マウスにおける腹膜透析カテーテル留置のための逆行性移植アプローチ

サマリー

この記事では、従来の技術で観察された大きな技術的問題を回避するために、マウスモデルに腹膜透析カテーテルを埋め込む手順の変更について説明します。

要約

マウスモデルは、腹膜炎症や線維症など、腹膜透析(PD)のさまざまな側面を調べるために使用されます。これらのイベントは、ヒトの腹膜不全を引き起こし、末期腎疾患(ESKD)の患者の管理における深い臨床的意味のために、依然として激しい調査の領域です。PDとそれに関連する合併症の臨床的重要性にもかかわらず、現在の実験的マウスモデルは、モデルの性能を損なう重要な技術的課題に苦しんでいます。これらには、PDカテーテルの移動とねじれが含まれ、通常は早期のカテーテル除去を保証します。これらの制限はまた、研究を完了するためにより多くの動物の必要性を推進します。これらの欠点に対処するために、この研究では、マウスモデルで一般的に観察されるPDカテーテルの合併症を防ぐための技術的改善と外科的ニュアンスを紹介します。さらに、この改変モデルは、リポ多糖注射を用いて腹膜炎症および線維症を誘発することによって検証される。本質的に、この論文はPDの実験モデルを作成するための改良された方法を説明する。

概要

末期腎疾患の負担
慢性腎臓病(CKD)は世界的な健康問題です¹。現在の推定では、世界中で8億5000万人以上が腎臓病を患っています。腎臓病の有病率は、糖尿病患者(4億2,200万人)のほぼ2倍であり、世界中の癌患者(4,200万人)またはHIV/AIDS(3,670万人)の有病率の20倍以上です²。アメリカ人の約7人に1人がCKDを患っており、1,000人に2人のアメリカ人が腎臓移植または透析サポートを必要とするESKDを患っています³。世界中でESKDの負担が増大していることを考えると、透析技術の最適化は非常に重要です³.

腹膜透析
PDは、米国におけるESKDの治療に著しく十分に活用されていないモダリティです。米国腎データシステム(USRDS)によると、2020年には有病率のPD患者の割合はわずか11%でした^4,5。PDは、生活の質の向上、クリニックへの訪問の減少、メディケア支出の減少など、センター内血液透析(HD)に比べていくつかの利点をもたらします^6,7。さらに、PDは在宅療法であり、血液透析カテーテルに関連することが多い菌血症や心内膜炎などの重篤な感染症のリスクがはるかに低くなります。さらに、PDは緊急開始プロトコルで迅速に開始することができ、留置血管カテーテル⁸による透析開始の必要性を減少させる。PDは、小児ESKD集団における透析の好ましい方法と考えられています⁹。

腹膜透析による腹膜障害
PDは、PD液(透析液)を腹膜に導入することを伴い、その結果、時間の経過とともに腹膜の炎症とリモデリングが起こります。腹膜の炎症は線維症を引き起こし、時間の経過とともに膜の限外ろ過能力が失われる可能性があります。腹膜の保存はPDの重要な課題であり、開業医が最良の臨床実践を利用できるようにするには、さらなる研究が非常に重要です。腹膜感染と炎症、溶質、水輸送動態、および膜不全の病態生理学的メカニズムの理解を深めるのに役立つ、十分に確立されたマウスモデルがあります。それでも、カテーテルの技術的な問題により、これらのモデルが制限されることがよくあります¹⁰。

腹膜の変化を分析する
ESKD患者では、透析液は伝統的に、深くて表面的なカフを備えたテンコフカテーテルを介して腹腔に導入されます。患者は、カテーテルの移動、注入の痛み、透析液の排液不良など、カテーテル関連の合併症を経験する可能性があります¹¹、^12、13。これらの合併症を最小限に抑えるために、2つの主要なタイプの腹膜カテーテルが人間に導入されており、コイル状またはストレート状です¹²。PDカテーテルの生存期間を延長するために、従来の2カフカテーテルへの追加のカフを含むいくつかの変更が元のカテーテルに追加されました¹¹。挿入技術は、リソースの可用性や専門知識のレベルなど、生存後に追加されるカテーテルの移動を防ぐことにより、いくつかの要因によって異なります¹⁴。

