高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Summary

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。

Abstract

末梢神経のミトコンドリア機能障害は、末梢神経障害に関連するいくつかの疾患を伴い、自己免疫疾患、糖尿病、感染症、遺伝性疾患、および腫瘍を含む複数の原因によって引き起こされる可能性がある。マウス末梢神経におけるミトコンドリア機能の評価は、サンプルサイズが小さいこと、組織内に存在するミトコンドリアの数が限られていること、およびミエリン鞘が存在するため、困難な場合があります。この研究で説明した技術は、ミトコンドリアを組織から単離する代わりに、筋線維に使用されるものから適応した独自の透過処理プロトコルを使用して、坐骨神経ミトコンドリア機能を評価することによって、これらの課題を最小限に抑えます。Amplex Red/Peroxidaseで蛍光反応種産生を測定し、サポニン透過神経における異なるミトコンドリア基質および阻害剤を比較することにより、ミトコンドリア呼吸状態、活性酸素種(ROS)、およびミトコンドリア複合体の活性を同時に検出することができました。したがって、ここで提示する方法は、他の技術によるミトコンドリア機能の評価と比較して利点を提供する。

Introduction

ミトコンドリアは、細胞の生存率を維持するために不可欠であり、エネルギー代謝(グルコース、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド代謝経路)などの多数の細胞機能を実行します。活性酸素種(ROS)産生の主要な部位として、ミトコンドリアはアポトーシスなどのいくつかの細胞シグナル伝達プロセスの中心であり、鉄硫黄(Fe-S)クラスターの合成、ミトコンドリアタンパク質の輸入と成熟、およびそれらのゲノムとリボソームの維持に関与しています^1,2,3。ミトコンドリア膜ダイナミクスネットワークは、融合および核分裂プロセスによって制御され、彼らはまた、品質管理およびマイトファ^ジー4,5,6のための機械を有する。

ミトコンドリア機能障害は、癌、糖尿病、および肥満などのいくつかの病理学的状態の出現と関連している⁷。ミトコンドリア機能の障害は、アルツハイマー病^8,9、パーキンソン病^10,11、筋萎縮性側索硬化症12,13、およびハンチントン病^14,15のように、中枢神経系に影響を及ぼす神経変性障害において検出される。.末梢神経系において、軸索におけるミトコンドリア機能の喪失は、ギラン・バレー症候群¹⁶、¹⁷などの免疫神経障害において観察され、軸索における高いミトコンドリアROS産生と関連して^、これらの事象はシュワン細胞¹⁸におけるMAPキナーゼ活性化をもたらす。これは、ミトコンドリア生理学が部位特異的細胞だけでなく、組織全体にとって不可欠である可能性があることを示しています。HIV関連遠位感覚多発ニューロパチー(HIV-DSP)において、ミトコンドリアは、転写のトランスアクチベーター(HIV-TAT)タンパク質がHIVを効率的に複製することを可能にするメカニズムにおける役割、ならびにHIV感染の病因における他のいくつかの役割を有する^19,20。

坐骨神経ミトコンドリア生理学の評価は、神経障害を調査するための必須の標的として浮上している⁷、^21、22。糖尿病性神経障害において、プロテオミクスおよびメタボローム解析は、糖尿病におけるほとんどの分子変化が坐骨神経ミトコンドリア酸化的リン酸化的リン酸化および脂質代謝に影響を及ぼすことを示唆している⁷。これらの変化はまた、肥満誘発性糖尿病の初期の徴候であるように思われる²¹。化学療法誘発性疼痛性神経障害のマウスモデルにおいて、坐骨神経におけるミトコンドリア障害は、酸化的リン酸化²²の減少、およびミトコンドリア複合体活性、膜電位、およびATP含量の減少として検出^される23。しかし、いくつかのグループが神経障害におけるミトコンドリア機能障害を挙げているが、これらの研究は、ミトコンドリア膜の保存のないミトコンドリア複合体における活性の測定に限定されており、ミトコンドリア完全性の評価またはミトコンドリアATP産生のパラメータとしてのATP含量の測定を欠いている。一般に、ミトコンドリアの酸素消費量とROS産生を適切に評価するには、パーコール/スクロース勾配での微分遠心分離によるミトコンドリアの単離が必要です。ミトコンドリアの単離はまた、大量の組織が必要であり、ミトコンドリアの喪失および破壊のために、坐骨神経組織の制限因子となり得る。

