方法論記事

末梢神経工学のためのグラフェンベースの3Dバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製と特性評価

DOI：

10.3791/63622

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2022年5月16日

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1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

この記事について

サマリー

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この原稿では、末梢組織工学で使用するためのグラフェンを含むバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製を示します。この3Dバイオハイブリッド材料を用いて、幹細胞の神経分化プロトコールを行う。これは、同様の生体材料を診療所に持ち込む上で重要なステップになる可能性があります。

要約

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末梢神経障害は、軸索損傷の結果として、そして時には脱髄疾患のために起こり得る。末梢神経損傷は、救急患者の1.5%〜5%に発生する世界的な問題であり、重大な失業につながる可能性があります。今日、足場、適切な細胞株、およびバイオシグナルで構成される組織工学ベースのアプローチは、3次元(3D)バイオプリンティング技術の開発により適用可能になっています。末梢神経再生における既存の問題を克服するために、幹細胞、エクソソーム、またはバイオシグナル伝達分子と様々なヒドロゲル生体材料との組み合わせが頻繁に研究されています。したがって、ヒドロゲルなどの注射可能なシステム、または様々なバイオプリンティング法によって形成された埋め込み可能な導管構造の製造は、末梢神経工学において重要性を増している。通常の条件下では、幹細胞は体の再生細胞であり、それらの数と機能はそれらの集団を保護するために時間とともに減少しません。これらは特殊な細胞ではありませんが、損傷に応じて適切な刺激を受けると分化することができます。幹細胞システムは、幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境の影響下にあります。末梢神経損傷、特に神経緊張症では、切断された神経終末を外科的に結合した後でも、この微小環境を完全に救助することはできません。複合生体材料と複合細胞療法のアプローチは、生分解性、生体適合性、加工性などのさまざまな特性の観点から、材料の機能と適用性を向上させます。そこで、本研究では、グラフェンベースのバイオハイブリッドハイドロゲルパターニングの調製と使用を実証し、神経再生に有効なソリューションとなる幹細胞の神経細胞への分化効率を調べることを目的としています。

概要

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生物の内部構造と環境を橋渡しするメカニズムである神経系は、中枢神経系と末梢神経系の2つの部分に分けられます。末梢神経損傷は、救急科に来院し、さまざまな外傷のために発症する患者の1.5%〜5%を構成する世界的な問題であり、重大な失業につながります1,2,3。

今日、末梢神経工学への細胞アプローチは非常に興味深いものです。幹細胞は、これらのアプローチで使用される細胞の中で最初に来ます。通常の条件下では、幹細胞は体の再生細胞であり、それらの数と機能はそれらの集団を保護するために時間とともに減少しません。これらの細胞は特殊化されていますが、損傷に応答して適切な刺激を受けると分化することができます4,5。幹細胞仮説によれば、幹細胞システムは幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境の影響下にあります。幹細胞の保存と分化は、細胞と足場7を使用した組織工学によって再構成できる微小環境6の存在なしには不可能です。組織工学は、工学と生物学の両方の原則を含む学際的な分野です。組織工学は、生体組織を置き換えることができ、損傷した組織を除去し、機能的な組織を提供することによってこれらの組織の再生に使用できる人工組織を作成するためのツールを提供する8。組織工学の3つの基礎の1つである組織足場は、天然および合成材料とは異なる方法を使用して製造されます9。3次元(3D)印刷は、さまざまな方法を使用して複雑な形状をシンプルかつ用途の広い製造することにより、欠陥のある組織を交換または修復するために広く使用されている新しい積層造形技術です。バイオプリンティングは、バイオインク10と呼ばれる細胞と生体材料の共存を可能にする積層造形方法です。神経細胞同士の相互作用を考慮すると、研究はグラフェンなどの導電性生体材料候補に移行しています。フレキシブルエレクトロニクス、スーパーキャパシタ、電池、光学、電気化学センサー、エネルギー貯蔵などの特性を有する単層カーボンナノプレートは、組織工学の分野で好ましい生体材料である11。グラフェンは、損傷した組織や臓器の増殖と再生が行われた研究で使用されています12,13。

組織工学は、足場、細胞、生体信号分子という3つの基本的な構成要素で構成されています。末梢神経損傷に関する研究には、これら3つの構造を完全に提供するという点で欠陥があります。幹細胞または生体シグナル分子のみを含む生体材料、幹細胞の分化を可能にする生理活性分子の欠如、使用される生体材料の生体適合性の欠如、および組織ニッチにおける細胞の増殖への影響の低さなど、研究で製造および使用される生体材料にはさまざまな問題がありました。 したがって、神経伝導は完全には実現されていません2,13,14,15,16。これには、神経再生の最適化、筋萎縮の減少17,18、およびそのような問題に対する成長因子を備えた必要なホーミング19の作成が必要です。この時点で、診療所に移される外科用生体材料プロトタイプの神経活動の特性評価と分析は非常に重要です。

したがって、この方法研究では、3Dバイオプリンターによって形成されたグラフェンナノプレートによるバイオインクヒドロゲルパターニングと、それに含まれる幹細胞の神経原性分化に対するその有効性を調査します。また、ニューロスフェアの形成と分化に対するグラフェンの影響も調査されています。

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プロトコル

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1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞の培養

  1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC、ATCC製)を-80°Cの冷凍庫から取り出します。Yurie et al.20に記載されているように、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペンストレプト、および1%L-グルタミンを含むDMEM-F12培地でWJ-MSCを室温の滅菌層流で培養します。

