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方法論記事

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

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DOI：

10.3791/63672

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2022年5月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of Biomedical Engineering, University of Mississippi

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

in vitroでのアクトミオシンバンドルの形成と光ピンセットを用いたミオシンアンサンブル力発生の測定について紹介し、議論します。

要約

ミオシンは、ATPを加水分解してアクチンフィラメント(AF)トラックに沿ってステップするモータータンパク質であり、運動性や筋肉収縮などの細胞プロセスに不可欠です。ミオシンIIは、その力発生機構を理解するために、1分子(SM)レベルと、光トラップなどの生物物理学的手法を用いた in vitro でのモーターチームとして研究されています。

これらの研究は、ミオシンの力発生挙動が、3ビーズ配置の単一分子レベルから、滑走配置の剛ビーズまたはカバーガラス表面上で一緒に動作するモーターのグループに移動すると大きく異なる可能性があることを示しました。ただし、これらのアッセイ構造では、細胞内のように粘弾性構造階層内のミオシンのグループダイナミクスを評価することはできません。我々は、光ピンセットを用いて、複数のアクチンフィラメントと相互作用するミオシンアンサンブルによる力発生のメカニズムを調べる方法を開発しました。

これらのアクトミオシンバンドルは、運動通信とアンサンブル力出力をキャプチャする階層的で準拠した環境での研究を容易にします。アッセイのカスタマイズ可能な性質により、実験条件を変更して、ミオシンアンサンブル、アクチンフィラメントバンドル、または周囲の環境への変更がどのようにして異なる力出力をもたらすかを理解することができます。

概要

モータータンパク質は生命に不可欠であり、化学エネルギーを機械的仕事に変換します1,2,3。ミオシンモーターは、フィラメントに沿ってトラックのようなステップを踏むことによってアクチンフィラメントと相互作用し、アクチン-ミオシンネットワークのダイナミクスは、筋肉の収縮、細胞の運動性、細胞質分裂中の収縮リング、および細胞内の貨物の移動など、重要なタスクを実行します3,4,5,6,7,8 .ミオシンは非常に多くの重要な役割を担っているため、ミオシン-アクチンネットワークの機能が機能しなくなると、肥大型心筋症(HCM)で心臓の過収縮を引き起こすミオシン重鎖の変異などの疾患発症につながる可能性があります9,10,11,12,13,14。.筋収縮において、個々のミオシンモーターは、AF4、15、16、17、18の相対的なスライドを実行する必要な機械的エネルギーを提供するためにアンサンブルとして働くことによって互いに協力する。ミオシンモーターは、AF間にクロスブリッジを形成し、そのメカノケミカルサイクルによる立体配座変化を利用して、整列したフィラメント17、18、19、20、21の有刺鉄線の端に向かって集合的に移動する。

光学トラップなどの技術を用いたSMレベルでの定量的in vitro運動アッセイの開発により、SM力の発生とステップサイズの測定など、個々のミオシンモーターがどのように機能するかについての前例のない詳細を収集することが容易になりました22,23,24,25,26,27,28,29,30.Fineerらは、単一のミオシンIIモーターの力発生メカニズムを調べるために、「スリービーズ」または「ダンベル」光学トラップアッセイを開発しました23,31。筋ミオシンIIはチームでAFを収縮させるが、SMレベルでは非処理的であるため、光学トラップアッセイの向きは、古典的なモーター結合ビーズアプローチ32から再配置する必要がありました。ダンベルアッセイを形成するために、2つの光学トラップを使用して、カバーガラスに取り付けられたビーズに結合したミオシンモーター上にAFを保持し、トラップ23内のAFの動きによって単一のモーターによる力出力を測定した。

しかし、ミオシンIIを含む多くのモータータンパク質は単独で機能せず、しばしばそれらの部分の合計として機能しないため、SM力および単一モーター/単一フィラメントアッセイの向きを使用しても、システムレベルの力の生成に関する完全なイメージが得られません15,16,17,32,33,34,35,36 .ミオシンとアクチンフィラメントのネットワークの相乗効果をよりよく理解するには、複数のフィラメントと相互作用する複数のモーターを含むより複雑な構造が必要です15,32。ダンベルアッセイの配向は、ビーズに複数のミオシンを付着させるか、または表面に付着したミオシン太いフィラメントを使用して、モーターが懸濁AFと相互作用できるようにすることにより、小さなアンサンブル力の発生を調べるために利用されています4,23,34,37,38,39,40。

