方法論記事

マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

DOI：

10.3791/63637

⸱

2022年5月16日

 ,  ,  , 
1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、スペクトル集束モジュールとデュアル出力パルスレーザーを統合し、金ナノ粒子と癌細胞の高速ハイパースペクトルイメージングを可能にする方法について説明します。この研究は、標準的なレーザー走査型顕微鏡でマルチモーダル非線形光学技術の詳細を実証することを目的としています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体系における金ナノ粒子(AuNP)の調査は、AuNPと生体組織との相互作用を明らかにするために不可欠です。さらに、誘導ラマン散乱(SRS)、2光子励起蛍光(TPEF)、過渡吸収(TA)などの非線形光信号をイメージングプラットフォームに統合することで、細胞構造とAuNPの生体分子コントラストをマルチモーダルに明らかにすることができます。本稿では、マルチモーダル非線形光学顕微鏡法を紹介し、それを応用して癌細胞におけるAuNPの化学的特異的イメージングを実行します。このイメージングプラットフォームは、より効率的に機能化されたAuNPを開発し、それらが腫瘍、細胞周囲、または細胞空間を取り巻く血管系内にあるかどうかを判断するための新しいアプローチを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

金ナノ粒子(AuNP)は、生体適合性イメージングプローブとして、例えば、さまざまな生物医学的用途における効果的な表面増強ラマン分光法(SERS)基板として大きな可能性を示しています。主な用途としては、バイオセンシング、バイオイメージング、表面増強分光、がん治療のための光熱療法などの分野が挙げられます1。さらに、生命系におけるAuNPの調査は、AuNPと生体系との相互作用を評価および理解するために重要です。フーリエ変換赤外(FTIR)分光法2、レーザーアブレーション誘導結合質量分析法(LA-ICP-MS)3、磁気共鳴画像法(MRI)4など、さまざまな分析技術を使用して組織内のAuNPの分布を調べることに成功しています。それにもかかわらず、これらの方法は、時間がかかり、複雑なサンプル調製を伴う3、長い取得時間を必要とする、またはサブミクロンの空間分解能の欠如2,4など、いくつかの欠点を抱いています。

従来のイメージング技術と比較して、非線形光学顕微鏡は生細胞とAuNPをプロービングするためのいくつかの利点を提供します:非線形光学顕微鏡は、より深いイメージング深度を達成し、近赤外超高速レーザーを使用して固有の3D光学セクショニング機能を提供します。イメージング速度と検出感度の大幅な向上により、2光子励起蛍光(TPEF)5,6,7および第2高調波発生(SHG)8,9,10顕微鏡法は、生細胞および組織における内因性生体分子の非侵襲的イメージングをさらに改善することが実証されています。さらに、過渡吸収(TA)11,12,13,14や誘導ラマン散乱(SRS)15,16,17,18などの新しいポンププローブ非線形光学技術を利用して、細胞構造とAuNPのラベルフリー生化学的コントラストを導き出すことができます。ナノ粒子の化学的摂動がそれらの物理的特性を変化させ、したがって細胞内での取り込みを変化させるため、外因性標識を使用せずにAuNPを視覚化することは非常に重要です。

このプロトコルは、AuNPと癌細胞の高速マルチモーダルイメージングを可能にする、2波長パルスレーザー用のスペクトル集束タイミングおよび再結合ユニット(SF-TRU)モジュールの実装を提示します。この研究は、レーザー走査型顕微鏡で統合されたTPEF、TA、およびSRS技術の詳細を実証することを目的としています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.レーザーシステムのスイッチを入れる

