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方法論記事

血管応答を調べるための肺内動脈および平滑筋細胞の分離

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DOI:

10.3791/63686

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2022年6月8日

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1Department of Physiology, Faculty of Medical Science and Center of Excellence for Innovation in Chemistry, Naresuan University, 2Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, 3Cosmetics and Natural Products Research Center, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, 4Snyder Institute for Chronic Diseases, Airways Inflammation Research Group, Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary

この記事について

サマリー

動脈肺循環の血管応答は、肺内動脈(IPA)および血管平滑筋細胞(VSMC)を使用して探索できます。本研究では、IPAの分離と、生理学的刺激に応答した血管弛緩の調査に使用されるプロトコルについて詳しく説明します。

要約

ラットの肺から単離された肺内動脈(IPA)および血管平滑筋細胞(VSMC)を使用して、血管収縮および血管弛緩の根底にあるメカニズムを研究することができます。IPAおよびVSMCを単離した後、生理学的および病理学的状態における血管応答の特徴は、神経信号、ホルモン、サイトカインなどの外因性因子がない場合に評価することができる。このように、IPAとVSMCは、薬理学的薬剤による調節、パッチクランプ電気生理学的解析、カルシウムイメージングなどのさまざまな実験的研究とともに、血管生理学/病態生理学を研究するための優れたモデルとして機能します。ここでは、IPAを単離する技術を用いて、臓器浴装置における血管応答を調べました。IPAセグメントは、管腔内ワイヤーを介して臓器浴室に取り付けられ、さまざまな薬理学的物質によって刺激されました。IPA血管緊張の変化(すなわち、血管収縮および血管弛緩)を、等尺性力トランスデューサおよび生理学的データ解析ソフトウェアプログラムを用いて記録した。私たちは、植物化学物質または合成薬の薬理学的活性を研究するための血管弛緩/血管収縮のメカニズムを調査するために適応できるいくつかの実験プロトコルを実装しました。プロトコルは、肺動脈性肺高血圧症を含むさまざまな疾患の調節における薬物の役割を評価するためにも使用できます。IPAモデルにより、薬物の薬力学的パラメータを評価する上で重要な濃度反応曲線を調べることができます。

概要

肺血管系は低圧血管系であり、その主な機能は脱酸素化された血液を肺のガス交換領域に送達することである。肺の肺動脈は気管支樹に平行な枝に配置され、最終的にはいくつかの肺胞にわたって連続し、最終的に細静脈と静脈に集まる毛細血管の広範なネットワークを形成します。肺動脈の血管緊張は、内皮と血管平滑筋細胞(VSMC)の間の相互作用を含むいくつかの要因によって制御されています1。

本研究では、肺内動脈(IPA)の内皮依存性および非依存性血管弛緩に焦点を当てます。内皮依存性血管弛緩に関しては、内皮細胞の表面で起こる様々なメカニズムが細胞内Ca2+濃度を増加させ(例えば、アセチルコリン[ACh]がムスカリン受容体[M3]と結合する)、一酸化窒素(NO)、プロスタサイクリン(PGl2)、および内皮由来過分極因子(EDHF)の形成につながる可能性があります(図1).NOは、内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)2によってL-アルギニンから合成される主要な内皮由来弛緩因子であり、内皮細胞からVSMCに解離し(図1)、可溶性グアニリルシクラーゼ(sGC)酵素を刺激します。この酵素は、グアノシン三リン酸(GTP)を環状グアノシン一リン酸(cGMP)に変え、プロテインキナーゼG(PKG)を活性化し、細胞質Ca2+レベルを低下させ、血管弛緩を引き起こします(図1)。PGl2は、シクロオキシゲナーゼ(COX)経路3,4を介して内皮細胞によって合成される。VSMC上のプロスタサイクリン受容体(IP)と結合し、アデニリルシクラーゼ(AC)酵素を刺激し、アデノシン三リン酸(ATP)を環状アデノシン一リン酸(cAMP)に変換します(図1)3,4。cAMPはプロテインキナーゼA(PKA)を活性化し、細胞質Ca2+レベルを低下させ、血管弛緩を引き起こします5(図1)。EDHF経路は、さまざまな内皮メディエーターおよび電気的イベントを介して内皮依存性血管弛緩にも関与しています。EDHF経路の活性化はVSMCの過分極をもたらし、電圧作動Ca2+チャネル(VOCC)を閉じ、細胞内Ca2+レベルを低下させ、血管弛緩を誘導します6。内皮非依存性血管弛緩は、細胞内Ca2+レベルの低下、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の阻害、ミオシン軽鎖ホスファターゼ(MLCP)の活性化、およびVSMCの収縮機構に対するCa2+感受性の低下など、いくつかのメカニズムを介してVSMC上で直接起こる。本研究では、様々なK+チャネルの開口、VOCCの遮断、筋小胞体7からのCa2+放出の阻害による血管弛緩に焦点を当て、細胞内Ca2+レベルを低下させ、VSMCミオシン軽鎖リン酸化とミオシン-アクチン結合またはクロスブリッジ形成をそれぞれ減少させます。 最終的に血管弛緩をもたらす。

