方法論記事

パインウッド線虫、ブルサフェレンコス・キシロフィルスにおけるRNA干渉の応用

DOI：

10.3791/63645

⸱

2022年3月9日

 ,  ,  ,  , 
1College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural & Forestry University

この記事について

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サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、遺伝子機能の研究を容易にするために、 ブルサフェレンコス・キシロフィルス におけるRNA干渉の詳細な浸漬方法を紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マツノザイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusは、世界で最も破壊的な侵入種の1つであり、松の木のしおれと最終的な死を引き起こします。経済的・環境的意義は認識されているものの、植物寄生線虫(PPN)の詳細な遺伝子機能を従来の順遺伝学やトランスジェニック法を用いて研究することは、これまで不可能であった。しかし、逆遺伝学技術として、RNA干渉(RNAi)は、B. xylophilusを含む線虫の機能遺伝子の研究を容易にする。

この論文では、他の病原性線虫の発生と繁殖に重要な役割を果たすことが報告されているB. xylophilusのppm-1遺伝子のRNAiの新しいプロトコルを概説する。RNAiについては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により標的断片の5'末端にT7プロモーターを連結し、インビトロ転写により二本鎖RNA(dsRNA)を合成した。続いて、dsRNA送達は、合成神経刺激剤と混合したdsRNA溶液に線虫を浸すことによって達成された。B. xylophilusの同期幼体(約20,000個体)を洗浄し、25°Cの暗所で24時間、浸漬バッファー中のdsRNA(0.8μg/mL)に浸した。

同量の線虫を、対照としてdsRNAを含まない浸漬緩衝液に入れた。一方、別の同量の線虫を、対照として緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子dsRNAを含む浸漬緩衝液に入れた。浸漬後、標的転写産物の発現量を、リアルタイム定量PCRを用いて決定した。RNAiの効果は、表現型の顕微鏡観察および群間の成人の体の大きさの比較を用いて確認された。現在のプロトコルは、 B. xylophilus および他の寄生線虫の遺伝子の機能をよりよく理解するための研究を、遺伝子工学による制御戦略の開発に向けて進めるのに役立つ可能性がある。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物寄生性線虫(PPN)は、食料安全保障と森林生態系に対する継続的な脅威です。彼らは毎年推定1,000億米ドルの経済的損失を引き起こし、そのうち最も問題となるのは主に根結び線虫、嚢胞線虫、および松林線虫です。マツノザイセンチュウ、 Bursaphelenchus xylophilusは、渡り鳥、内寄生性線虫であり、これはマツ材線虫病2の原因病原体である。それは世界中の松林に大きな害を及ぼしています3.Van Megen et al.4の用語を使用すると、 B. xylophilus はParasitaphelenchidaeのメンバーであり、クレード10に属していますが、他のほとんどの主要な植物寄生虫はクレード12に属しています。

独立した最近進化した植物寄生虫として、 B. xylophilus は比較研究のための魅力的なモデルです。今日まで、クレード12に属する根結び線虫および嚢胞線虫に関する実質的な研究があり、これらは義務的で座りがちな内部寄生虫であり、最も激しく研究された線虫のいくつかである。しかし、この重要な分野でさらなる研究を行うことには、寄生遺伝子の機能が研究のボトルネックであるという大きな課題が伴います。機能研究には、一般に、異所性発現およびノックダウン/アウト実験が含まれるが、線虫の効果的な遺伝的形質転換プロトコルに依存する。その結果、PPNにおける逆遺伝学は、RNAiによる遺伝子サイレンシングにほぼ独占的に依存している。

RNAiは、真核細胞に広く存在するメカニズムで、二本鎖RNA(dsRNA)を導入することで遺伝子発現をサイレンシングします5。現在までに、dsRNAによって誘導される転写後遺伝子サイレンシング機構は、研究されたすべての真核生物において見出されており、RNAi技術は、機能ゲノミクス研究およびその他の応用のツールとして、多くの生物において急速に発展してきた。1998年に カエノラブディティス・エレガンス でRNAi機構が発見されて以来6、RNAi技術は線虫の遺伝子機能を同定するための有効な方法となり、病原性線虫を効果的に防除する新しい方法として提案されている7。