他の小さなアンサンブルアッセイには、ミオシンモーターがカバーガラス表面にコーティングされ、AFに結合したビーズを使用してモーターのチームによって生成された力をプローブするin vitroフィラメントグライディングアッセイが含まれます4,35,36,38,39,40,41,42,43.どちらの場合も、ミオシンは硬い表面(ビーズまたはカバーガラス)に結合し、1つのAFを利用します。これらの場合、モーターは自由に動くことも互いに通信することもできず、ミオシンをしっかりと束縛することは、モーターがサルコメア32で一緒に働くであろう準拠した階層的環境を反映していない。以前の研究では、ミオシンIIがその環境を感知し、力の発生やデューティ比などの特性を変更することにより、粘弾性またはモーター濃度条件の変化に応じて適応できることが示唆されています41,44,45。したがって、ミオシンIIアンサンブル力発生の機構的基盤のより現実的な絵を描くために、運動通信とシステムのコンプライアンスを促進およびキャプチャする光トラップアッセイを開発する必要があります。

ここでは、2本のアクチンフィラメント間で相互作用する複数のミオシンモーターからなるアクトミオシンバンドルまたはサンドイッチを形成することにより、in vitroで階層構造を光トラップと結合させる方法を開発しました。このモジュラーアッセイ形状は、分子的および環境的要因がアンサンブルミオシン力の生成にどのように影響するかを直接調査する機能を備えています。さらに、これらのアクチン-ミオシンアンサンブルを介した力発生メカニズムの調査は、筋肉収縮などの大規模な細胞タスクが分子レベルからどのように伝播するかをモデル化および理解するのに役立つ可能性があります9,10,13。

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プロトコル

1.エッチングカバーガラス

  1. 100 gのKOHを1,000 mLのビーカーに300 mLの100%エタノールに溶かします。KOHの大部分が溶解するまで攪拌子で攪拌します。
    注意: 濃縮KOH溶液は、火傷や衣服の損傷を引き起こす可能性があります。手袋、目の保護具、白衣を着用してください。
  2. カバースリップをカバースリップクリーニングラックに個別に配置します。
    注意: ラックは、カバースリップの各面のエッチングとすすぎを可能にするために間隔を空けて単一のカバースリップを保持するスリットで設計されており、底部の排水穴があり、過酷なエッチング条件に耐えることができる材料で作られています。それらはカスタムメイドまたは商業的に購入することができます。
  3. 3つの1,000 mLビーカーを準備してラベルを付けます:1つは300 mLのエタノールで、2つのビーカーは300 mLの逆浸透(RO)水で。
    注:ここでは、RO水は実験室の浄水器から供給されましたが、地元の浄水器が利用できない場合は市販品を購入することもできます。
  4. 4つのビーカーのそれぞれをバス超音波処理器に入れて、5分間脱気します。
  5. KOHとエタノールのビーカーにカバーガラスのラックを沈め、5分間超音波処理します。
  6. カバーガラスのラックをKOH /エタノールビーカーからエタノールのみのビーカーに移します。ビードがなくなるまでビーカーでラックを上下に浸します。
    注意: カバーガラスを乱したり、ラックをビーカーに無理に落としたりしないように注意してください。これにより、カバーガラスがラックから出たり、化学物質の飛沫が発生したりします。
  7. カバーガラスのラックをエタノールビーカーから水のビーカーに慎重に移し、ビーズがなくなるまで上下に浸漬します。
  8. まだ使用されていない水のビーカーにカバーガラスのラックを沈め、5分間再び超音波処理します。
  9. ボトルを使用して、カバースリップのラックにカバースリップからスムーズに流れ落ちるまで水をスプレーします。エタノールで繰り返します。
  10. ラックを90°Cのオーブンで20分間乾燥させます。エッチングされたカバーガラスのラックは、使用前に汚染を防ぐために、密閉容器に室温で保管してください。