  1. システムを起動する前に、インターロックシステムのスイッチを入れ、アームレーザーを選択してください。
  2. ソフトウェアを使用してPCの電源を入れ、デュアル出力フェムト秒レーザーを制御します。
  3. デュアル出力フェムト秒レーザーのソフトウェアをロードします。このソフトウェアにより、レーザーの電源のオンとオフが可能になり、ポンプビームの波長を直接制御できます。
  4. 電源アイコンを3カウント押し続けて、レーザー放射をオンにします。
  5. レーザーがウォームアップし、ソフトウェアでレーザー対応ライトが緑色に点灯するまで待ちます。
  6. ポンプビームの波長は、ソフトウェアを介して直接制御されます。これは680〜1,300nmの範囲であり得る。C-Hラマン振動領域の細胞イメージングには、802 nmを選択します。
  7. 調整可能なポンプビームと1,045nmのストークスビームのシャッターを、絞り画像を3秒間押し続けて開きます。
    注意: レーザー安全ガイダンスデュアル出力フェムト秒レーザーはクラスIV赤外線パルスレーザーであり、視力に永久的な損傷を与える可能性があります。したがって、この手順を実行する際には、すべてのレーザー安全ローカルルールに従う必要があります:(i)レーザー安全トレーニングを受けた許可されたユーザーのみが手順を実行できます。(ii)ラボへの入場は、部屋のドアのインターロックを備えたスワイプカードアクセスを介して行われます。(iii)ほとんどの操作では、レーザービームは完全に密閉されています。(iv)レーザービームが露光されるときは、レーザー安全ゴーグルを着用する必要があります(ポンプとストークスビームの両方をOD 9+遮断するLG7レーザー安全ゴーグルを使用してください)。

2. スペクトル集束タイミング再結合ユニット(SF-TRU)のスイッチを入れる

  1. SF-TRUユニットの遅延段とレーザーアッテネータを制御するレーザーソフトウェアを使用して、同じPCにATMソフトウェアをロードします。
    注意: このユニットは、ポンプとストークスビームが空間的に重なっていることを確認し、ポンプとストークスビームの分散を制御し、ポンプとストークスビームの間の時間遅延を制御する役割を果たします。ポンプビームとストークスビームの両方の偏光は垂直です。各ビームには、SF-TRUを出る前に偏光を個別に制御するための半波長プレートが装備されていることに注意してください。
  2. ポンプとストークスレーザーの両方が<10%(ポンプ)と<15%(ストークスビーム)に減衰していることを確認してください。ビームが減衰しない場合、レーザー出力はシステムに損傷を与え、生物学的サンプルを燃焼させる可能性があります。
  3. セルラーイメージングの場合、最適なレーザー設定を6%(ポンプ)と10%(ストークス)に設定し、サンプルの12 mWと30 mWに対応します。
  4. SF-TRUには、フェムト秒(fs)モードとピコ秒(ps)モードの2つの設定があります。
  5. fsモードの場合は、ボックスの両側にあるノブを押し込みます(これにより、ビームパスから分散格子が削除されます)。
  6. psモードの場合は、ボックスの両側にあるノブを引き出します(これにより、分散格子がビームパスに配置されます)。
  7. ハイパースペクトルイメージングの場合は、psモードを選択します。
  8. 遅延容量を確認してくださいtageこのシステムでのCHイメージングのためにポンプとストークスビームが時間的に重なるように正しい位置にあります。
  9. ポンプとストークスビームの分散設定が正しいことを確認してください。802 nmポンプの場合、これはポンプビームの場合は5 mm、ストークスビームの場合は30 mmです。

3. SRSイメージングのためのストークスビームの変調

  1. SRS検出の場合は、ストークスビームの強度を変調します。
  2. ビーム変調の信号発生器をオンにします。
  3. 次のような以前の設定を思い出してください。
    出力1:矩形波:周波数= 19.5 MHz、振幅= 1.4 V。
    出力2:矩形波:周波数= 19.5 MHz、振幅= 300 mV。
  4. 出力1と2のスイッチを入れます。
  5. 出力1をBNCケーブル を介して SF-TRUボックス内のEOM用のアンプに接続します。
  6. 出力2をSRS検出に使用するロックインアンプにBNCケーブル で 接続します。
  7. ガントリーのアンプへの電源をオンにします。

4.ロックインアンプのスイッチを入れる

  1. SRSイメージングには、大面積フォトダイオードと専用のロックインアンプで構成されるSRS検出モジュールを使用します。
  2. ガントリーのロックインアンプへの電源をオンにします。
  3. ロックインアンプ「SRS検出モジュール」のソフトウェアをPCにロードします。
  4. ソフトウェアで、位相 = 0°、オフセット = -80 mW、ゲイン = 58 dB の設定を選択します。
  5. ソフトウェアでロックインアンプ積分時定数を選択します:細胞イメージングの場合、2μsの時定数は高品質の画像を提供します。