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結果

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グラフェン毒性と2Dイメージング
得られたMTT結果の統計解析を統計解析ソフトでテューキー検定による一元配置分散分析で行い、得られたグラフを 図2に示す。対照と比較したグラフェン百分率は、0.001%グラフェン濃度(**p < 0.01)についてのみ有意な減少を示した。他の群と対照との間に有意差はなかった(p > 0.05)。したがって、MTT試験結果およびステッチング画像に従って、この濃度への曝露後に最も高い生存率が観察されたため、最適なグラフェン濃度は0.1%であると決定された。

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図2:細胞増殖に対するグラフェン濃度の影響の調査。

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ディスカッション

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従来の2D手法に対するエンジニアリングされた3D足場で適用される処理の利点は、日々ますます顕著になっています。これらの治療法で単独で、または生体適合性と生分解性の低いさまざまな生体材料から製造された足場と一緒に使用される幹細胞は、通常、末梢神経の再生には不十分です。ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)は、特に取得のためのプロトコルの最適化、それらの増殖能力、およびそれらの分化能力を考慮すると、適切な候補細胞株であるように思われます29。この研究では、2Dおよび3D培養の両方で幹細胞とグラフェンの相互作用を調べました。また、生成されたバイオハイブリッドヒドロゲル群の神経原性分化を2D環境と比較しました。バイオインク上でのニューロスフェア形成を免疫染色により実証した。さらなる研究では、神経チャネルとして注入または移植できる候補プロトタイプをSEMおよびFT / IR法によって特徴付けました。この研究は、生産された生体材料の特性、細胞と生体材料の相互作用、および生体材料の存在下での幹細胞の神経分化を特徴付けます。次の段階では、移行への影響が検討されます。

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開示事項

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著者は、利益相反はないと宣言しています。このプロジェクトは、3Dバイオプリンティング技術の開発者であるHD Bioinkと共同で実施されました。

謝辞

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この研究で使用されたグラフェンは、カークラレリ大学の機械工学科で開発されました。カラベヨオール博士から寄贈されました。グラフェン毒性試験は、TÜBİTAK 2209-B産業指向学部論文支援プログラムの範囲内で完了した「グラフェンドープバイオインクを使用した3Dバイオプリンター上での間葉系幹細胞の印刷と分化」(出願番号:1139B411802273)というタイトルのプロジェクトによって資金提供されました。研究の他の部分は、ユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)によって提供された研究資金によってサポートされました。タイムラプスイメージング段階で使用したGFPを有する間葉系幹細胞は、バイロステムバイオテクノロジーから寄贈されました。著者らは、生産的な議論をしてくれたDarıcıLABとYTU細胞培養および組織工学LABチームに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント

遠心日		立細胞培養および生体材料ステップに使用
0.1N CaCl2HD バイオインク架橋剤
0.22 & マイクロに使用;mの膜フィルターAιSιmo滅菌に使用
0.45µmシリンジフィルターAιSιmo滅菌に使用
1.5mL 円錐管エッペンドルファバイオインク滴に使用
15mL ファルコンチューブネスト細胞培養ステップに使用
25 cm2 細胞培養フラスコ (ファルコン、TPP 組織培養フラスコネスト細胞培養に使用
3D バイオプリンティングAxolotl Biosystems Bio A2 (トルコ)バイオプリンティングステップ
50 mL ファルコンチューブネスト細胞培養ステップで使用
6/24/48/96ウェルプレート(ファルコン、TPPマイクロプレート)メルクミリポア細胞培養ステップで使用
75 cm2 細胞培養フラスコ(ファルコン、TPP組織培養フラスコネスト細胞培養に使用
抗マウスIgG-FTIC-ウサギサンタクルスバイオテクノロジーJ1514セコン抗体、色素
に使用アンチマウスIgG-SC2781-ヤギサンタクルスバイオテクノロジーC3109セコンダー抗体、染料
に使用される Auコーティング装置 EM ACE600ライカSEMイメージング前の生体材料セクションの金メッキ用
オートクレーブNUVE-OT 90L滅菌プロセスに使用されます。
オートクレーブNUVE-OT 90L滅菌プロセスに使用されます。
Cell Cultre CabineHera Safe KS細胞培養プロセスに使用
ダルベッコ改変イーグルス培地/栄養混合物-F12シグマRNBJ7249細胞培養培地として使用
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQUANTAFEG 450for SEM
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16A細胞培養培地に添加して使用しました。
冷凍庫-80°C;CパナソニックMDF-U5386S-PE私たちは細胞と得られたエクソソームを保存するために使用されました
ゼラチン-アルギン酸バイオインク粉末HD バイオインク生産されたバイオインクステップに使用
GFPラベル-WJ-MSCsウイルスステム細胞-バイオインク相互作用へのイメージングに使用
グラフェンナノプレートレット(グラフェン-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.3D-Gバイオインクの製造に使用
免疫蛍光抗体(N-CAD;&β;-III Tubulin)細胞シグナル伝達およびSanta Cruz色素に使用
JASCO 6600TetraFTIR
MTTアッセイシグマ生存率試験
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液CapricornPB-S汚染を防ぐために培地に添加しました細胞培養で。
トーマスライドIsolab細胞のカウントに使用
タイムラプスイメージングシステムZeiss Axio.Observer.Z1イメージング
Tripsin-EDTAマルチセルフラスコを使用して、表面を覆う細胞を除去しました。
ボルテックスバイオベース作製バイオインク用ステップ
WJ-MSCsATCC細胞培養プロセスに使用

参考文献

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