2.アクチンフィラメント重合

  1. ソリューションTを作る
    1. 50 mLのコニカルチューブに、3.94 gのトリス塩酸塩と0.147 gのCaCl2を加えます。RO水を加えて総容量50mLにし、よく混ぜます。
      注:溶液Tの最終濃度は、それぞれ500 mM Tris-HClと20 mM CaCl2 です。
    2. チューブ溶液Tにラベルを付け、4°Cで保管します。
  2. TCバッファの作成
    1. 40 mLのRO水と1.5 mLの溶液Tを50 mLのコニカルチューブに混ぜます。少量の濃縮KOHを加えてpHを8.0に変更します。水を加えて50mLの溶液を作り、pHを確認します。必要に応じてpHを調整します。
      注:最終的なTCバッファーには、pH 8で5 mM Tris-HClと0.2 mM CaCl2 が含まれています。
    2. チューブTCにラベルを付け、4°Cで保管します。
  3. FCバッファの作成
    1. 85 mLのRO水、10 mLの溶液T、3.73 gのKCl、および0.041 gのMgCl2 を100 mLバッファーボトルに加えます。少量の濃縮KOHを加えてpHを7.5に変更します。水を加えて最終容量を100mLにし、pHを確認します。
      注: 最終的な FC バッファーには、pH 7.5 で 500 mM トリス塩酸塩、500 mM KCl、2 mM MgCl 2、および 2 mM CaCl2 が含まれています。
    2. チューブFCにラベルを付け、4°Cで保管してください。
  4. 一般アクチンバッファー(GAB)を調製します。
    1. 485 μLのTCバッファー、10 μLの10 mM ATP、および5 μLの50 mM DTTをマイクロ遠心チューブに混合します。
      注:最終的なバッファー条件は、5 mM トリス塩酸、0.2 mM CaCl 2、0.5 mM DTT、および0.2 mM ATPです。
    2. GABとラベル付けし、4°Cで保存してください。
  5. アクチン重合バッファー(APB)を調製します。
    1. 455 μLのFCバッファー、25 μLの100 mM ATP、および20 μLの50 mM DTTをマイクロ遠心チューブに混合します。
      注:最終的なバッファー条件は、50 mM トリス塩酸塩、500 mM KCl、2 mM MgCl 2、2 mM CaCl 22 mM DTT、および5 mM ATPです。
    2. チューブにAPBのラベルを付け、4°Cで保管します。
  6. アクチンの再構成
    1. 凍結乾燥アクチンの1 mgバイアルに100 μLの脱イオン水を加えて、ウサギ骨格筋アクチンを再構成します。上下に穏やかにピペッティングしてよく混ぜます。5 μLのサンプルに分注し、スナップフリーズし、10 mg/mLのアクチンアリコートを-80°Cで保存します。
    2. ビオチン化ウサギ骨格筋アクチンを20μLのRO水を加えて再構成します。5 μLのサンプルに分注し、スナップフリーズして、1 mg/mLのビオチン化アクチンアリコートを-80°Cで保存します。
  7. ローダミンファロイジン安定化による非標識アクチン重合
    1. 10 mg/mLアクチンのバイアル1本を解凍し、氷上に置いておきます。
    2. 新鮮なGABバッファーを調製し、アクチンアリコートに100 μLのGABを加え、穏やかに上下にピペッティングして混合します。溶液を氷上で1時間インキュベートする。
    3. インキュベーション中に新鮮なAPBを準備します。インキュベーション後、アクチン溶液に11 μLのAPBを加えてアクチンをフィラメントに重合します。上下に穏やかにピペッティングしてよく混ぜます。氷上に20分間置きます。
    4. 5 μLのローダミン標識ファロイジンを新たに重合したアクチンフィラメント溶液に加えます。暗闇の中で氷の上に1時間放置します。
    5. ローダミンアクチンバイアルをアルミホイルで包んで暗所で4°Cで保管します。
      注意: これらのフィラメントは最大1週間使用することをお勧めします。AFのみを含むフローセルのクイックイメージングと、一貫したフィラメントの日々の表示により、AF品質を毎日確認できます。
  8. Alexa Fluor 488ファロイジン安定化によるビオチン化アクチン重合
    1. 10 mg/mLアクチンのバイアル1本とビオチン化アクチン1本を解凍し、氷上に保ちます。
    2. 新鮮なGABバッファーを作成します。
    3. 2つのバイアルを10:1のアクチン:ビオチン化アクチン比で組み合わせます(ステップ2.8.1)。アクチン混合物に100 μLのGABを加え、上下に穏やかにピペッティングしてよく混ぜます。氷上で1時間インキュベートします。
    4. インキュベーション中に新鮮なAPBを作ります。
    5. インキュベーションステップの後、アクチン溶液に11 μLのAPBを加えてアクチンを重合します。穏やかに上下にピペッティングしてよく混ぜます。氷上で20分間インキュベートします。
    6. 5 μLのAlexa Fluor 488標識ファロイジンを加え、氷上で暗所で1時間インキュベートします。
    7. アルミホイルで包んだビオチン化アクチンバイアルを4°Cの暗所で保存します。
      注:これらのフィラメントは最大1週間使用できます。