本研究は、ミトコンドリアの酸素消費と坐骨神経におけるROS産生としてミトコンドリア生理学を測定し、ミトコンドリア膜を保存し、ミトコンドリアを単離する必要なしに測定するプロトコルを提供することを目的とする。このプロトコルは、高分解能呼吸法(HRR)による透過処理筋線維²⁴ における酸素消費測定値から適合される。この手順の利点は、坐骨神経などの少量の組織におけるミトコンドリアを評価し、その 場でミトコンドリアパラメータを評価し、それによってミトコンドリア環境、構造、および生体エネルギープロファイルを保存し、生理学的に信頼できる結果を得る可能性である。ミトコンドリアの呼吸状態は、ミトコンドリアの生体エネルギー学およびミトコンドリア膜完全性のためのシトクロムc係数を適切に評価するために、坐骨神経透過後の基質および阻害剤を用いて決定され、ミトコンドリア電子輸送系(ETS)の評価および必須パラメータの計算のステップのガイドを提供する。この研究は、末梢神経障害など、坐骨神経代謝が関与する病態生理学的メカニズムの質問に答えるためのツールを提供することができる。

Protocol

現在のプロトコルは、研究における動物の使用に関する倫理委員会、CCS/UFRJ(CEUA-101/19)、および実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインによって承認されています。坐骨神経は生後4ヶ月の雄性C57BL/6マウスから単離され、施設ガイドラインに従って子宮頸部脱臼によって安楽死する。プロトコルのステップは、ミトコンドリアの劣化を避けるために最適化されています。したがって、このプロトコールでは、マウス坐骨神経組織郭清および透過処理の前に、ポラログラフィック酸素センサの較正を実施した。

1. 試薬の調製

1. 組織保存バッファー(TPバッファー)を調製する。
   1. 10 mM の Ca-EGTA バッファーと 0.1 μM の遊離カルシウム、20 mM のイミダゾール、20 mM のタウリン、50 mM の K-MES、0.5 mM の DTT、6.56 mM の MgCl₂、5.77 mM の ATP、15 mM のホスホクレアチン ( 材料表を参照)、pH 7.1。-20°Cで保管してください。
2. ミトコンドリア呼吸バッファー(MRバッファー)を用意する。
   1. 0.5 mM の_K2EGTA、3 mM の MgCl₂、60 mM の MES、20 mM のタウリン、10 mM の KH₂PO 4、20 mM の HEPES、110 mM の D-スクロース、1 mg/mL の BSA (脂肪酸フリー)(材料表を参照)、pH 7.4。-20°Cで保存してください。
3. 5mgのサポニン( 材料表を参照)を1mLのTP緩衝液に溶解してサポニン原液を調製し(ステップ1.1)、氷上に保管する。サポニンは新しく調製されています。
4. 粉末( 材料表を参照)をDMSOで再懸濁してAmplex Redを調製し、2mMのストック濃度を得て、光から保護されたバイアル中で-20°Cで保存する。
   注:凍結および融解によるプローブの摩耗を避けるために、6ヶ月²⁵以内の保管のために小さなアリコートを作成してください。