RNAiは技術的に容易にdsRNAに幼体を浸すのに十分である。しかしながら、このアプローチの有効性および再現性は、線虫種および標的遺伝子8によって大きく異なる。根結び線虫 Meloidogyne incognitaのRNAi経路に関与する20の遺伝子のサイレンシングを、長いdsRNAをトリガーとして用いて調査し、その結果、いくつかの遺伝子の発現の増加および変化なしを含む多様な応答をもたらした9。これらの結果は、標的遺伝子がRNAiノックダウンに対して異なる反応を示す可能性があり、RNAiを介した線虫防除の標的としての適合性の徹底的な評価を必要とすることを示している。しかし、現在、 B. xylophilusの発生および生殖生物学に関する研究は不足しています。

以前の研究10、11、12、13の続きとして、dsRNAの合成、合成神経刺激剤浸漬、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)検出を含む、B. xylophilusのppm-1遺伝子の機能を研究するためにRNAiを適用するためのプロトコルをここで説明する。この実験的アプローチから得られた知識は、基本的な生物学的システムの理解と松枯れ症の予防に著しく貢献する可能性が高い。

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プロトコル

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この研究は、浙江省農林大学の動物実験評議会によって承認されました。 B. xylophilus 分離NXY61は、もともと中国浙江省の寧波地域にある病気の Pinus massoniana から抽出されました11。

1. 遺伝子クローニング

注: このプロトコルで使用されるプライマーの詳細については、 材料表 を参照してください。

  1. 線虫を集める。
    1. ジャガイモデキストロース寒天(PDA)プレート上の灰色かび病菌の菌糸体上のB.キシロフィラス株を25°Cで3〜5日間培養する。
    2. ベルマン漏斗法14を用いて線虫を採取する。
      1. クランプされたゴムチューブを漏斗の下に置き、漏斗の口に2層のろ紙を置きます。真菌培養物を漏斗に移し、水を加えて真菌マットを浸す。2時間待ってから、線虫を集める。
  2. 全RNA抽出試薬( 材料表参照)11 を用いて線虫から全RNAを抽出し、以下の工程に従って抽出する。
    1. 500 μL の抽出試薬と 100 μL の磁気ビーズを 2 mL の遠沈管に加えます。線虫の20μLを吸引し、サンプルをグラインダーに移し、9,000 × g で30秒間粉砕する。5分間インキュベートし、次いで12,000 × g および4°Cで10分間遠心分離する。
    2. 上清を新しい遠沈管に移す。クロロホルムを100μL加え、チューブにキャップを掛け、チューブを数回ひっくり返して混合する。3分間インキュベートした後、4°Cで12,000× g で10分間遠心分離する。
    3. 上清を新しい遠沈管に移す。イソプロピルアルコール250μLを加え、激しく渦を巻きます。12,000 × g で10分間遠心分離する。
    4. 上清を捨てる。500 μL の 75% エタノールを加えて RNA を洗浄し、サンプルをボルテックスします。12,000 × g および4°Cで5分間遠心分離する。
    5. RNAペレットを5分間風乾する。
    6. ペレットを30 μLのRNaseフリー水に再懸濁します。
    7. 40 = μg RNA/mL のA260 ×希釈×式を使用して RNA 濃度を計算します。A260/A280 比を計算します。
      注: ~2 の比率は純粋であると見なされます。
  3. 良質なRNAの逆転写を行い、cDNA鋳型を得る。
    1. 一対の特異的プライマーppm-1-F/R(材料表参照)を設計して使用し、B. xylophilus(GenBankアクセッション番号QTZ96795)のBx-ppm-1遺伝子の部分コード配列を増幅します。
    2. ppm-1遺伝子配列を、標準クローニングプロトコル11に従ってT7プロモーターを含むpGEM-Teasyベクターにクローニングする。
      1. PCR 反応は、2 μL の cDNA、25 μL の 2x Ex Taq ポリメラーゼプレミックス、2 μL の各プライマー (10 pmol/l)、滅菌蒸留水を最終容量 50 μL になるようにセットアップします。
      2. 以下のように増幅手順を行う:94°Cで5分間;続いて、94°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで1分のサイクルを35サイクル繰り返しました。72°Cで5分間の最終伸長工程を行った。
      3. 増幅産物をシーケンシング用のpGEM-T Easyベクターにクローニングします。