3.ミオシンとビーズの準備

  1. ミオシンIIの再構成
    1. 凍結乾燥された骨格ミオシンIIを短時間スピンダウン(~5秒)し、標準的なミニ遠心分離機を使用してチューブの底に集めます。
    2. RO水中で調製した1 mM DTTを100 μL添加して、ミオシンを10 mg/mLに再構成します。
    3. RO水中の1 mM DTTの90 μLに10 mg/mLのミオシン10 μLを加えて、ストックミオシン溶液を10倍に希釈します。少量(1〜5 μL)のアリコートを行い、スナップフリーズして、-80°Cで保存します。
      注:ミオシン活性は、以前に公開された46,47のような標準的な滑走フィラメントアッセイを行うことによって確認することができる。簡単な説明については、説明を参照してください。
  2. ストレプトアビジンコーティングビーズの洗浄
    1. 20 μLの1 μmストレプトアビジンビーズを80 μLのRO水に希釈します。9,600 × g でスピンダウンし、100 μLのRO水で再構成して4回洗浄します。
    2. 40%振幅で2分間超音波処理し、洗浄したビーズを4°Cの回転子に保管します。

4. フローセルの準備

  1. 50 mLチューブに30 mLの100%エタノールを加え、200 μLの0.1%w/vポリ-l-リジンを水に加え、よく混合して、ポリ-l-リジン溶液(PLL)を調製します。
  2. エッチングしたカバーガラスをPLL溶液に追加し、15分間浸します。カバーガラスがチューブから引き上げられるときにカバーガラスの端にのみ触れるように注意しながら、ピンセットでカバーガラスを取り外します(図1A-Cを参照)。手袋をはめた手でカバーガラスの端をつかみます。
  3. エタノールが残らず、カバーガラスに残留物がなくなるまで、ろ過したエアラインでカバーガラスを乾燥させます。
  4. 顕微鏡スライドの中央に2枚の両面粘着テープを3〜4 mm離して貼り付けます。スライドの端からぶら下がっている余分なテープをはがすか切り取ります。
  5. 顕微鏡スライドの長軸に垂直なテープの上にPLLコーティングされたカバーガラス(Tを形成)を追加して、チャネルを形成します。
  6. 小さなチューブを使用してカバーガラスをテープに圧縮し、テープが透明になるまで顕微鏡を完全にスライドさせます(図1A)。テープに気泡がないことを確認してください。これは流路からの漏れを引き起こす可能性があるためです。
    注:フローセルは10〜15μLの容量を保持できます。

5.アクトミオシンバンドル調製

  1. 別々のチューブで、0.5 μLの標識アクチンと300 μLのAPBを混合することにより、各タイプのアクチンフィラメント(ローダミンおよびビオチン化488標識)を600倍に希釈します。対応する標識ファロイジンをさらに5 μLずつ各チューブに加え、氷上で暗所で15分間インキュベートします。
  2. ビオチン化アクチン溶液に、500 mg/mL の β-D-グルコース 1 μL、25 mg/mL のグルコースオキシダーゼ 1 μL、500 単位/mL のカタラーゼ 1 μL の脱酸素システムを追加します。1 μLの100 mM ATPと1 μLの100倍希釈洗浄ストレプトアビジンビーズを加えます。ピペットチップで静かにかき混ぜます。懸濁液を4°Cのローテーターに置き、残りのアクトミオシンバンドルを組み立てます。
  3. 15 μLの希釈ローダミンアクチンをPLLフローセルに加えます(図1D)。余分な溶液をフローセルに通しますが、流路が乾かないようにしてください。湿度チャンバーで10分間インキュベートします。
    注意: 湿度チャンバーは、底に水を加え、蓋をアルミホイルで覆って光を遮断した空のピペットチップボックスから作ることができます。
  4. APBで1 mg/mLのカゼイン溶液を調製します。
  5. 1 mg/mLのカゼインを15 μL添加して、後続の成分の非特異的結合を防ぎます(図1E)。湿度チャンバーで5分間インキュベートします。
  6. ステップ5.2のビオチン化アクチンおよびビーズ懸濁液に所望の濃度のミオシンを加える。ピペットチップで穏やかに攪拌し、すぐに15 μLのステップ5.2懸濁液+目的のミオシン濃度をフローセルに追加します(図1F、G)。20分間インキュベートします。フローセルの開放端をマニキュアで密封し、イメージングおよび光学トラップ実験中の蒸発を防ぎます。
    注:ミオシン溶液濃度が1 μMの場合、堅牢なバンドルが得られ、アッセイの望ましいカスタマイズの出発点として使用できます( 図2を参照)。