対照的に、腹膜透析のマウスモデルは、ヒト腹膜カテーテルと比較して技術と目的に根本的な違いがあります。たとえば、マウスモデルの腹膜カテーテルは、主に膜の変化を研究するために使用され、双方向ドレナージ機能はあまり意図されていません。現在の技術は、動物の取り扱いのために潜在的なポートの脱落とカテーテルの移動に苦しんでいます。従来のマウスモデルでは、アクセスポートは皮膚に固定されていませんでした。この側面は不安定なアクセスポートを作成し、覚醒している動物が外れ、カテーテルの移動を引き起こす可能性があります。腹膜研究におけるマウスモデルの重要性を考えると、信頼性の高いモデルを生成するための効果的な手術技術を作成することが不可欠です。そこで、PDカテーテル留置の従来モデルの最適化に着手しました。カテーテル自体が腹膜に組織病理学的変化を引き起こすため、動物実験におけるPD溶液の効果に関する結論は、PDカテーテルの文脈で異物として解釈されなければならない^{ことに注意することが重要です15,16,17}。

腹膜組織病理学
PD障害は、主に線維症および過剰な血管新生に関連しており、その結果、浸透圧濃度勾配が失われます。さらに、腹膜濾過能力は腹膜炎の影響を受ける可能性があります。さらに、感染性腹膜炎は、腹膜透析から血液透析への透析モダリティの変化の確立された原因です。¹⁸.

プロトコル

この研究では、8〜12週齢、平均体重20gの雌C57BL / 6Jマウス8匹を使用しました。マウスを標準条件下で飼育し、固形飼料および水を 自由摂取させた。この研究は、ボストン大学医療センター(AN-1549)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)の承認を得て実施されました。ここで説明する手順は、無菌条件下で実施した。

1.マウスをイソフルランチャンバーで麻酔し、鎮痛剤を皮下注射します

1. 尾の付け根から動物を持ちます。動物を利き手でない手の背側の表面に置いてください。
2. 動物を3%〜4%イソフルランで満たされた連続麻酔導入室に移す。左右の後肢につま先ピンチ反射がないことで、適切な全身麻酔を確認します。イソフルランによる全身麻酔の維持を1%〜3%に保つ。
3. 眼科用軟膏を両眼に塗ります。
4. ブプレノルフィンの皮下注射を行います。.
   1. ブプレノルフィンのストックを塩化ナトリウム(NaCl)0.9%に0.3 mg / mLの濃度で溶解し、最終濃度0.03 mg / mLを達成します。.
   2. 手術の20分前に、0.05〜0.1 mg / kgの0.03 mg / mLブプレノルフィンと500 μLの滅菌NaCl 0.9%を20 gマウスに注射します(マウスあたり2 μgまたは66 μLの0.03 mg / mLブプレノルフィン)。

2.皮膚の準備

1. 完全に麻酔をかけたマウスを左横位置に置き、右脇腹を加熱ブランケットにさらします。腹部の右側を、傍脊髄領域の正中線のすぐ近く、動物の尾まで剃ります。
2. 綿棒を使用して剃毛部分を3回消毒し、消毒液またはスクラブと70%アルコールまたは滅菌生理食塩水を交互に円を描くように塗布し、外科的切開部位から外側に移動します。綿棒は使用するたびに廃棄してください。動物の非外科的領域をアルコールまたは消毒剤で過度に濡らさないように注意してください。
   注:消毒液を適切に希釈し、手術中に外科用スクラブを皮膚に残さないことが重要です。手順中は、加熱ブランケットの温度を頻繁にチェックして、温度が下がらないようにしてください。

3.カテーテルの長さを測定し、準備した皮膚の上の腹部と管管内の挿入点をマークします

1. アクセスポートポケットを動物の尻尾の1cm上に割り当てます。非支配的な人差し指とサムフィンガーで、尾の近くの割り当てられた領域に取り付けセグメントを保持します。
2. カテーテルを皮膚の上に配置し、腹腔内にカテーテルのチューブを挿入する場所を推定します。前正中線近くのチューブの最小の曲がりを尊重して、チューブ挿入に割り当てられた場所にマークを付けます。
   注意: すべての手順は滅菌手袋で実行する必要があり、測定中はカテーテルを無菌に保つ必要があります。手術器具は、使用前に121°Cでオートクレーブ滅菌する必要があります。手順に必要な機器については、 補足図S1 を参照してください。