2. dsRNAの合成

  1. 両末端にT7プロモーター部位を付加するように設計されたプライマーを用いたPCRを用いて、dsRNA合成用のDNAテンプレートを調製する。プライマーの5'末端にT7プロモーター配列を付加する。
  2. ppm-1遺伝子断片(894 bp)を含むプラスミドをPCRの鋳型として使用し、T7プロモーター11を含む断片を回収する。上記のPCR手順およびシステムを使用する。
  3. インビトロ転写キットを使用してdsRNA11を合成します。
    1. 凍結した試薬を氷上で解凍する。
    2. 10 x 反応バッファー 2 μL、酵素ミックス 2 μL、および DNA 1 μg を遠沈管に加えます。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、標準的な4μLの反応を生じさせる。次いで、等量の4つのリボヌクレオチド溶液(ATP、CTP、GTP、およびUTP)を一緒に混合し、混合物の8μLをチューブに加える。十分に混合し、37°Cで4時間インキュベートする。
    3. 1 μLのDNaseを加え、よく混合し、37°Cで15分間インキュベートする。
    4. 反応を停止し、ヌクレアーゼフリー水30 μLおよびLiCl沈殿溶液30 μLを加えてRNAを沈殿させた。徹底的に混ぜる。-20°Cで一晩インキュベートする。
    5. 遠心分離機を12,000 × g および4°Cで15分間遠心分離する。 上清を捨てる。
    6. 1mLの75%エタノールを加えてRNAを洗浄する。試料をボルテックスし、12,000 × g および4°Cで10分間遠心分離する。
    7. RNAペレットを3分間風乾する。
    8. ペレットを30 μLのRNaseフリー水に再懸濁します。
    9. 分光光度計を用いてdsRNAの品質を分析する。dsRNAサンプル1 μLを測定台座上にピペットで入れ、波長を340 nmに設定した。1.0%アガロースゲルで製品を視覚化します。

3. 浸漬によるRNAi

  1. 4 μL の 5x 浸漬バッファー (0.05% ゼラチン、5.5 mM KH 2 PO 4、2.1 mM NaCl、4.7 mM NH4 Cl、3 mM スペルミジン) をdsRNA および ddH2O と混合し、全量 20 μL、最終RNA 濃度 0.8 μg/mL を生成します。
  2. J2幼虫を獲得する。
    1. 真菌培養物から線虫を収集し、直径6cmのガラス製ペトリ皿に移す。線虫が自由に泳ぐことができるように、皿に10mLの水を加える。線虫を皿に30分間保管し、卵が底に付着するのを待ちます。
    2. 水と線虫を慎重に取り除き、卵を邪魔しないようにしてください。すべての幼虫と成虫が取り除かれるまで手順を繰り返し、卵だけを皿に残します。
    3. 採取した卵を25°Cの暗所で24時間孵化させ、J2幼虫を得た。J2幼虫を集めてチューブに入れ、RNAi実験15のためにddH2Oで3回洗浄する。
    4. DsRNA溶液を入れた2mLチューブにJ2幼虫を移し、レゾルシノール溶液(ブリキ箔で包んで水に溶解)を加えて最終濃度1.0%とした。幼虫がdsRNAを効果的に吸収することを確実にするために、25°Cで24時間、振動台上で15×g の遠心分離で幼虫をインキュベートする。
    5. 同量の線虫を、dsRNAプローブを使用せずに、または対照としてGFP dsRNAプローブを使用して浸漬バッファーに浸します。GFP遺伝子(gfp、M62653.1)を非内在性コントロールとして使用し、遺伝子特異的プライマーT7-GFP-F/Rを用いてgfpのdsRNAを合成する。