2. 高解像度呼吸法(HRR)用のポラログラフィック酸素センサーの校正

1. 器具とシリンジのHRRチャンバーを清掃します( 材料表を参照)。
   1. HRRチャンバーを開き、上部まで蒸留水で満たし、5分間3倍にかき混ぜる。エタノールで繰り返し、次に水でもう一度繰り返します。ストッパーとシリンジを水/エタノール/水でそれぞれ3倍ずつ洗浄します。
2. HRRソフトウェアで次のキャリブレーション設定を適用します( 材料表を参照)。
   1. HRRソフトウェア制御では、実験温度(37°C)、酸素センサー(ゲイン、2、分極電圧、800mV)、アンペロメトリックセンサー(ゲイン、1000、分極電圧、100mV)のパラメータを追加します。
3. 酸素センサーを校正します。
   1. 2.1 mLのMRバッファーをピペット(ステップ1.2)各チャンバーに入れます。ストッパーで閉じ、気泡が形成されるまでチャンバーに空気を吸い込みます。質量あたりの酸素流束が安定するまで、校正モードで37°Cで1時間攪拌します。
   2. ソフトウェア内のポラログラフィック酸素センサの空気較正を、製造元のプロトコル²⁴に従って実行する。
      メモ: キャリブレーション手順は、実験の前に 1 回だけ実行されます。追加の実験は、同じ呼吸媒体および温度で、単にチャンバを洗浄した後に行うことができる(ステップ2.1)。

3. 坐骨神経の解剖と透過

1. 以下の手順に従って坐骨神経を取り外します。
   1. ケージから取り出した後、頸部脱臼によって動物を安楽死させ、ベンチで休むように穏やかに拘束する。
   2. 安楽死させた動物では、背骨の近くから始めて、太ももを足に向かって進み、腰のはさみで切開します。神経に付着した皮膚や筋肉を取り除き、坐骨神経全体を切断して取り除きます。
   3. 直ちに組織を秤量し、冷たいTBバッファー(4°C)で満たされたバイアルに入れます。氷上で手順 3.2 ~ 3.3 を実行します。
      注:ウェットティッシュ重量は、次の手順で酸素消費量とROS生産フローを正規化するために使用されます。組織をすぐに計量できない場合は、冷たいTBバッファーで保存してください。この手順は新鮮な組織で行われ、ミトコンドリアの損傷を避けるために凍結してはなりません。
2. 組織の準備のために、坐骨神経をそれを覆うのに十分なTPバッファーでペトリ皿に入れます。神経の一端を鉗子で持ち、もう一対の鉗子で神経束を水平に引き抜きます。
   メモ:この手順は、組織の劣化を避けるために10分以内に行う必要があります。組織は、以前の白い不透明な組織とは反対側の透明な霧の層として視覚化できると、準備が整います(図1)。
3. まず、組織透過処理のために1mLのTPバッファーを含む小さな皿にスプレイ組織を移します。透過処理を開始するには、1 mLのTP Bufferと10 μLのサポニンを含むディッシュに鉗子で組織を移します(原液から、ステップ1.3)。
   1. マイクロプレートシェーカーで30分間静かに振とうした後、鉗子で組織をMRバッファー(1mL)を含む新鮮な皿に移し、10分間静かに振盪する。鉗子で組織を較正されたHRRチャンバーに移す。