6. 光トラップ(NT2ナノトラッカー2)を用いた力測定

注:以下のプロトコルはNT2システム専用ですが、このアッセイは、蛍光機能を備えたカスタムビルドのものを含む、他の光トラップシステムで使用できます。スライドの表面に焦点を合わせ、ビーズキャリブレーションを実行し、蛍光アクチンバンドルを見つけることによってデータを取得するという一般的なワークフローは同じです。NT2システムについては、補足図S1、補足図S2、補足図S3、補足図S4、補足図S5、補足図 S6、補足図S7 に、光トラップシステムとソフトウェアインタフェースの詳細が記載されています。

  1. コントロールボックスとレーザーの電源を入れます(補足図S1)。
  2. デスクトップ上の JPKナノトラッカー アイコンをクリックして、光トラップコンピュータソフトウェアを起動します。
  3. 中央にある Logitech ボタンをクリックして、リモコンをウェイクアップします(補足図S2)。
  4. オン/オフスイッチを切り替えて蛍光モジュールの電源を入れます(補足図S3)。
  5. 明視野イメージング用のフィルターキューブタレットを回します(補足図S4)。
  6. システムの準備ができたら、画面の左下隅にあるレーザーパワーボタンを使用してレーザーを50 mWまでオンにし、30分間安定させます(補足図S5)。
  7. ソフトウェア内の イルミネーション、カメラ、対物レンズ 、 ステージ移動 ボタンを順番にクリックして、実験中に表示および操作できるようにこれらのウィンドウを表示します。オン /オフ ボタンをクリックして顕微鏡照明をオンにし、バーをクリックして右端までドラッグして最大出力に設定します(補足図S5)。
  8. サンプル領域を開き、顕微鏡ステージからサンプルホルダーを取り外します。フローセルを追加し、金属サンプルホルダーで固定し、カバーガラス付きのスライドが底にあることを確認します。
  9. 下部対物レンズの中央に30 μLのRO水を加えます。ピペットの先端をレンズに触れさせないでください。サンプルステージを再挿入します。
    注意: NT2システムはトラップ対物レンズとして水浸対物レンズを使用するため、ユーザーのセットアップのトラップ対物レンズによって液浸媒体が異なる場合があります。
  10. 水のビーズがカバーガラスに触れるまで、画面上のコントロール矢印またはリモコンのL2を使用して、下の対物レンズを上げます(補足図S5)。
  11. 画面上の矢印またはリモコンのR2を使用して、フローセルまでの距離の約半分に達するまで上部の目標を下げます。170 μLのRO水をフローセルの上部対物レンズの真下に追加します。水の表面張力が壊れてメニスカスが形成されるまで、上部の対物レンズを下げます。
  12. リモコンの矢印パッドを使用して、流路に隣接するテープの端に達するまで顕微鏡ステージを移動します。サンプル ドアを閉じます。
    注意: サンプルドアを閉じたときに「カチッ」とすると、レーザーシャッターが開いたことを示します。これは、ドアが閉じている場合にのみシャッターを開くことができる安全機能です。
  13. 画面の「対物レンズ」ウィンドウを使用して、画面上のコントロールを使用して上矢印をクリックして、レーザー対物レンズという名前の下部の対物レンズを上に移動し、テープの端に焦点を合わせます。下の矢印をクリックして、上の目標についても同じことを行います(補足図S5)。
    注:二重矢印は、目標またはステージをより速く移動します。テープの端は、カバーガラスの表面に近い大きくて見つけやすいオブジェクトであるため、焦点を合わせるために使用されます。テープ内の気泡は別のオプションです。ただし、ユーザーがサーフェスフォーカスを見つけるための自動化されたルーチンまたは好みの社内方法を持っている場合、これは必要ありません。
  14. テープにピントが合ったら、光学トラップの上部にあるアイリスを部分的に閉じます。虹彩のポリゴン形状が表示されるまで、上部の目標を下げます。これらのエッジに焦点を合わせ、虹彩を再度開き、 南京錠 のアイコンをクリックして対物レンズを結合します(補足図S5)。