4.腹膜カテーテルリザーバーセクションをカスタマイズします

1. マウスのイヤータガーでリザーバーセクションのフレームにサイドホールを開けます(図1 および 図2)。イヤーパンチは手術器具であり、無菌である必要があることに注意すべきです。

5.点滴ポートを配置します

1. 尾の1 cm上に幅1 cmの水平方向の皮膚切開を行います。下にある筋肉層から皮下面を鈍く解剖して、カテーテル配置用のポーチを作り、点滴ポートが理想的なポートポケットに自由に存在するようにします。
2. 虹彩はさみの先端を正中線に向けて、チューブ配置用の斜めのトンネルを作ります(図3A)。
3. カスタマイズされたサイドホールから3.0縫合糸を渡します。チューブコースの頭蓋骨を維持しながら、通過した縫合糸を締めて、アクセスポートを筋肉床に固定します。

6.カテーテル先端挿入部位を切開する

1. 正中線近くの以前にマークされた領域に1cmの切開を行います。はさみを管に通して、よく発達した管を確認します。
2. カテーテルの先端を鉗子でそっとつまんで、カテーテルを逆行コースに配置します。
   注意: チューブの側面の穴を挟まないでください。
3. 準備した管にカテーテルチューブを通します(図3B)。右正中線に近い筋肉層を1cm切開します。

7.カテーテルの機能を確認します

1. すべての切開を閉じる前に、配置されたカテーテルが機能していることを確認してください。ポートの特定のフーバー針に取り付けられた1mLシリンジで機能を確認してください。
2. 200 μLの生理食塩水を点滴ポートに注入します。抵抗に対する許容誤差がゼロの滑らかな流れを探します。
3. 開存性を維持するために、ポートとカテーテルを10%ヘパリンで洗い流します。

8.皮膚の切開を閉じます

1. ポートリザーバー(図3C)の周りの皮膚切開を3-0吸収性縫合糸で閉じます。

9.カテーテルの先端を腹腔内に固定します

1. 切開された腹壁の筋肉の周りに4-0の丸い吸収性縫合糸を備えた緩い財布ひも縫合糸を配置します。カテーテルの近位フェルトを切開部内に通します。
2. 準備した巾着縫合糸をチューブの周りに締め付け、2番目のフェルトを巾着紐の外側、筋肉層の上に保ち(図3D)、3-0吸収性縫合糸で皮膚を閉じます(図2)。

10.術後および毎日動物を監視し、術後鎮痛と体液を投与し、 最低7日間および完全に回復するまで、毎日の術後記録を維持します

1. カテーテルを通して200μLの生理食塩水を毎日注入することで、カテーテルの機能を維持します。

11.液体注入

1. 皮膚切開を注意深く検査することにより、処置後のプロセスを確認します。
2. LPSを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で0.2 μg/μLの作業濃度に希釈することにより、腹腔内注射(i.p.)用のLPS 2 mg / kg体重を調製します(本質的に、2 μg / g体重の場合は10 μL、20 gマウスの場合は200 μLのLPS)。
3. カテーテル移植後2週目に注射を開始します。
   1. 利き手でない手で動物をそっと持ち、人差し指と親指を頭の方向に動かしながら点滴ポートを拘束します。
   2. リザーバーの上にある皮膚を70%イソプロピルアルコールで消毒します。フーバーニードルに取り付けられたシリンジを使用して、LPSを注入します。
      1. フーバーニードルで入港後、100μLの生理食塩水をポートに注入し、特許コースを確認します。
      2. 調製したLPS200μLを注入し、続いてチューブ洗浄用の生理食塩水100μLを注入し、抵抗がないことを確認します。

12.腹膜を採取する前にマウスを麻酔し、腹水を採取する

1. 7日間のLPS注射と2週間のカテーテル移植の後、腹膜生検を計画します。
2. 全身麻酔を計画します。
   1. マウスをイソフルランチャンバーで麻酔し、鎮痛剤を皮下注射する。
   2. 尾の付け根から動物を持ち、手の背側に動物を置きます。
   3. 動物を3%〜4%イソフルランで満たされた連続麻酔導入室に移す。左右の後肢につま先ピンチ反射がないことで、適切な全身麻酔を確認します。イソフルラン1%〜3%で全身麻酔の維持を維持する。