単離されたIPAにおける血管収縮および血管弛緩測定を評価する技術は、げっ歯類に対して十分に確立されていますが、データは実験プロトコルによって異なりました。本研究では、神経信号、ホルモン、サイトカイン、血圧などのin vivoでの血管反応を調節する外的要因がない場合に行われたラットIPA製剤の血管反応性をin vitroで評価するために使用された方法について説明します。

IPAの血管反応性を研究するための例として、植物抽出物を使用したいくつかの実験プロトコルを採用しました。さまざまな遮断薬(図1)を利用して、植物抽出物によって誘導される内皮依存性および非依存性の血管弛緩のメカニズムを特定しました。それにもかかわらず、同じプロトコルを、様々な肺病変の治療に使用される任意の薬物、抽出物または植物化学物質に対するIPAの血管応答を評価するために適合させることができる。

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プロトコル

この研究で実施された実験は、ナレースワン大学動物管理および使用委員会(NUACUC)の倫理委員会(プロトコル番号NU-AE620921)によって、科学的目的での動物の世話と使用について承認されました。

1.生理学的溶液の組成

  1. 化学物質を蒸留水に溶解してクレブス溶液を処方し、最終濃度を次のように達成します:122 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM KCl、0.5 mM KH 2 PO 4、0.5 mM NaHPO4、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl 2、および11 mM グルコース8。溶液のpHを1 M NaOHで7.3に調整し、使用前に37°Cに予熱します。
  2. ステップ1.1で説明したのと同様にコールドクレブス溶液を調製します。ステップ2で説明したように、IPAの分離媒体として使用するため。

2.肺内動脈(IPA)の分離

  1. 8週齢の雄のWistarラットにチオペンタールナトリウム(100 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔します9。.足に固定された鉗子を使用して、深い睡眠中の痛みを伴う刺激に対するラットの反応を確認し、ステップ2.2で安楽死させる前に、ラットが足の引き戻し反応を示さないことを確認します。
  2. ラットの中央胸部と心臓末をハサミ(サイズ14 cm)で切り開きます。次に、はさみ(サイズ14 cm)で肺の付け根を見つけます。ハサミで切って肺全体を収穫し、冷たいクレブス溶液10,11に浸します。
  3. はさみ(サイズ11 cm)で肺の片葉をスライスし、肺の内側/根元を上に向けてペトリ皿(サイズ9 cm)に置きます(図2A、B)。静脈、気管支、および動脈の上から下への配置を観察して識別します(図2B)。
  4. ハサミ(サイズ11 cm)で気管支を縦方向に切り開きます。次に、鉗子(サイズ11 cm)を使用して気管支の先端をつかみます。気管支と静脈を静かに解剖して肺から取り除きます。IPAは常に解剖学的に気管支の下に整列していることに注意してください。
  5. その後、メインIPAを可視化することができます(図2C)。鉗子(サイズ11 cm)を使用してIPAの先端をつかみ、ハサミ(サイズ11 cm)で肺組織から慎重に解剖します。
  6. 単離したIPAを、臓器浴アセンブリがセットアップされるまで冷たいクレブス溶液(pH 7.3、温度4°C)1 1に保ちます。

