Method Article

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

末梢神経のミトコンドリア機能障害は、末梢神経障害に関連するいくつかの疾患を伴い、自己免疫疾患、糖尿病、感染症、遺伝性疾患、および腫瘍を含む複数の原因によって引き起こされる可能性がある。マウス末梢神経におけるミトコンドリア機能の評価は、サンプルサイズが小さいこと、組織内に存在するミトコンドリアの数が限られていること、およびミエリン鞘が存在するため、困難な場合があります。この研究で説明した技術は、ミトコンドリアを組織から単離する代わりに、筋線維に使用されるものから適応した独自の透過処理プロトコルを使用して、坐骨神経ミトコンドリア機能を評価することによって、これらの課題を最小限に抑えます。Amplex Red/Peroxidaseで蛍光反応種産生を測定し、サポニン透過神経における異なるミトコンドリア基質および阻害剤を比較することにより、ミトコンドリア呼吸状態、活性酸素種(ROS)、およびミトコンドリア複合体の活性を同時に検出することができました。したがって、ここで提示する方法は、他の技術によるミトコンドリア機能の評価と比較して利点を提供する。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアは、細胞の生存率を維持するために不可欠であり、エネルギー代謝(グルコース、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド代謝経路)などの多数の細胞機能を実行します。活性酸素種(ROS)産生の主要な部位として、ミトコンドリアはアポトーシスなどのいくつかの細胞シグナル伝達プロセスの中心であり、鉄硫黄(Fe-S)クラスターの合成、ミトコンドリアタンパク質の輸入と成熟、およびそれらのゲノムとリボソームの維持に関与しています1,2,3。ミトコンドリア膜ダイナミクスネットワークは、融合および核分裂プロセスによって制御され、彼らはまた、品質管理およびマイトファジー4,5,6のための機械を有する。

ミトコンドリア機能障害は、癌、糖尿病、および肥満などのいくつかの病理学的状態の出現と関連している7。ミトコンドリア機能の障害は、アルツハイマー病8,9、パーキンソン病10,11、筋萎縮性側索....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

現在のプロトコルは、研究における動物の使用に関する倫理委員会、CCS/UFRJ(CEUA-101/19)、および実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインによって承認されています。坐骨神経は生後4ヶ月の雄性C57BL/6マウスから単離され、施設ガイドラインに従って子宮頸部脱臼によって安楽死する。プロトコルのステップは、ミトコンドリアの劣化を避けるために最適化されています。したがって、このプロトコールでは、マウス坐骨神経組織郭清および透過処理の前に、ポラログラフィック酸素センサの較正を実施した。

1. 試薬の調製

  1. 組織保存バッファー(TPバッファー)を調製する。
    1. 10 mM の Ca-EGTA バッファーと 0.1 μM の遊離カルシウム、20 mM のイミダゾール、20 mM のタウリン、50 mM の K-MES、0.5 mM の DTT、6.56 mM の MgCl2、5.77 mM の ATP、15 mM のホスホクレアチン ( 材料表を参照)、pH 7.1。-20°Cで保管してください。
  2. ミトコンドリア呼吸バッファー(MRバッファー)を用意する。
    1. 0.5 mM のK2EGTA、3 mM の MgCl2、60 mM の MES、....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

透過処理された坐骨神経によるミトコンドリア酸素消費量を図2に表す。赤色のトレースは、単位質量あたりのO2フラックスをpmol/s.mgで表します。内因性基質(日常的な呼吸)で基礎酸素消費を記録した後、コハク酸塩(SUCC)を注入して複合体II(コハク酸デヒドロゲナーゼ)駆動呼吸を記録し、酸素消費率の増加をもたらす。順番に、飽和濃度のADPが添加され、ATP合成酵素を活性化し、酸化的リン酸化を駆動する。これは、ミトコンドリア呼吸のリン酸化状態をもたらす。リン酸化状態呼吸とは、ATP合成酵素がATP26を生成するためのプロトン原動力としてプロトン勾配によって形成される膜電位を用いて、ADP+Pi(無機リン酸)からATPを生成できることを意味する。ATP合成酵素活性によって促進される膜電位の低下に伴い、酸素消費が促進され、酸素流の増加が観察される。外因性シトクロムc(CYTC)の添加は、呼吸の最小限の刺激のみを促進し、この調製物のミトコンドリア外膜完全性を認定した。組織の透過化は、膜の完全性およびシトクロムcの喪失.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経障害に伴ういくつかの疾患または状態は、危険因子としてミトコンドリア機能障害を有する。末梢神経のミトコンドリア機能の評価は、これらの神経変性状態でミトコンドリアがどのように作用するかを解明するために不可欠です。ミトコンドリア機能の評価は、単離方法の難しさおよび材料の不足のために面倒である。従って、ミトコンドリアの単離を必要としない組織透過技術の開発が不可欠である。

