動脈肺循環の血管応答は、肺内動脈(IPA)および血管平滑筋細胞(VSMC)を使用して探索できます。本研究では、IPAの分離と、生理学的刺激に応答した血管弛緩の調査に使用されるプロトコルについて詳しく説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ラットの肺から単離された肺内動脈(IPA)および血管平滑筋細胞(VSMC)を使用して、血管収縮および血管弛緩の根底にあるメカニズムを研究することができます。IPAおよびVSMCを単離した後、生理学的および病理学的状態における血管応答の特徴は、神経信号、ホルモン、サイトカインなどの外因性因子がない場合に評価することができる。このように、IPAとVSMCは、薬理学的薬剤による調節、パッチクランプ電気生理学的解析、カルシウムイメージングなどのさまざまな実験的研究とともに、血管生理学/病態生理学を研究するための優れたモデルとして機能します。ここでは、IPAを単離する技術を用いて、臓器浴装置における血管応答を調べました。IPAセグメントは、管腔内ワイヤーを介して臓器浴室に取り付けられ、さまざまな薬理学的物質によって刺激されました。IPA血管緊張の変化(すなわち、血管収縮および血管弛緩)を、等尺性力トランスデューサおよび生理学的データ解析ソフトウェアプログラムを用いて記録した。私たちは、植物化学物質または合成薬の薬理学的活性を研究するための血管弛緩/血管収縮のメカニズムを調査するために適応できるいくつかの実験プロトコルを実装しました。プロトコルは、肺動脈性肺高血圧症を含むさまざまな疾患の調節における薬物の役割を評価するためにも使用できます。IPAモデルにより、薬物の薬力学的パラメータを評価する上で重要な濃度反応曲線を調べることができます。
概要
肺血管系は低圧血管系であり、その主な機能は脱酸素化された血液を肺のガス交換領域に送達することである。肺の肺動脈は気管支樹に平行な枝に配置され、最終的にはいくつかの肺胞にわたって連続し、最終的に細静脈と静脈に集まる毛細血管の広範なネットワークを形成します。肺動脈の血管緊張は、内皮と血管平滑筋細胞(VSMC)の間の相互作用を含むいくつかの要因によって制御されています1。
本研究では、肺内動脈(IPA)の内皮依存性および非依存性血管弛緩に焦点を当てます。内皮依存性血管弛緩に関しては、内皮細胞の表面で起こる様々なメカニズムが細胞内Ca2+濃度を増加させ(例えば、アセチルコリン[ACh]がムスカリン受容体[M3]と結合する)、一酸化窒素(NO)、プロスタサイクリン(PGl2)、および内皮由来過分極因子(EDHF)の形成につながる可能性があります(図1).NOは、内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)2によってL-アルギニンから合成される主要な内皮由来弛緩因子であり、内皮細胞からVSMCに解離し(図1)、可溶性グアニリルシクラーゼ(sGC)酵素を刺激します。この酵素は、グアノシン三リン酸(GTP)を環状グアノシン一リン酸(cGMP)に変....
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プロトコル
この研究で実施された実験は、ナレースワン大学動物管理および使用委員会(NUACUC)の倫理委員会(プロトコル番号NU-AE620921)によって、科学的目的での動物の世話と使用について承認されました。
1.生理学的溶液の組成
- 化学物質を蒸留水に溶解してクレブス溶液を処方し、最終濃度を次のように達成します:122 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM KCl、0.5 mM KH 2 PO 4、0.5 mM NaHPO4、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl 2、および11 mM グルコース8。溶液のpHを1 M NaOHで7.3に調整し、使用前に37°Cに予熱します。
- ステップ1.1で説明したのと同様にコールドクレブス溶液を調製します。ステップ2で説明したように、IPAの分離媒体として使用するため。
2.肺内動脈(IPA)の分離
- 8週齢の雄のWistarラットにチオペンタールナトリウム(100 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔します9。.足に固定された鉗子を使....