  15. フローティングビーズを見つけてトラップシャッターボタンをクリックしてトラップすると、 シャッター が開き、トラップレーザーがサンプルに当たるようになります。画面上のトラップカーソルをクリックしてドラッグし、 トラップ レーザーの位置を移動します。トラップしたら、ビードを校正して、電圧測定値を力と変位に関連付けます。
  16. キャリブレーションボタンをクリックします。パワースペクトル解析に基づいてキャリブレーションルーチンを調整し、ソフトウェア内のコーナー周波数をX、Y、およびZ方向に合わせます(補足図S6)。
  17. [設定]をクリックします。ビーズの直径(1,000 nm)を入力し、ソフトウェアウィンドウの左下にあるステージの温度を入力します。(補足図S6を参照)。
  18. トラップ1をクリックします。X信号をクリックします。[実行]をクリックして、コーナー周波数フィットを実行します。ウィンドウ内をクリックしてドラッグし、機能のフィットを最適化します。[感度と剛性の値に使用する]をクリックします。[値の受け入れ] をクリックします。Y信号とZ信号についても繰り返します。ウィンドウを閉じます。(補足図S6を参照)。
    注:等分割法や抗力法など、ユーザーによって堅牢にテストされた他の光学トラップシステムまたはカスタムビルドシステムのビードキャリブレーションルーチンも許容されます57,58。
  19. カバーガラスの表面でAFに結合したビーズを検索して、アクトミオシンバンドルを見つけます。
  20. 他の浮遊ビーズで密集していないビーズが検出された場合、蛍光イメージングによって周囲のAFを観察し、バンドルの存在を確認します。
  21. 共局在化された両方の蛍光AFを探して、バンドルが存在することを確認します。白色光源をオンにし、適切なフィルターキューブを使用して、タレットを回して各アクチンフィラメントをイメージングします(Alexa Fluor 488およびローダミン励起用のそれぞれ488 nmおよび532 nm励起フィルターキューブ)。 補足図S4を参照してください。
    注:単一AFの蛍光強度を検証する対照実験は、単一の488および単一のローダミン標識フィラメントで構成されるバンドル、またはユーザーが使用することを選択した蛍光色素のセットに適用できるバンドルを特定するのに役立ちます。
  22. 確認したら、トラップシャッターボタンをクリックして、バンドルの上部フィラメントに取り付けられたビードを トラップ します。
  23. 画面上のコントロールを使用して、 オシロスコープ ボタンをクリックしてデータを記録します(補足図S7)。データを記録せずに測定値を視覚化するには、[ 開始]をクリックします。すべてのデータを保存するには、[ 自動保存]をクリックします。測定値を記録するには、[ 記録の開始]をクリックします。ドロップダウンメニューのX信号またはY信号から選択して、リアルタイムで視覚化するデータ(位置、力、X方向、Y方向)を選択します。xdirection は画面上で左から右、y 方向は上下であることに注意してください。 補足図S7を参照してください。
    注:データは.outファイルとして保存され、各方向の時間、電圧、変位、および力が含まれます。これらのファイルは、視覚化と分析のために他のソフトウェアにエクスポートできます。

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結果

アクトミオシンバンドルシステムを含むフローセルは、顕微鏡スライドと両面粘着テープで作られたチャネルで区切られたエッチングされたカバーガラスで構成される標準設計です(図1)。次に、アッセイは、プロトコルに記載されている段階的な導入を使用してカバースリップから構築されます。最終的なアッセイは、テンプレートローダミン標識アクチンフィラメントで構成されています。所望のミオシン濃度( 図2 および 図3の代表的な結果には1μMを使用した)。ビオチン化、Alexa Fluor 488標識アクチンフィラメント;1μmのストレプトアビジンビーズ;酸素消去システム;ATP;および APB バッファを使用します。フローセルごとに複数のバンドルが形成され、上記のアクチン濃度はバンドル間に適切な間隔を与え、不要な相互作用がないことを保証します。これにより、フローセルごとに複数の力測定値を取得しやすくなり、データ収集効率が向上します。力プロファイルは、フローセル内およびフローセル間で再...