5.レーザー走査型顕微鏡での操作

  1. リモコンボックスを除くすべての機器のプラグをオンにします。ガントリーの上部にあるコントロールボックスでスタンバイが点灯するまで待ちます。
  2. ガントリーのリモコンボックスのスイッチを入れ、ボックスの背面のスイッチを入れます。リモートライトが(コントロールボックスの)青色になるまで待ち、[ 操作の開始]を押します。
  3. レーザー走査型顕微鏡のPCの電源を入れます。
  4. 共焦点顕微鏡ソフトウェアを実行します。
  5. コンピュータソフトウェア を介して 顕微鏡の光路を確認してください。
    注:SRSイメージングに適したものにするために、顕微鏡にいくつかの変更が加えられました:(i)ビームパスでは、レーザービームがスキャンユニットに入るフィルターホイールに775nmのショートパスが追加されており、これはコンピュータソフトウェアのLightpathタブで選択できます。(ii)共焦点顕微鏡の内蔵PMTを検出に使用する代わりに、特注の検出器が透過光路に追加され、SRSとCARSの両方の検出が可能になりました。(iii)これらの検出器からの出力は、ガントリーのアナログボックスに接続されています。PMTからのCARS信号はBNCケーブルを介してCD1に接続され、ロックインアンプからのSRS信号はBNCケーブルを介してCD2に接続されます。
  6. タッチスクリーン、リモコンノブ、またはコンピューターソフトウェアを介してフォーカスを制御します。
  7. ソフトウェアで目的の画像設定を選択します。これには、ズーム、ピクセル単位の画像サイズ、ピクセル滞留時間が含まれます。
  8. イメージング速度(ピクセル滞留時間)がロックインアンプソフトウェアで設定された積分時間よりも大きいことを確認してください。
    注:イメージングにはNA1.2水浸対物レンズを使用しました。

6. 顕微鏡ステージへのサンプルの取り付け

  1. 以下のようにしてイメージング用の細胞サンプルを調製する。
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI-1640で4T1マウス乳癌細胞を培養する。2日ごとに培地を交換し、70%〜80%のコンフルエントで細胞を通過させます。
      注:パッセージ8〜10は、ここで説明する実験の過程で使用されました。
    2. イメージング実験では、正方形のカバーガラス上で1 x 10 5細胞を37°C、5 %CO2で24時間インキュベートします。次に、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、金ナノ粒子(細胞培養培地で1:100希釈、ストック濃度:2.3 x 10 10粒子/mL、直径:60 nm)で4時間インキュベートします。
    3. イメージングの前に、細胞を氷冷PBSで洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で15分間固定します。細胞をPBS 3xで洗浄し、イメージングのために2つのカバーガラスの間に取り付けます。
  2. 水浸対物レンズの上に蒸留水の液滴を置き、レーザービームを対物レンズとサンプルの間のサンプルに集束させます。次に、サンプルを顕微鏡ステージに置きます。
  3. NA 1.4のコンデンサーは、順方向に伝播した光を収集します。コンデンサーとサンプルの間に水滴を塗布してイメージングします。コンデンサーの高さをサンプルから約1mm上に調整して、最大量の光を収集します。
  4. SRS検出器は可動マウント上にあり、収集光路からスライドインおよびスライドアウトすることができます。白色光を使用してサンプルに焦点を合わせるには、SRS検出器をビームパスから外します。
  5. 検出器をビームパスに戻し、SRSイメージングの準備をします。