4. 酸素消費量とROS生産量測定

1. HRRチャンバーを2.1 mLのMRバッファーで満たし、Amplex Red(ステップ1.4)を終濃度5 μM、ペルオキシダーゼを2 U/mLに加え、透過処理した坐骨神経を追加します(ステップ3)。
   1. 機器の蛍光センサーを接続し、ソフトウェアのコントロールセクションのライトをオフにして、 オキシグラフへの接続を押します。ソフトウェアの「編集プロトコル」に、ステップ3.1.3で測定した組織重量を挿入します。
2. 「レイアウト」に移動し、「単位サンプルあたりの特定のフラックス」オプションを選択し、プロットを選択して酸素消費量の読み出しと、必要に応じて_H2O2生産に同時にアクセスします。約10分待ちます。
   注:この時間は、基質(基礎)を追加せずに酸素消費の基礎流れを安定させるために必要です。さらに注入する前に、酸素の流れが安定していることを確認してください。
3. _H2O2の2つのパルスを、それぞれ1つずつ最終濃度260μMに注入_{し、チャン}バ内で後で較正する。
4. ミトコンドリア複合体II基質であるコハク酸塩20μL( 材料表参照)を注入し、ミトコンドリア電子伝達系を活性化する。
   注:この時点で異なるミトコンドリア基質を添加して、異なる複合体によるミトコンドリア機能を評価することができる。ミトコンドリア複合体IおよびIIの基質を変化させた代表的な結果を、図2および図3に示す。この時点で、O2消費量と_{H2O2生成の増加}が、同時に、図3に観察される。
5. 20 μLのアデノシン二リン酸(ADP)を加えて、アデノシン三リン酸(ATP)合成を活性化する。
   注:ADPはATP合成を刺激し、膜電位を低下させます。O2消費量の増加および_H2O2の生成_{の減少が観察}されると予想されている^26,27。
6. 順番に、膜完全性の指標として5μLのシトクロムc( 材料表を参照)を加える。
   注:組織がよく調製され、透過処理されている場合、シトクロムcは酸素消費量を15%以上増加させてはならない。この問題が発生した場合は、トラブルシューティングのセクションを参照して推奨事項を確認してください。
7. _O2消費量のさらなる減少が観察されなくなるまで、0.2μg/mLのオリゴマイシンのアリコート(材料表を参照)で滴定する。
   注:オリゴマイシンは、ATP合成を阻害することによって作用し、_O2の流れの減少および高い膜電位^26,27によって好まれる_H2O2形成の増強をもたらす。
8. 0.5 μmol/Lのシアン化カルボニル4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)( 材料表を参照)のアリコートで滴定し、ミトコンドリアアンカプラを、_O2 消費量のさらなる増加を観察できないまで滴定する。実験を終了するには、2 μlのアンチマイシンAを終濃度5 μMに注入し、流れ安定化を待ちます。
   注:FCCP注入後の膜電位散逸により、_H2O2産生の減少が観察される。アンチマイシンAは複合体IIIを阻害し、それによって電子の流れを防止する。したがって、ミトコンドリア依存性_O2消費が損なわれ、質量当たりの酸素流束を減少させ、電子漏れを刺激し、_H2O2産生を増加させる^26、27。
9. コマンドバーに移動し、ソフトウェアで「多感覚」を検索し、 コントロールをクリックしてファイルを保存し、切断>します。
   注:他の基質および阻害剤の添加は、研究中の質問に従って行うことができる。代表的な結果に例を記載する。_H2O2較正は、実験を終えた後に、製造業者のプロトコル²⁸に従って行われる。
10. 保存したファイルを開き、「質量あたりの酸素フラックス」トレースを選択して、実験的な酸素消費結果を取得します。 Shift + マウスの左ボタンを押して、注射間のウィンドウを手動で選択します。
    1. マークス>統計に移動して、基質/阻害剤/非結合プロトコルの各注入の結果を視覚化します。_H2O2製造の場合、「アンプスロープ」トレースで同じ手順を実行します。
       メモ: ウィンドウを選択するときは、酸素(または_H2O2)がより安定して一定であるウィンドウを選択することで、ボリュームインジェクションのアーチファクトを回避してください。選択されたウィンドウの例は、代表的な結果(図2および図3)の黒い中括弧で表されます。

Results

透過処理された坐骨神経によるミトコンドリア酸素消費量を図2に表す。赤色のトレースは、単位質量あたりの_O2フラックスをpmol/s.mgで表します。内因性基質(日常的な呼吸)で基礎酸素消費を記録した後、コハク酸塩(SUCC)を注入して複合体II(コハク酸デヒドロゲナーゼ)駆動呼吸を記録し、酸素消費率の増加をもたらす。順番に、飽和濃度のADPが添加され、ATP合成酵素を活性化し、酸化的リン酸化を駆動する。これは、ミトコンドリア呼吸のリン酸化状態をもたらす。リン酸化状態呼吸とは、ATP合成酵素が^ATP26を生成するためのプロトン原動力としてプロトン勾配によって形成される膜電位を用いて、ADP+Pi(無機リン酸)からATPを生成できることを意味する。ATP合成酵素活性によって促進される膜電位の低下に伴い、酸素消費が促進され、酸素流の増加が観察される。外因性シトクロムc(CYTC)の添加は、呼吸の最小限の刺激のみを促進し、この調製物のミトコンドリア外膜完全性を認定した。組織の透過化は、膜の完全性およびシトクロムcの喪失...