13.腹膜生検

1. 動物を仰臥位の加熱毛布の上に置きます。剣状骨下から膀胱まで正中線の皮膚切開を行います。
2. 筋膜下面を冷たいPBSで灌流します(図3E)。
3. 腹膜の完全性を損なうことなく、飛行機が完全に解剖されていることを確認してください。動物間でサンプルを一定に保つために、左下象限の外側腹膜反射から腹膜を解剖し、下側面の膀胱から始めて解剖を開始します(図3F)。
4. 腹膜の収穫に続いて、頸部脱臼によって動物を安楽死させる。

結果

すべての移植されたカテーテルは研究の終わりまで機能しており、カテーテルの脱落またはねじれは埋め込まれたカテーテルのいずれも複雑ではありませんでした。現在の修正技術は、LPSを用いた腹膜炎誘発モデルでさらに検証された。対照マウスは毎日200μLの通常の生理食塩水注射を受け、実験マウスにはプロトコルステップ11で説明したように、カテーテル移植後合計7日間200μLのLPSを注射しました。

腹膜の病理組織学的特徴をヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)およびマッソントリクローム染色により評価した。H&E染色切片の分析では、ImageJを用いて測定した腹膜下腔の細胞外マトリックス(ECM)の大幅な増加が見られました(図4A、アスタリスクでマーク)。対照マウスの腹膜下腔におけるECMの平均+ SDは87.10 + 24.66 μmであり、LPS曝露マウスでは2倍になりました(148.9 + 60.85 μm、P = 0.008)(図4B)。

ディスカッション

PDの3つのマウスモデルが記載されている。これには、腹膜表面の盲目的穿刺、開放永久系、および閉鎖系¹⁰が含まれる。腹膜表面の盲目的な穿刺は、腹腔内注射と同様の直接腹膜アクセスを伴うが、透析液の排出は許されない。この方法は盲検化された手順であるため、腹部内臓を傷つける可能性があります。開放永久システムモデルは、透析カテーテルと点滴ポートを体外に保ちます。ただし、マウスでのこの手法は、動物の動きによるバッグの切断、感染、長期実験の実行不能などの合併症に関連しています。閉鎖系腹膜カテーテルは2009年に導入されました。このシステムでは、アクセスポートとチューブの両方が動物の体に埋め込まれます。直接経皮液点滴が可能になる。ヒトでは、腹膜透析液バッグは体の外側に配置されますが、マウスでは可動性のためにこれは不可能です。また、側孔の詰まりやチューブ²⁰に関連するカテーテルの機械的閉塞がしばしば存在する。閉鎖系のリザーバーは可動性があり、反転する可能性があり、このイベントはリザーバーとチューブの接合部をねじれる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10%ヘパリン	Canada Inc.、ブーシャービル、ケベック州、カナダ)	医薬品
ブプレノルフィン0.3mg / mL	PAR製薬	NDC 42023-179-05
C57BL/6J マウス	ジャクソン研究所	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
クランプ	ファインサイエンスツール	13002-10
鉗子	ファインサイエンスツール	11002-12
デュモン #5SF 鉗子	ファインサイエンスツール	11252-00
デュモン血管カニューレ挿入鉗子	ファインサイエンスツール	11282-11
ファインハサミ - ラージループ	ファインサイエンスツール	14040-10
フィッシャーブランド 動物の耳パンチ	フィッシャー科学	13-812-201
ヒルHemostat	ファインサイエンスツール	13111-12
フーバーポイント針	アクセス テクノロジー	PG25-500	注射用針
イソフルラン、USP	コヴェトラス	NDCの11695-6777-2
E.coli	シグマ	L4391
顕微鏡	ニコン エクリプス 倒立顕微鏡	TE2000
ミニッツ マウス ポート 4フレンチ 保持ビーズとクロスホール付き	アクセス テクノロジー	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber ポイントニードル 25 G x 1/2´&急性;	アクセス テクノロジー	PG25-500
ハサミ	ファインサイエンスツール	14079-10
Vicryl 縫合糸	AD-外科	#L-G330R24