7. ラマンシフトの変更とハイパースペクトルデータスタックの収集

注意: イメージングが行われるラマンシフトは、SF-TRUボックスの遅延ステージの位置とレーザーシステムからのポンプビームの波長に依存します。

  1. ラマンシフトが大きく変化する場合は、レーザーの波長を変更します。たとえば、2,800〜3,100 cm-1のCH振動をイメージングするには802 nmを選択し、アミドIピークの1,600 cm-1付近をイメージングするには、898 nmのポンプビームを選択します。ソフトウェアを介してこれを調整します。
  2. ラマンシフトを微調整するには、SF-TRUユニットの遅延段をスキャンします。
  3. SF-TRUは、遅延ステージ位置をミリメートル(mm)単位で提供します。遅延ステージの位置をmmからcm-1に変換するには、ポリスチレンビーズのサンプルを使用してキャリブレーションハイパースペクトルスキャンを実行し、キャリブレーションスキャンで見つかったピーク位置を自発ラマンセットアップで取得したピーク位置と比較します。これにより、mm単位の遅延段位置をcm-1単位のラマンシフトに変換する線形方程式が得られます。
  4. ハイパースペクトルスキャンを生成するには、さまざまな遅延ステージ位置で時系列の画像を撮影します。
  5. 画像の取得と遅延ステージの移動を同期させるには、アナログユニットを使用してSF-TRUシステムとの間でTTL信号を送受信します。
    注:これを行うために、アナログボックスには次の接続があります:(i)TRIG OUT VD1:これはBNC を介して SF-TRUに接続され、TTL信号を送信して遅延段に+1増分を移動するように指示します。(ii)TRIG1では、遅延ステージが移動を終了するとBNC を介して 信号を受信し、これを使用して時系列の次の画像をトリガーします。
  6. ハイパースペクトルデータセットの場合は、共焦点顕微鏡ソフトウェアで次の設定を選択します。
    1. [トリガー] タブで、[TTL トリガーで開始 (オン)] と [トリガー (フレームごと)] を選択します。
    2. [ 系列 ] タブで、時系列を [ オン ] に設定し、z 系列を [オフ] に設定します。
    3. ATMソフトウェアのステップ数と一致するように時系列のフレーム数を設定します(ここでは101ステップを使用します)。
  7. ATMソフトウェアで、[ 実行 ]タブに移動します。
    1. ハイパースペクトルスキャンの開始と停止の遅延ステージ位置をミリメートル単位で設定します。CH高波数領域の場合は、開始位置= 90.25 mm、停止位置= 92.25 mmを使用します。
    2. ステップ数が共焦点顕微鏡ソフトウェアのフレーム数と一致していることを確認します。
  8. 正しい設定を確認した後、最初に共焦点顕微鏡ソフトウェアでハイパースペクトルスタックを起動します。 [取得 ]に移動し、[ スキャンの開始]をクリックします。次に、ATMソフトウェアで[ 開始]をクリックします。これにより、一連の画像の収集が開始され、選択した開始位置と停止位置の間の遅延ステージ位置が徐々に増加します。
  9. ハイパースペクトル画像シリーズをマルチフレーム.tifファイルとしてエクスポートし、適切なソフトウェアパッケージを使用してキャリブレーションを実行します。
  10. キャリブレーションが完了したら、線形キャリブレーション式を使用して、遅延ステージの位置をラマンシフトに変換します。
  11. CH振動領域(2,800〜3,100 cm-1)のイメージングをアミドI振動領域1,500〜1,700 cm-1)に切り替えるには、次の手順を実行します。
    1. レーザーソフトウェアのポンプ波長を802nmから898nmに変更します。
    2. ATM ソフトウェアのストークス分散設定を 30 mm から 5 mm に変更します。
    3. SF-TRUボックス内のポンプビーム分散経路のミラーを少し調整します。これは、ミラーマウントの下部ノブを調整することで行われ、ミラー角度が段階的に変更されます。
    4. アミドI領域でハイパースペクトルスキャンを実行する場合は、ATMソフトウェアの開始位置と停止位置をそれぞれ89mmと91mmに設定します。
      注意: レーザービームが露出するため、この手順ではレーザー安全ゴーグルを着用する必要があります。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

スペクトル集束タイミングおよび再結合ユニット(SF-TRU)モジュールは、デュアル出力フェムト秒レーザーと修正レーザー走査型顕微鏡の間に導入されます。この研究で使用された調整可能な超高速レーザーシステムには、1つのビームを固定1,045 nmの波長で提供し、もう1つのビームを680〜1,300 nmの範囲で調整可能な2つの出力ポートを備えています。SF-TRUモジュールとマルチモーダルイメージングプラットフォームの詳細な回路図を 図1に示します。SF-TRUは、2つのフェムト秒レーザービームをピコ秒パルスにチャープするために使用され、2つのビームを空間的および時間的に重ね合わせます。ハイパースペクトル誘導ラマン散乱(SRS)イメージングは、ピコ秒ポンプとストークスパルスの間の遅延をスキャンすることによって実行されます。