Discussion

神経障害に伴ういくつかの疾患または状態は、危険因子としてミトコンドリア機能障害を有する。末梢神経のミトコンドリア機能の評価は、これらの神経変性状態でミトコンドリアがどのように作用するかを解明するために不可欠です。ミトコンドリア機能の評価は、単離方法の難しさおよび材料の不足のために面倒である。従って、ミトコンドリアの単離を必要としない組織透過技術の開発が不可欠である。

透過組織におけるミトコンドリア機能を評価するには、細胞呼吸を妨げることなく細胞原形質膜を透過できる化学物質を選択することが重要です。坐骨神経などの末梢神経において、ミエリン組成は約70%が脂質であり、そのほとんどはコレステロール^33,34である。コレステロール分子と相互作用するサポニンおよびジジトニンなどの透過剤の選択は、他の細胞区画に干渉することなくミトコンドリア機構への基質アクセスを可能にする細孔をもたらす^35、

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アデノシン 5' 三リン酸二ナトリウム塩水和物	Sigma-Aldrich	A26209
アデノシン 5′-二リン酸ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red 試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A12222	Amplex Red は、製品データシート
Antimycin A (Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A7030	熱ショック画分、プロテアーゼフリー、脂肪酸フリー、基本的にグロブリンフリー、pH 7、≥98%
炭酸カルシウム	Sigma-Aldrich	C6763
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
シトクロム c	Sigma-Aldrich	C7752	(馬の心臓から、小さなヘムタンパク質)
DataLab version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
デジタル軌道マイクロプレートシェーカー 120V	サーモフィッシャー 科学	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	E8145
ハミルトンシリンジ	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL、25 uL および 50 uL
HEPES	Σ-Aldrich	H3375
水素過酸化物溶液 30% W/W	メルク	H1009
イミダゾール	Sigma-Aldrich	I2399
L-(マイナス)●リンゴ酸	Sigma-Aldrich	M7397
塩化マグネシウム六水和物	Sigma-Aldrich	M2393
MES ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	M3885
マイクロ解剖鉗子、湾曲	Sigma-Aldrich	F4142
マイクロ解剖鉗子、ストレート	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - フィルターセット アンプレックスレッド	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria.ミトコンドル生理ネットワーク 17.17.
O2K - 蛍光LED2 - モジュールコンポーネント Fluorscence-Sensor Green	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
オリゴマイシン	Sigma-Aldrich	O4876	(Streptomyces diastatochromogenes; オリゴマイシンA、B、Cの混合物
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, オーストリア	http://www.oroboros.at
パルミトイルカルニチン (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	グマ・アルドリッチ	P4509
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ	シグマ・アルドリッチ	P8375
シャーレ、ポリスチレン	MERCK	P5606
ホスホクレアチン二ナトリウム塩水和物	シグマ・アルドリッチ	P7936
リン酸二水素カリウム 一塩基性	シグマ・アルドリッチ	PHR1330
水酸化	カリウムシグマ・アルドリッチ	221473
ロテノン	シグマ・アルドリッチ	R8875
サポニン	シグマ・アルドリッチ	SAE0073
ピルビン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	P5280
コハク酸ナトリウム 二塩基性六水和物	シグマ・アルドリッチ	S2378
ショ糖	シグマ・アルドリッチ	S9378
タウリン	シグマ・アルドリッチ	T0625