Method Article

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。

Abstract

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リン酸化は、タンパク質機能を調節し、細胞シグナル伝達の結果を導く必要な翻訳後修飾である。タンパク質リン酸化を測定する現在の方法は、個々のタンパク質にわたるリン酸化の不均一性を維持することができない。単一分子プルダウン(SiMPull)アッセイは、ガラスカバースリップ上のタンパク質の免疫沈降とそれに続く単一分子イメージング を介して 高分子複合体の組成を調査するために開発されました。現在の技術は、単一分子レベルでの全長膜受容体のリン酸化状態の堅牢な定量化を提供するSiMPullの適応である。このようにして何千もの個々の受容体をイメージングすると、タンパク質リン酸化パターンを定量化することができます。現在のプロトコルは、サンプル調製からイメージングまで、最適化されたSiMPull手順を詳述しています。ガラス調製および抗体固定プロトコルの最適化により、データ品質がさらに向上します。現在のプロトコルは、サンプル内でリン酸化された受容体の割合を計算する単一分子データ分析のためのコードを提供します。この研究は上皮成長因子受容体(EGFR)のリン酸化に焦点を当てているが、プロトコルは他の膜受容体および細胞質ゾルシグナル伝達分子に一般化することができる。

Introduction

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膜関連シグナル伝達は、リガンド誘導膜受容体活性化およびシグナルを伝播する下流補助タンパク質の動員の組み合わせによって同調される。受容体細胞質尾部における重要なチロシンのリン酸化は、シグナル伝達複合体、またはシグナル伝達体1,2の形成を開始するのに重要である。したがって、生物学における重要な問題は、シグナル伝達パートナーを募集し、細胞転帰を決定するために、リン酸化パターンがどのように作成され、維持されるかである。これには、シグナル伝達3,4,5,6,7の組成を指示することによってシグナル伝達出力を操作する手段を提供できる存在量および特定のホスホチロシンパターンの両方における受容体リン酸化の不均一性を理解することが含まれる。しかしながら、タンパク質リン酸化を疑問視する現在の方法には限界がある。ウェスタンブロット分析は、タンパク質リン酸化の傾向を記述するのには優れていますが、半定量的8であり、数千から数百万の受容体が一緒に平均化されるため、システムの不....

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Protocol

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1. カバースリップの準備

注:このステップでは、ニトリル手袋、安全メガネまたはフェイスシールド、およびラボコートの二重層を含む個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。

  1. ピラニアエッチングを行い、ガラスから有機物を除去します。
    警告: ピラニア溶液は、有機材料と接触すると腐食性があり反応性の高い強力な酸化剤です。有機破片との反応は発熱性であり、潜在的に爆発性である。したがって、手順は、サッシを下げた化学ヒュームフード内で実行する必要があります。パイレックスガラス製品は、ピラニア溶液を処理するために必要とされます。
    1. 化学ヒュームフード内のワークスペースを準備します。4Lガラスビーカー「反応」ビーカーの底に重なり合わずにカバースリップを配置し、反応ビーカーを温熱でホットプレートの上に置きます。ガラス製品を10分間温めます。反応ビーカーに500mLのddH2O近位に「廃棄物」1Lガラスビーカーを置く。
    2. 49mLの12N硫酸(H2SO4)をガラス血清学的ピペットで反応ビーカーにゆっくりと加える。廃棄する前に、廃ビーカーでピペットをすすいでください。
    3. 21mLの30%過酸化水素(H2O2)をガラス血清学的ピペットで反応ビーカーに滴下する。H2....

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Results

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SiMPullプロセスを描いた漫画を 図1Aに示します。カバースリップは、ビオチン化抗EGFR抗体のアンカーとしてNeutrAvidinを使用して官能化され、全タンパク質溶解物からEGFR-GFPを捕捉します。非結合タンパク質を洗い流した後、リン酸化受容体を抗ホスホチロシン(anti-PY)抗体で標識する15。 図1B は疎水性アレイの画像を示しており、複数のサンプルを準備し、同じカバースリップ上に画像化することができます。このサンプルホルダーの利点の1つは、約10μLの最小限のサンプル量で済むことです。カバースリップは、顕微鏡ステージに直接配置することで画像化できます。ただし、カバースリップホルダーを使用してカバースリップを安定させると便利です。 図 1B に示すカバースリップ ホルダーは 3D プリンターを使用して作成され、青写真は 補足コーディング ファイル 5 に用意され.......

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Discussion

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ここで説明するプロトコルは、単一タンパク質レベルでの受容体リン酸化の定量的測定を可能にするように最適化されました。SiMPullプロトコルに対するいくつかの単純だが重要な修正が開発され、NaBH4 処理による自己蛍光の低減や抗体解離を防ぐためのサンプルの後固定など、ホスホチロシン検出の測定の信頼性が向上しました。緑色チャネルマスクを使用して、抗PY抗体との共局在を計算するための受容体位置を同定し、細胞溶解物への抗体の非特異的結合から潜在的なアーチファクトを除去することによって、測定精度も向上させる。2色イメージングを、リン酸化された受容体の画分を検出するために利用した。このシナリオでは、受容体はGFPで遺伝的にタグ付けされ、抗体は遠赤色色素で直接標識されました。SiMPullアプローチは、細胞内タンパク質を含む、特異的抗体が利用可能な他のタンパク質標的に適用される。さらに、変性条件が不要なため、マルチサブユニット受容体/複合体も捕捉することができる。しかしながら、目的のPTMがタンパク質14の構造領域に位置する場合、変性は組み込まれ得る。最終的に、SiMPullは、マ.......