すべてのサンプルは、修正された倒立顕微鏡上の高開口数(NA)対物レンズを通してパルスレーザーによって照らされます。SRSおよびTPEF信号は、高NAコンデンサを使用して順方向に収集されます。SRS顕微鏡では...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、SF-TRUモジュールと超高速デュアル出力レーザーシステムの組み合わせにより、マルチモーダル顕微分光法への応用を実証しました。マルチモーダルイメージングプラットフォームは、がん細胞による金ナノ粒子(AuNP)の取り込みを調査する機能により、レーザービームがAuNPに吸収された場合の温熱がん治療に対する細胞の応答を視覚化できます。

さらに、2組の格子対を使用して各レーザービームのチャープを制御するスペクトルフォーカシング技術を採用することにより、迅速な化学的に特異的なイメージングと高いスペクトル分解能が達成されます。チャープ用の固定長ガラス棒の使用と比較して、格子ペアは、関心のあるラマン線のスペクトル分解能と線幅を一致させることができます19。

さらに、このシステムは、顕微鏡内のアライメントに影響を与えることなく、特別に設計された手動スライダーを利用してビームパスから格子を除去することにより、フェムト秒からチャープピコ秒レジームに簡単に切り替えることができます。高感度と...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、EPSRC Grants: Raman Notheranostics (EP/R020965/1) および CONTRASTファシリティ (EP/S009957/1) の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
APE SRS検出ユニットAPE(Angewandte Physik &Elektronik GmbH)APEロックインモジュールポンプビームを検出するための大面積Siフォトダイオードと、ビーム変調を検出するためのロックインアンプを含む複合システム
共焦点スキャニングユニットオリンパスFV 3000イメージングに使用される共焦点スキャニングユニット
、4% w/v、1.0 & micro;mInvitrogenC37483ポリスチレン微小球
カバースリップThorlabsCG15CH222 mm x 22 mm カバースリップ 細胞播種用
FBSGibco10500-064ウシ胎児血清 (熱不活性化)
FlouviewオリンパスFV31S-SWレーザー走査型顕微鏡制御ソフトウェア
Function GeneratorBX precision40543SF-TRUのEOMに供給される矩形波関数を生成するために使用され、ストークスビームで変調を生成するために
金ナノ粒子ナノ粒子 ナノパルツA11-60球状金ナノ粒子、直径60 nm
入力出力インターフェースオリンパスFV30 アナログこのユニットは、PMTおよびLockInからの電圧読み出しを共焦点スキャンソフトウェアに供給し、オリンパスの顕微鏡とSF-TRUの間でタイミングパルスを送信することを可能にします単位。
InSight X3NewportSpectra-Physicsデュアル出力フェムト秒パルスレーザー。チューナブル(680–1300 nm)および固定(1045 nm)レーザー出力、繰り返し周波数80 MHz
顕微鏡フレームオリンパスIX83倒立顕微鏡
マウス4T1細胞ATCCCRL-2539マウス乳がん細胞
NA 1.2 水浸対物レンズオリンパスUPLSAPO60XW/IR多光子60倍対物レンズの作動距離は0.28mmです。他の同様の目的を使用することができます。
NA 1.4 コンデンサーニコンCSC1003励起対物レンズよりも高いNAを持つ他のコンデンサーも使用できます。
PMT浜松R3896PMTは、CARSのmcrsocopy
のPMTコネクタ松C13654-01-Y002PMT用コネクタ
RSPD-3303 CPMTに正しい電圧を供給するために使用されるプログラマブル電源
RPMI-1640GibcoA10491-01それ以来、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地は、さまざまな哺乳類細胞に適していることがわかっています。
SF-TRUニューポート・スペクトラ・フィジックスSF-TRUシステムは、2つのレーザー出力の時間遅延と分散を制御し、SRSに必要なビーム変調を行うために設計されています
CMLラテックスビーズの。浜電源RS 。

参考文献

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