4. qPCR 検出

  1. J2幼虫をddH2Oで洗浄し、標的遺伝子干渉、GFP遺伝子干渉、および妨害されていない対照群を含む。上述の方法を用いて各群から全RNAを抽出する。
  2. qPCR を開始します。
    1. q-ppm-1-F/Rプライマーを目的のソフトウェアを使用して設計します(材料表を参照)。
    2. 1 μL の cDNA、6 μL の蛍光プレミックス、0.4 μL の各プライマー (10 pmol/l)、および滅菌蒸留水を含む 12 μL で qPCR 反応をセットアップします。
    3. 次のようにqPCRを実行します:95°Cで2分間;その後、95°Cで10秒、55°Cで30秒、72°Cで1分のサイクルを40サイクル行った。
    4. actb遺伝子(GenBank受託番号EU100952)やtbb-2遺伝子(GenBank受託番号MT769316)、またはその他の遺伝子を内部参照遺伝子として用い、RNAi15後の遺伝子発現量の変化を評価した。
  3. サイクル閾値(Ct)値と溶解曲線に従って、2-ΔΔCt 法を用いて標的遺伝子の相対発現量を推定し、干渉効率を検証します。
    1. 標的遺伝子のCt値から各試料の内部参照遺伝子のCt値を減算し、ΔCt値を求めた。そして、対照群のΔCt値から干渉群のΔCt値を減算し、ΔΔCt値を求める。
      メモ: 0 より大きい ΔΔCt 値は、干渉が有効であることを示します。

5. RNAiに続く線虫成虫の体長の評価

  1. RNAi後、J2幼虫を B.シネレア 芝生上で成虫になるまでPDAプレート中で25°Cで60時間培養する。
  2. ベルマン漏斗法(ステップ1.1.2.1参照)14を使用して成虫を集める。
  3. 顕微鏡下で成虫線虫の画像を取得し、ImageJソフトウェア(または他の測定ソフトウェア)を使用して体長を測定します。
    1. ImageJ を使用して長さを測定するには、[ |を解析] を選択します。スケールを設定します。距離がわかっている場合は、描画された直線の長さの値を入力します。長さの単位を入力します。
    2. [グローバル] チェック ボックスをオンにし (すべての画像にこの標準を使用)、 [OK] をクリックして、測定する画像に直線で測定する長さを選択します。
    3. Ctrl+M (測定) コマンドを使用して結果を表示し、結果ウィンドウに記録します。
  4. 統計分析のために50匹の雄線虫と50匹の雌線虫の測定を行う12。
  5. 各サンプルの平均と標準偏差を計算してデータを分析します。スチューデントのt検定を使用して、異なるグループのサンプルの平均を比較し ます。

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結果

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RNAi後のB.キシロフィルスのppm-1発現の解析
GFP dsRNAを浸したB.キシロフィラスのppm-1遺伝子の相対発現量と、標的遺伝子dsRNAを浸したものの相対発現量は、それぞれ0.92および0.52であった(ddH2O処理対照群のppm-1遺伝子発現量を1とした)(図1)。したがって、外因性dsRNAは、B.キシロフィルスのppm-1発現に影響を及ぼさない。しかしながら、ppm-1 dsRNAは、標的遺伝子の発現を効果的に阻害することができる。