3.血管平滑筋細胞(VSMC)の分離

  1. ステップ 2 で説明したように IPA を分離します。IPAの主枝をハサミ(サイズ11 cm)で縦方向に切り開き、小さなストリップ(2 mm)に切ります(図3A)。
  2. IPAストリップを、110 mM NaCl、5 mM KCl、0.5 mM KH 2 PO4、0.5 mM NaH 2 PO4、10 mM NaHCO3、10 mM HEPES、0.03 mM フェノールレッド、10 mM タウリン、0.5 mM EDTA、2 mM MgCl 2、11 mM グルコース、および0.16 mM CaCl 2を含む解離媒体(DM)10,12に浸します。 pHを1 M NaOHで7.0に調整します。1 mg/mLのパパイン、0.04%ウシ血清アルブミン(BSA)、および0.4 mM 1,4-ジチオスレイトール(DTT)を含むDM中でストリップを4°Cで1時間インキュベートし、さらに37°Cで15分間インキュベートします。1 mg/mLのコラゲナーゼ1A型をDM溶液に加え、さらに37°Cで5分間インキュベートします。
    注:DMは、細胞の生存率を維持するために使用されるソリューションです。パパインおよびコラゲナーゼ1A型は、細胞外マトリックスタンパク質を分解して単一細胞を単離する酵素です。BSAは、保存中および酵素反応中の酵素の安定化に使用される血清アルブミンタンパク質です。DTTは、細胞単離プロセス中に酵素の活性を安定化および促進するために使用される還元剤です。タウリンは、細胞膜と細胞の完全性を安定させるために使用されるアミノ硫酸です。
  3. 組織を新鮮なDMに移し、ガラスパスツールピペットを使用して穏やかに粉砕して分散させます(図3B)。分離されたVSMCが顕微鏡下で入浴溶液中に見えるようになるまで、粉砕を続けます(図3C)。
    注:新たに分離されたVSMCは、薬理学的物質による調節、パッチクランプ電気生理学的分析、カルシウムイメージングなどのさまざまな実験的研究とともに、血管生理学/病態生理学の研究に使用できます。しかし、本研究では、臓器浴技術を用いた単離IPAの血管弛緩にのみ焦点を当てています。

4.オルガンバステクニック

  1. ステップ 2 で説明したように IPA を分離します。IPAの主枝を~2mmの長さのリングにカットします(図2D)13。
  2. IPAリングを直径40 μmのステンレス鋼線2本にねじ込んで(図4)、臓器浴室にIPAリングを貼り付けます(図2E)11,13,14。
  3. データ収集装置に接続された等尺性力変換器と、データの記録と分析に適した生理学的ソフトウェアがインストールされたコンピュータシステムにIPAリングを取り付けたステンレス鋼線を取り付け、IPAリングの張力を1g11に静かに上げます。
  4. 血管セグメントを1gの静止張力で約45分間平衡化させます。平衡期間中は、クレブス溶液が15分ごとに定期的に交換されることを確認してください。この平衡化期間の後、47.4 mM NaCl、80 mM KCl、10 mM HEPES、0.5 mM KH 2 PO4、0.5 mM NaHPO4、1.8 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、および11 mM グルコース10,11を含む高細胞外K+(80 mM)溶液に対する血管の生存率を測定して、血管の生存率をテストします。
  5. フェニレフリン(PE、1 x 10-5 M)で事前に契約したリングのアセチルコリン(1 x 10-5 M)に対する緩和応答を計算することにより、内皮の有無を評価します(血管収縮はPEを追加した後1時間安定していることに注意してください)。リングが70%以上の緩和を定量化する場合は、内皮が無傷であると考えてください(図5A)。弛緩率が10%未満の場合は、リングを内皮露出13と見なします(図5B)。血管内を小さなワイヤーで軽くこすって内皮を機械的に除去し、露出を誘発します。
  6. 試験実験の開始前に、動脈輪を30分間再び平衡化する。