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Disclosures

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著者らには開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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この研究は、国立衛生研究所R35GM126934、R01AI153617、およびR01CA248166によってDSLに支援されました。EMBはASERT-IRACDAプログラム(NIH K12GM088021)によって、JARはUNM MARCプログラム(NIH 2T34GM008751-20)によってサポートされました。我々は、NIH P30CA118100が支援するニューメキシコ大学総合がんセンター蛍光顕微鏡共有リソースの使用に感謝の意を表している。私たちは、SiMPullのオリジナルの開発がこの作品に影響を与えたAnkur Jain博士とTaekijip Ha博士に感謝したいと思います。
ES-Cの現在演説:免疫力学グループ、統合癌免疫学研究室、癌研究センター、国立癌研究所、ベセスダ

....

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Materials

4

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 微量遠心チューブMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaClT50 バッファー
100 mm 組織培養皿CELLTREAT229620ピラニアエッチングガラス/アレイの保管
15 mL 円錐管
16% パラホルムアルデヒド水性溶液電子顕微鏡 科学15710危険
50 mL コニカルチューブ機能化 ガラス貯蔵/KOH再利用
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl溶解バッファー コンポーネント
60 mm 組織培養皿コーニング430166
8% グルタルアルデヒド水溶液電子顕微鏡 科学16020危険な
アセトン(C3H6O)ミリポアシグマ270725危険な
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
アニマルフリー組換えヒトEGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR(外部ドメイン)–BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr 抗体 (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
ウシ血清アルブミンゴールドバイオテクノロジーA-420-1タイロードの緩衝液 成分
ブフナー漏斗
ブンゼンバーナー
塩化カルシウム (CaCl2)ミリポア シグマC4901チロードの緩衝液
成分 細胞スクレーパーバイオワールド30900017-1
円錐形ろ過フラスコフィッシャーScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II 自動セルカウンターThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Electron Microscopy Sciences63793
DipImage
https://diplib.org/ DMEMCaisson LabsDML19-500
emCCDカメラAndor iXon
Fetal Bovine Serum, OptimaBio-TechneS12450HHeat Inactivated
Fusion 360 softwareAutodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01危険
ガラス血清ピペット
ガラス攪拌ロッド
グルコース (D-(+)-グルコース)ミリポア SigmaD9434チロード緩衝液成分
停止ホスフォターゼおよびプロテアーゼ阻害剤 カクテル (100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック78446溶解緩衝液
成分 HEPESミリポアシグマH3375チロードの緩衝成分
塩酸(HCl)VWRBDH7204-1有害
過酸化水素(H2O2) (3%)HX0645
過酸化水素(H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
アイスIGEPAL
CA-630 (NP-40)Sigma AldrichI8896溶解緩衝液 成分
ImmEdge 疎水性バリアペンベクトル研究所H-4000
イマーゾール 518F 浸漬油ツァイス444960-0000-000
社内真空ライン
L-グルタミンサーモフィッシャーサイエンティフィック25030-164
塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
メタノール (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1危険な
Milli-Q 水
Mix-n-Stain CF染料抗体の分類のキットBiotium92245提案された抱合のキット
mPEGLaysan生物mPEG-スクシンイミジルの吉草酸エスカレート、MW 5,000
N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランUCTユナイテッドケミカルA0700
ナノグリッドMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin結合タンパク質サーモフィッシャーサイエンティフィック31000
窒素 (圧縮ガス)
NVIDIA GPU と CUDAhttps://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
オリンパス iX71 顕微鏡オリンパス
パラフィルム M シーリング フィルムラボ デポHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 アナログホットプレートCorning6795-200
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAbCell Signaling Technology2236BF
塩化カリウム (KCl)ミリポアシグマ529552チロードの緩衝液成分
水酸化カリウム (KOH)ミリポア シグマ1050330500危険な
プレミアム PLA フィラメント、直径 1.75 mmレイズ 3DPMS:2035U/RAL:3028印刷温度範囲: 205-235 °C;C
Pro2 3Dプリンターレイズ3D
パイレックス1Lビーカー
パイレックス100mL保存ボトルコーニング1395-100CHsub>3OH / C3H6O再利用
レックス250mLビーカー
レックス4Lビーカー
クワッドビュー画像スプリッターフォトメトリクスモデル QV2
冷蔵遠心分離機エッペンドルフEP-5415R
RevCount セルカウンター、EVE セルカウンティングスライドVWR10027-446
Semrock 発光フィルター:青 (445/45 nm)、緑 (525/45 nm)、赤 (600/37 nm)、遠赤 (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
セロロジカルピペットコントローラー
血清学的ピペットは
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)Sigma AldrichS6014危険な
打つ単一分子分析パッケージ
緩衝液成分
塩化ナトリウム (NaCl)ミリポアシグマS9625連続熱・pHサイクルによる活性化
水酸化ナトリウムVWRBDH3247-1
オルトバナジン酸ナトリウム (Na3VO4)ミリポアシグマS6508有害
硫酸 (H2SO4)ミリポアシグマ 258105危険な
テトラスペック マイクロスフェアサーモフィッシャーサイエンティフィックT7279マルチ蛍光ビーズ
トリス(トリズマ)ベースミリポアシグマT1503
トリパンブルーステイン、0.4%サーモフィッシャーサイエンティフィック15250061
トリプシン-EDTA 0.05%サーモフィッシャーサイエンティフィック25300120
危険な<パイパイ、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH)Millipore Sigma 452874 Tyrode」https://github.com/LidkeLab/smite.git を

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

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