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結果
本研究におけるプロトコルは、単離されたIPA製剤の血管応答で観察される生理学的現象を測定するための最適な実験条件を決定するために開発されました。パイロット実験は、次のように、植物抽出物の血管効果と血管弛緩作用の機構的基礎の理解に役立つ潜在的な結果を説明するために実施されました。
植物抽出物の血管弛緩効果
図6A,Bに示すように、内皮インタクトIPA(E+)において、植物抽出物は血管弛緩の濃度依存的な応答を誘発した(EC50 = 66.88 μg/mL、図6C)。内皮(E-)の除菌は、EC50の2.2倍の増加に反映されるように、植物抽出物によって誘発される血管弛緩を大幅に減少させました(p < 0.01)。車両DMSOは何の効果もありませんでした.......
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ディスカッション
本稿では、ラットIPAおよびVSMCの単離技術について述べる。イン ビトロでのIPAの血管応答を調査するためにいくつかの実験プロトコルが採用されており、植物抽出物によって誘導されるIPA血管弛緩の薬理学的効果と機構的基礎を特徴付けるために使用できます。
植物抽出物の内皮依存性血管拡張作用に関しては、L-NAME(eNOS)、インドメタシン(COX)、およびアパミン+カリブドトキシン(EDHF)などの様々な遮断薬が用いられた。代表的なデータは、陽性結果(すなわち、eNOSまたはEDHF阻害剤のいずれかの存在下での血管拡張反応の有意な減少)および陰性結果(すなわち、COX阻害剤の存在下で血管拡張薬応答の変化なし)の両方を示し、植物抽出物がeNOSおよびEDHF内皮経路を介して作用することを示唆している。植物抽出物によって誘導される内皮非依存性血管弛緩効果は、K+チャネル、細胞外Ca2+流入、およびSRからのCa2+放出の関与を介して評価されました。結果は、植物抽出物に応答する血管弛緩は、K Caチャネル.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
タイ国立研究評議会、化学イノベーションセンター(PERCH-CIC)、国際研究ネットワーク(IRN61W0005)が財政支援を提供し、ナレースワン大学医科学部生理学部が研究施設を支援したことに感謝の意を表します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1,4-ジチオスレイトール(DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 | |
| 4-アミノピリジン(4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 | |
| アセチルコリン | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 | |
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 | |
| コライドカルシウム | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 | |
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 | |
| コラゲナーゼ1A型 | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 | Clostridium histolyticum |
| D(+)-グルコース一水和物 | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 | |
| エチレングリコール-ビス (2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 | |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | シグマ-アルドリッチ | E9884 CAS NO. 60-00-4 | |
| 鉗子11センチメートル。 | 錆びないデュモクセル | 鉗 | |
| 子14cm。 | 錆びないデュモクセル | - | |
| グリベンクラミド | シグマ-アルドリッチ | G6039 CAS番号16673-34-0 | |
| GraphPadプリズムプログラム | ソフトウェアバージョン5.0(サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) | ||
| HEPES | シグマ-アルドリッチ | H3375 CAS番号7365-45-9 | |
| ベリオトキシン | シグマアルドリッチ | I5904 CAS番号1002546960 | 組換え体Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 | |
| Labchartプログラム | ソフトウェアバージョン7.0(ADインストゥルメント、キャッスルヒル、オーストラリア)から。 | ||
| 塩化マグネシウム | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 | |
| オス Wistar ラット | 野村 Siam International Co. Ltd., バンコク, タイ | ||
| NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 | |
| オルガンバス15mL。 | - | - | 研究者による特定の注文 |
| パパイン | シグマ・アルドリッチ | P4762 CAS NO. 9001-73-4 | パパイヤ・ラテックス |
| フェナール・レッド | シグマ・アルドリッチ | P5530 CAS NO. 34487-61-1 | |
| フェニレフリン | ・シグマ・アルドリッチ | P6126 CAS NO. 61-76-7 | |
| 塩化カリウム | マウス | KA383 CAS NO.7447-40-7 | |
| 二水素カリウム | Aldrich化学 | EC231-913-4 CAS番号7778-77-0 | |
| S + A2:E36odium塩化物 | Kemaus | KA465 CAS番号7647-14-5 | |
| はさみ11cm。 | スポールステンレス | ||
| はさみ14cm。 | Spall Stainless-Sodium | ||
| Bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 | |
| リン酸二水素ナトリウム | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 | |
| 水酸化ナトリウム | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 | |
| チオペンタールナトリウム | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C314/47 | |
| タウリン | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 | |
| ウォーターバス WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
参考文献
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614(2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S.
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再版と許可