5.植物抽出物に対する血管弛緩反応

  1. PE(1 x 10−5 M)でIPAリングを事前に収縮させることにより、植物抽出物の弛緩効果を調べます。
  2. 次に、植物抽出物(1〜1,000 μg / mL)を内皮インタクトリングおよび内皮露出リングに累積的に注意深く添加して血管弛緩を誘発し(図6A、B)、濃度依存的な応答曲線を取得します(図6C)。
  3. 溶媒として用いたジメチルスルホキシド(DMSO)の効果も陰性対照として同様に評価されることを確認する(図6C)。

6. 植物抽出物による内皮を介した血管弛緩機構

  1. 内皮インタクトIPAリングを以下の阻害剤と共に30分間インキュベートすることにより、内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)、シクロオキシゲナーゼ(COX)13、および内皮由来過分極因子(EDHF)経路を介した植物抽出物の血管弛緩作用機序を評価します(図7A):1 x 10−4 M NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME、eNOS阻害剤)9、1 x 10−5 Mインドメタシン(COX阻害剤)9、 または、1 x 10-5 M PEでIPAの収縮を誘発する前に、1 x 10-7 Mアパミン(小さなカルシウム活性化カリウムチャネル遮断薬)と1 x 10-7 Mカリブドトキシン(中間および大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル遮断薬)の組み合わせ。
  2. 次に、PEへの収縮が安定したら、植物抽出物の累積濃度(0.1〜1,000 μg / mL)を追加します。
  3. 植物抽出物の効果を、阻害剤なしのIPAリングの応答と比較した阻害剤の存在下でのIPAリングの緩和率として提示し(図7B-D)、濃度-応答曲線を作成します。

7. 血管平滑筋K+ チャネルを介した植物抽出物誘発血管弛緩機構

  1. 1 x 10−3 M 4-アミノピリジン(4-AP)、電位依存性カリウムチャネル(KV)の遮断薬(図8A)、1 x 10−5 Mグリベンクラミド、ATP感受性カリウムチャネル(KATP)の遮断薬、または1 x 10−7 Mイベリオトキシン、大きなコンダクタンスCa2+活性化K+チャネル(KCa)の遮断薬、 1 x 10−5 M PEでIPAの収縮を誘発する前。
  2. 次に、植物抽出物の累積濃度を追加します。
  3. 植物抽出物の効果を、阻害剤なしのIPAリングと比較した阻害剤を含むIPAリングの緩和率として提示し(図8B-D)、濃度-応答曲線を作成します。

8. VSMCにおける細胞外カルシウム(Ca2+)流入抑制による植物抽出物による血管弛緩機構

  1. 内皮をむき出しにしたIPAリングを、1 mMのエチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)を含むCa2+フリーのクレブス溶液中で30分間プレインキュベートします(図9A)。
  2. 次に、入浴溶液をCa2+ フリー80mM K+ 溶液に10分間交換してVSMCを脱分極し、VOCCを開きます(図9A)。
  3. CaCl2(0.01-10 mM)を累積的に添加してIPAの血管収縮を誘導し、濃度反応曲線を構築します(図9A)。
  4. 同じIPAリングでこのプロトコルを繰り返しますが、植物抽出物または80 mM K+溶液を含むCa2+中の1 μMニカルジピン(L型Ca2+チャネルブロッカー)と10分間プレインキュベートした後、CaCl28を累積添加します。
  5. 最後に、収縮応答を、対照CaCl2 チャレンジによって以前に誘発された最大収縮と比較します(図9B)。

