞分化の全体的な特性評価を含むエキサイティングなアプリケーションに拡大します。
この手順では、 X. laevis 胚における細胞系譜ガイド下プロテオミクスについて説明します。例として、神経運命の単一細胞とその系統の解析を示し、公開データリポジトリを通じて対応するCEおよびnanoLC HRMSデータセットを提供します(PRIDEを参照)。このアプローチは、複数の細胞型(および系統)におけるタンパク質の時空間制御に関する研究に容易に適応できます。発生中の胚における時空間ガイドプロ.......
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開示事項
著者は競合する利益を宣言しません。
謝辞
胚の解離とFACSに関する貴重な議論をしてくれたJie Li(メリーランド大学カレッジパーク校)に感謝します。Vi M. QuachとCamille Lombard-Banekには、このプロトコルで強調されているプロテオミクスアプリケーションを例示する以前の研究におけるサンプル調製とデータ収集を支援していただき、感謝します。この研究の一部は、国立科学財団(賞番号IOS-1832968 CAREER)(P.N.)、国立衛生研究所(賞番号R35GM124755)(P.N.)、メリーランド大学-国立がん研究所パートナーシッププログラム(P.N.)、およびCOSMOSクラブ財団研究賞(A.B.B.およびL.R.P.)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトニトリル(LC-MSグレード) | Fisher Scientific | A955 | |
| アガロー | ス ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| 重炭酸アンモニウム | Fisher Scientific | A643-500 | |
| 分析カラム | Thermo Scientific | 164941 | |
| 分析用マイクロバランス | メトラー・トレド | XSE105DU | |
| 自動ペプチド分画プラットフォーム | Agilent | 1260 Infinity II | |
| ホウケイ酸毛細血管 | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| ホウケイ酸毛細管(エミッタ用) | サッター機器 | B100-75-10 | |
| C18 スピンカラム(脱塩用) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 89870 | |
| カメラロモニター エレクトロスプレー | エドモンド・オプティクス | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| （シクロヘキシルアミノ（シクロヘキシルアミノ）-1-プロパンスルホン酸 (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, アニオン性、固定可能な | サーモフィッシャーScientific | D22910 | |
| Diotholeitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence 光源 | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing 微量遠心分離機 チューブ: タンパク質 | フィッシャーScientific | 13-698-793 | |
| ギ酸 (LC-MS グレード) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| フリーザー (-20 °C;C) | フィッシャーサイエンティフィック | 97-926-1 | |
| フリーザー(-80°C;C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| 溶融シリカキャピラリー | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| 高圧液体クロマトグラフィーシステム | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC ナノシステム | |
| 高電圧電源 | スペルマン | CZE1000R | |
| 高分解能質量分析計 | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計 | |
| HPLCキャップ | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLCバイアル | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| イルミネーター(例:グースネックス、 | ニコン | C-FLED2 | |
| インジェニュイティパスウェイ解析 | Qiagen | ||
| ヨードアセトアミド | フィッシャー・サイエンティフィ | AC122275000 | |
| メタノール (LC-MSグレード) | フィッシャー・サイエンティフィ | A456 | |
| メタノール (LC-MSグレード) | フィッシャー・サイエンティフィ | A456-4 | |
| マイクロキャピラリープーラー | サットー・インスツルメンツ | P-2000 | |
| マイクロインジェクター | ワーナー・インスツルメンツ ハンデム | PLI-100A | |
| マイクロピペット引き手 | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MSデータ解析ソフトウェア、商用 | ProteomeDiscoverer | ||
| MSデータ解析ソフトウェア、オープンソース | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mmおよび80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 & micro;Lベッド ジップチップ(脱塩用) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 87782 | |
| ピアスビシンコニン酸タンパク質アッセイキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23225 | |
| ピアス定量的比色ペプチドアッセイ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23275 | |
| ピアストリプシンプロテアーゼ(MSグレード) | フィッシャーサイエンティフィック | PI90058 | |
| プロテインローバインドバイアル | エッペンドルフ | 0030108434 、0030108442 | |
| 冷蔵遠心分離機 | エッペンドルフ | 5430R | |
| 冷蔵インキュベーター | サーモサイエンティフィック | PR505755R/3721 | |
| セチオン酸ナトリウム | ミリポアシグマ | 220078 | |
| ロリン酸ナトリウム | シグマアルドリッチ | 221368-100G | |
| ステンレス鋼BGEバイアル | カスタムメイド | ||
| ステンレス鋼のサンプルバイアルカスタム | メイド | ||
| の実体顕微鏡(対物レンズ10x) | ニコン | SMZ 1270、SZX18 | |
| ショ糖 | VWR | 97063-790 | |
| シリンジポンプ(2) | ハーバード704506 | ||
| リンジ(気密):500–1000 &マイクロ;L | Hamilton | 1750TTL | |
| トランスファーピペット (プラスチック、使い捨て) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| トラップカラム | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M 溶液) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| 4&ndash での操作が可能な真空濃縮器。10 度;C | Labconco | 7310022 | |
| ボルテックスミキサー | ベンチマーク | BS-VM-1000 | |
| 水 (LC-MS グレード) | フィッシャーサイエンティフィック | W6 | |
| 水 (LC-MS グレード) | フィッシャーサイエンティフィ | W6 | |
| XYZ トランスレーションステージ | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ トランスレーションステージ | カスタムメイド |
参考文献
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their ....
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