B.キシロフィルスの成長および発達に対する<...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B. xylophilusの生活史や寄生環境は他の線虫の生活史や寄生環境は異なりますが、この植物病原菌の分子病因に関する研究は限られてきました。 C. elegansおよび他の線虫におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集技術の適用において大きな進歩があったにもかかわらず、B. xylophilusに適用されたRNAi技術のみが現在までに公開されている17。RNAiは線虫の遺伝子機能を研究するために利用可能な最も強力なツールの1つであり、B. xylophilus遺伝子機能、シグナル伝達経路、および遺伝子治療を解明する研究に広く使用されている18,19,20。無脊椎動物モデルで使用される遺伝子ノックアウトアプローチとは対照的に、線虫における標的遺伝子のRNAi媒介ノックダウンは、遺伝子機能の迅速な評価を可能にする。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利益相反は宣言されませんでした。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国家自然科学財団(31870637、31200487)から資金提供を受け、浙江省主要研究計画(2019C02024、LGN22C160004)によって共同出資されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ベールマン煙突該当なし該当なし線虫の分離
ビーコンデザイナー 7.9上海康友生情報技術株式会社該当なしqPCRプライマーの設計
ボトリティス・シネレア該当なし該当なし線虫の餌として
Bursaphelenchus xylophilus該当なし該当なしその番号はNXY61で、もともとは中国浙江省寧波の病
Pinus massonianaから採取されました。
定温インキュベーター上海景洪実験機器有限公司H1703544カルトゥール線虫へ
電気泳動装置バイオ・ラッド研究所1704466電気泳動解析を達成するために
エタノール、75%シノファーム化学試薬株式会社80176961RNAを抽出するために
エクスタックポリメラーゼプレミックスタカラバイオ株式会社RR030APCRのために
エクスタックポリメラーゼプレミックスタカラバイオ株式会社RR390APCRのために
ゲルイメージャーロングジーン科学機器社LG2020核酸バンドを可視化するために
GraphPad プリズム8GraphPad プリズム該当なしデータを分析し、図形を作るために
高速遠心分離機杭州オールシェンインスツルツ株式会社AS0813000遠心分離機
高フラックス組織グラインダーベルタンRNAを抽出するために
ImageJソフトウェア国立衛生研究所該当なし体長を測定するために
イソプロピルアルコール上海アラジン生化学技術株式会社L1909022RNAを抽出するために
ライカ DM4B 顕微鏡ライカ・マイクロシステムズ社線虫を観察するために
磁気ビーズ青蘭科学技術株式会社150010CRNAを抽出するために
MEGAscript T7 ハイイールド転写キットサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社AM1333in vitroでdsRNAを合成するために
NanoDrop ND-2000分光光度計サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社ナノドロップ 2000/2000CdsRNAの品質を解析するために
PCRアンプバイオ・ラッド・ライフ・メディカルプロダクツ社1851148核酸配列を増幅するために
ペトリ皿該当なし該当なしカルトゥール線虫へ
pGEM-T イージーベクタープロメガ・コーポレーションA1360クローン作成のために
ジャガイモデキストロース寒天(中煎じ)該当なし該当なし文化Botrytis cinerea
Prime Script RT試薬キット(gDNAイレーサー付き)タカラバイオ株式会社RR047B合成cDNAに変換
プライマー・プレミア 5.0プレミア・バイオソフト該当なしPCRプライマーの設計
プライマー:ppm-1-F/R青科バイオテクノロジー株式会社該当なしF: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATCTT -3';右回数:5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R青科バイオテクノロジー株式会社該当なしF: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3';R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
リアルタイム熱サイクラー qTOWER 2.2アナリティク・イエナ・インスツルメンツ(北京)会社qPCRに対して
シェイキングテーブル上海志成分析機器製造有限公司線虫を浸すこと
立体顕微鏡重慶光学機器有限公司1814120線虫を観察するために
T7-GFP-F/R青科バイオテクノロジー株式会社該当なしF: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA
GGAGAAGAACTTTTCAC-3';R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG
TTACAAACTCAAGAAGG-3'
 T7プロモーター青科バイオテクノロジー株式会社該当なしTAATACGACTCACTATAGGG
タカラ MiniBEST アガロースゲル DNA 抽出キットタカラバイオ株式会社9762DNAを回収するために
TaKaRa TB グリーンプレミックス Ex Taq(Tli RNaseH Plus)タカラバイオ株式会社RR820AqPCRに対して
トリクロロエタン上海靈風化学試薬有限公司RNAを抽出するために
トリゾル試薬サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社15596026全RNA抽出試薬、RNAを抽出するために

参考文献

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/63645-v

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