9. 筋小胞体(SR)からの細胞内カルシウム(Ca2+)放出阻害による植物抽出物による血管弛緩機構

  1. 内皮露出したIPAリングを80 mM K+溶液に約5分間さらし、VSMCを脱分極し、VOCCを開き、最終的に同期整流へのCa2+負荷を生成します(図10A)。
  2. 入浴液を10分間、1 mM EGTAを含むCa 2+フリーのクレブス溶液に交換します(図10A)。
  3. 次に、1 x 10−5 M PEでIPAリングに挑戦すると、ホスホリパーゼC/IP3 経路が活性化され、最終的にSRからCa2+ が放出され、IPAの一時的な収縮が引き起こされます(図10A)。
  4. 同じプロトコルを繰り返して、PEに対する同様に一時的な収縮を確認します。
  5. IPAリングを80 mM K+溶液で約5分間再度チャレンジした後、入浴溶液を植物抽出物の有無にかかわらず1 mM EGTAを含むCa 2+フリークレブス溶液に10分間交換します。
  6. 繰り返しになりますが、1 x 10−5 M PEでIPAリングに挑戦してください。
  7. 植物抽出物の有無にかかわらず、PEによって誘発されるIPA収縮を比較します(図10B)。

10.統計分析

  1. 結果をSEM±平均値として表します。 スチューデントのt検定を使用してこれらの値を比較するか、分散分析(ANOVA)とそれに続く適切な統計ソフトウェアを使用したTukey-Kramer事後検定で分析します。 p < 0.05 での差が統計的に有意であると考えてください。ここでは、n = 6匹のラット/実験プロトコルがありました。
    注意: 血管収縮と血管弛緩の記録は、コンピューターにインストールされている適切なソフトウェアを使用して評価できます。たとえば、 図5A は、収縮を引き起こすPEによって血管が刺激されると、元のトレースの張力の増加から観察できることを示しています。トレースは20〜30分で安定し、これは100%の収縮と見なされます。その後、AChは血管を刺激して弛緩を引き起こしますが、これは元のトレースの緊張の低下から観察できます。したがって、減少した張力は、100%の収縮と比較したパーセンテージとして計算されます。

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結果

本研究におけるプロトコルは、単離されたIPA製剤の血管応答で観察される生理学的現象を測定するための最適な実験条件を決定するために開発されました。パイロット実験は、次のように、植物抽出物の血管効果と血管弛緩作用の機構的基礎の理解に役立つ潜在的な結果を説明するために実施されました。

植物抽出物の血管弛緩効果
図6A,Bに示すように、内皮インタクトIPA(E+)において、植物抽出物は血管弛緩の濃度依存的な応答を誘発した(EC50 = 66.88 μg/mL、図6C)。内皮(E-)の除菌は、EC50の2.2倍の増加に反映されるように、植物抽出物によって誘発される血管弛緩を大幅に減少させました(p < 0.01)。車両DMSOは何の効果もありませんでした...

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ディスカッション

本稿では、ラットIPAおよびVSMCの単離技術について述べる。イン ビトロでのIPAの血管応答を調査するためにいくつかの実験プロトコルが採用されており、植物抽出物によって誘導されるIPA血管弛緩の薬理学的効果と機構的基礎を特徴付けるために使用できます。

植物抽出物の内皮依存性血管拡張作用に関しては、L-NAME(eNOS)、インドメタシン(COX)、およびアパミン+カリブドトキシン(EDHF)などの様々な遮断薬が用いられた。代表的なデータは、陽性結果(すなわち、eNOSまたはEDHF阻害剤のいずれかの存在下での血管拡張反応の有意な減少)および陰性結果(すなわち、COX阻害剤の存在下で血管拡張薬応答の変化なし)の両方を示し、植物抽出物がeNOSおよびEDHF内皮経路を介して作用することを示唆している。植物抽出物によって誘導される内皮非依存性血管弛緩効果は、K+チャネル、細胞外Ca2+流入、およびSRからのCa2+放出の関与を介して評価されました。結果は、植物抽出物に応答する血管弛緩は、K Caチャネル...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