透過組織におけるミトコンドリア機能を評価するには、細胞呼吸を妨げることなく細胞原形質膜を透過できる化学物質を選択することが重要です。坐骨神経などの末梢神経において、ミエリン組成は約70%が脂質であり、そのほとんどはコレステロール33,34である。コレステロール分子と相互作用するサポニンおよびジジトニンなどの透過剤の選択は、他の細胞区画に干渉することなくミトコンドリア機構への基質アクセスを可能にする細孔をもたらす35、

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らには開示するものは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Instituto Serrapilheira、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)の資金提供を受けた。アントニオ・ガリーナ・フィーリョ博士、モニカ・モンテロ・ロメリ博士、クラウディオ・増田博士の研究室施設への支援、マーサ・ソレンソン博士の論文改善のための親切で貴重なコメントに感謝しています。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アデノシン 5' 三リン酸二ナトリウム塩水和物Sigma-AldrichA26209
アデノシン 5′-二リン酸ナトリウム塩Sigma-AldrichA2754
Amplex Red 試薬サーモフィッシャーサイエンティフィックA12222Amplex Red は、製品データシート
Antimycin A (Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA7030熱ショック画分、プロテアーゼフリー、脂肪酸フリー、基本的にグロブリンフリー、pH 7、≥98%
炭酸カルシウムSigma-AldrichC6763
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (FCCP)Sigma-AldrichC2920
シトクロム cSigma-AldrichC7752(馬の心臓から、小さなヘムタンパク質)
DataLab version 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, AustriaCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
デジタル軌道マイクロプレートシェーカー 120Vサーモフィッシャー 科学88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA ナトリウム塩Sigma-AldrichE8145
ハミルトンシリンジSigma-AldrichHAM8007510 uL、25 uL および 50 uL
HEPESΣ-AldrichH3375
水素過酸化物溶液 30% W/WメルクH1009
イミダゾールSigma-AldrichI2399
L-(マイナス)●リンゴ酸Sigma-AldrichM7397
塩化マグネシウム六水和物Sigma-AldrichM2393
MES ナトリウム塩Sigma-AldrichM3885
マイクロ解剖鉗子、湾曲Sigma-AldrichF4142
マイクロ解剖鉗子、ストレートSigma-AldrichF4017
O2K - フィルターセット アンプレックスレッドOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44321-01Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria.ミトコンドル生理ネットワーク 17.17.
O2K - 蛍光LED2 - モジュールコンポーネント Fluorscence-Sensor GreenOROBOROS INSTRUMENTS, Austria44210-01
オリゴマイシンSigma-AldrichO4876(Streptomyces diastatochromogenes; オリゴマイシンA、B、Cの混合物
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, オーストリアhttp://www.oroboros.at
パルミトイルカルニチン (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)グマ・アルドリッチP4509
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼシグマ・アルドリッチP8375
シャーレ、ポリスチレンMERCKP5606
ホスホクレアチン二ナトリウム塩水和物シグマ・アルドリッチP7936
リン酸二水素カリウム 一塩基性シグマ・アルドリッチPHR1330
水酸化カリウムシグマ・アルドリッチ221473
ロテノンシグマ・アルドリッチR8875
サポニンシグマ・アルドリッチSAE0073
ピルビン酸ナトリウムシグマ・アルドリッチP5280
コハク酸ナトリウム 二塩基性六水和物シグマ・アルドリッチS2378
ショ糖シグマ・アルドリッチS9378
タウリンシグマ・アルドリッチT0625
シ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionSciatic NerveHigh Resolution RespirometryOxygen ConsumptionReactive Oxygen SpeciesSaponin PermeabilizationElectron Transport SystemMitochondrial Complex ActivityATP SynthesisPeripheral Neuropathy

Related Articles