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ディスカッション

アクチンフィラメントと相互作用するミオシンアンサンブルのダイナミクスを調べるために、蛍光イメージングと組み合わせた光ピンセットを使用した in vitro 研究が行われました。アクチン-ミオシン-アクチンバンドルは、筋ミオシンII、バンドルの下部とカバーガラス表面にローダミンアクチン、およびバンドルの上部に488標識されたビオチン化アクチンフィラメントを使用して組み立てられました。ウサギの筋肉由来のアクチンタンパク質を、一般的なアクチンバッファー(GAB)およびアクチン重合バッファー(APB)を使用して重合および安定化しました。GABおよびAPBは、ATP、FCバッファー、およびTCバッファーを使用して、ラボで毎日新たに調製する必要があります。筋肉ミオシンIIは、アクチン-ミオシン-アクチンサンドイッチを形成するために使用されました。ファロイジンは、アクチンフィラメントの蛍光染色、および in vitroでの安定化に使用されました。

ミオシン活性は、以前に公開されている46、<...

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開示事項

著者は宣言する利益相反はありません。

謝辞

この研究の一部は、ミシシッピ大学大学院学生評議会研究フェローシップ(OA)、ミシシッピ大学サリーマクドネルバークスデールオナーズカレッジ(JCW、JER)、助成金番号NNX15AH78H(JCW、DNR)のミシシッピスペースグラントコンソーシアム、および助成金番号848586(DNR)のアメリカ心臓協会によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクチンタンパク質(ビオチン):骨格筋細胞骨格AB07-Aビオチン化アクチン
タンパク質 アクチンタンパク質、ウサギ骨格筋細胞骨格AKL99-Aアクチンタンパク質
アレクサフルーア488 ファロイジンインビトゲンA12379チン安定剤およびアレクサフルーア488
ATPフィッシャーサイエンティフィックBP413-25アクチンに必要アセンブリとミオシンの運動性
ベータ-D-グルコースフィッシャー科学MP218069110蛍光イメージング中の光退色を減らすために使用される酸素捕捉システムの一部
ブロッティンググレードブロッカー(カゼイン)バイオラド1706404非特異的結合
CaCl2FisherC79500から表面をブロックするために使用されます塩化カルシウムは、アクチンミオシンネットワークのダイナミクスに必要な制御を提供します
カタラーゼフィッシャー科学ICN10040280蛍光イメージング中の光退色を低減するために使用される酸素捕捉システムの一部
カバースリップフィッシャー科学12544Cフローセルを作るために使用されます
DTTフィッシャー科学AC327190010緩衝液調製に使用されます
エタノールフィッシャー科学A4094カバースリップの洗浄に使用されるリージェント
グルコースオキシダーゼフィッシャー科学34-538-610KU蛍光イメージング中の光退色を低減するために使用される酸素捕捉システムの一部
KClフィッシャー科学P217-500緩衝液調製に使用
KOHフィッシャー科学P250-1カバースリップをエッチングし、調整するために使用されます緩衝液 pH
MgCl2Fisher scientificM33-500緩衝液調製に使用
顕微鏡スライドFisher scientific12-544-2フロー細胞を作るために使用
ミオシンIIタンパク質:ウサギ骨格筋細胞骨格MY02ウサギ骨格筋から単離された全長ミオシンモータータンパク質
Nanotracker2Bruker/JPKNT2光トラッピング装置
Poly-l-lysineSigma-AldrichP8920カバースリップのガラス表面へのアクチンフィラメントの接着
ローダミン ファロイジンサイトスケルトンPHDR1アクチン安定剤とローダミン蛍光染色
ストレプトアビジンビーズ, 1 μmSpherotechSVP-10-5光学トラッピングハンドル
Tris-HClFisher scientificPR H5121バッファー調製に使用
アク染色 科学

参考文献

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