タイ国立研究評議会、化学イノベーションセンター(PERCH-CIC)、国際研究ネットワーク(IRN61W0005)が財政支援を提供し、ナレースワン大学医科学部生理学部が研究施設を支援したことに感謝の意を表します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,4-ジチオスレイトール(DTT)Sigma-AldrichD0632
CAS NO. 348-12-3
4-アミノピリジン(4-AP)Aldrich ChemicalA78403
CAS NO. 504-24-5
アセチルコリンSigma-AldrichA6625
CAS NO. 60-31-1
ApaminSigma-AldrichA9459
CAS NO. 24345-16-2
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-AldrichA2153
CAS NO. 9048-46-8
コライドカルシウムAjax FinechemAJA960
CAS NO. 1707055184
CharybdotoxinSigma-AldrichC7802
CAS NO. 95751-30-7
コラゲナーゼ1A型Sigma-AldrichC9891
CAS NO. 9001-12-1		Clostridium histolyticum
D(+)-グルコース一水和物Millipore CorporationK50876942 924
CAS NO. 14431-43-7
ジメチルスルホキシド (DMSO)Sigma-AldrichD4540
CAS NO. 67-68-5
エチレングリコール-ビス (2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 (EGTA)Sigma-AldrichE3889
CAS NO. 67-42-5
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)シグマ-アルドリッチE9884
CAS NO. 60-00-4
鉗子11センチメートル。錆びないデュモクセル鉗
子14cm。錆びないデュモクセル-
グリベンクラミドシグマ-アルドリッチG6039
CAS番号16673-34-0
GraphPadプリズムプログラムソフトウェアバージョン5.0(サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)
HEPESシグマ-アルドリッチH3375
CAS番号7365-45-9
ベリオトキシンシグマアルドリッチI5904
CAS番号1002546960		組換え体Mesobuthus tamulus
IndomethacinSigma-AldrichI7378
CAS NO. 53-86-1
Labchartプログラムソフトウェアバージョン7.0(ADインストゥルメント、キャッスルヒル、オーストラリア)から。
塩化マグネシウムAjax Finechem296
CAS NO. 1506254995
オス Wistar ラット野村 Siam International Co. Ltd., バンコク, タイ
NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル (L-NAME)Sigma-AldrichN5751
CAS NO. 51298-62-5
NicardipineSigma-AldrichN7510
CAS NO. 54527-84-3
オルガンバス15mL。--研究者による特定の注文
パパインシグマ・アルドリッチP4762
CAS NO. 9001-73-4		パパイヤ・ラテックス
フェナール・レッドシグマ・アルドリッチP5530
CAS NO. 34487-61-1
フェニレフリン・シグマ・アルドリッチP6126
CAS NO. 61-76-7
塩化カリウムマウスKA383
CAS NO.7447-40-7
二水素カリウムAldrich化学EC231-913-4
CAS番号7778-77-0
S + A2:E36odium塩化物KemausKA465
CAS番号7647-14-5
はさみ11cm。スポールステンレス
はさみ14cm。Spall Stainless-Sodium
BicarbonateAjax Finechem475
CAS NO. 912466
リン酸二水素ナトリウムAldrich Chemical33,198-8
CAS NO. 7558-80-7
水酸化ナトリウムAjax Finechem482
CAS NO. 1506196602
チオペンタールナトリウムAnesthalJPN3010002
CAS NO. 1C314/47
タウリンSigma-AldrichT0625
CAS NO. 107-35-7
ウォーターバス WBU 45Memmert2766
CAS NO. -
イ・ ケリン酸

参考文献

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