カエノラブディティス・エレガンスゲノムDNAの小規模抽出

ここでは、PCRベースのアプリケーションのためにDNAをアクセス可能にするために、Caenorhabditis elegansの溶解のための2つの関連するプロトコルが提示されています。PCRは、クローニングやシーケンシングのためのDNA断片のジェノタイピングや増幅など、多くの用途で使用される一般的に使用される分子技術です。小型(1mm)の自由生活型回虫C. elegansは、生物学的研究に人気のある動物システムです。単一の動物または数匹の動物から適切なゲノムDNAを得ることは、PCRによって配列を増幅するのに十分である。後期L4幼虫および成虫は、子宮内に〜1,000個の体細胞(いくつかの多核、倍数体細胞を含む)、生殖細胞、および(動物が雌雄同体である場合)子孫のみ^{を含む1。}しかしながら、これらの動物は、ゲノム^DNA2を抽出するために破壊されなければならないキューティクルによって保護されている。PCR用の線虫ゲノムDNAテンプレートを調製するための標準的な方法は、複数のステップを伴い、数時間かかる。動物を最初にプロテイナーゼKを含むワーム溶解緩衝液(−70°C以下)中で少なくとも15〜45分間凍結する(いくつかのプロトコルではより長いことが推奨される)³、^4、5、6。このステップは動物をひび割れさせます。

凍結後、動物をプロテイナーゼKが機能するために60〜65°Cで1時間インキュベートし、次いで酵素を95°Cで15〜30分間失活させる。 プロテイナーゼKは、DNAを分解するヌクレアーゼを破壊する。PCR前のプロテイナーゼKの不活性化は、プロテイナーゼKがDNAポリメラーゼを分解するのを防ぐために重要である。ここで説明する2つのキットベースのプロトコルは、日常の研究および教育ラボアプリケーションのために、単一の動物または少数の線虫のいずれかからゲノムDNAを抽出するための迅速で信頼性が高く、費用対効果の高い方法です。使用されたキットは、もともと動物組織、唾液、および毛髪からDNAを抽出するために製造業者によって最適化されました⁷。独自の組織調製溶液と抽出溶液を使用して細胞を溶解し、ゲノムDNAをアクセス可能にします。その後、独自の中和溶液がPCRを阻害する可能性のある成分(塩、イオン、^Mg2+結合分子など)を中和します。

ジェノタイピングの際、1匹の動物を試験することができる。株がホモ接合性かどうかを判断する場合、1匹の動物から6匹以上の子孫を試験すると、系統がホモ接合性であるかどうかの高い信頼性が得られます(ヘテロ接合性の親から6つのホモ接合型変異体子孫をランダムに摘み取る確率は0.02%です[(1/4)⁶ × 100% = 0.02%])。この方法は1)簡単で、プロテイナーゼK法よりも少ないステップで、および2)鋳型調製時間を15分に短縮する。この研究の結果は、開発されたプロトコルが単一または少数のワームからゲノムDNAを抽出する際に堅牢に機能し、PCRを含む高度に精製されたDNAを必要としない下流アプリケーションに確実に使用できることを示しています。

1. C.エレガンスの メンテナンス

注:N2(野生型)および blmp-1(tm548)C.エレガン ス株を、標準線虫増殖培地(NGM)プレート上で20°Cで維持した。

1. 2Lフラスコ内の973 mLの水に23.005 gのNGM粉末を溶解してNGMプレートを調製する。フラスコの開口部をアルミホイル(または通気可能なオートクレーブ可能なキャップ)で覆い、オートクレーブテープでカバーを固定します。オートクレーブは、粉末を溶解し、少なくとも30分の滅菌サイクルで内容物を滅菌する。
2. 水浴中で培地を60°Cに冷却する。
3. 冷却した培地に、25mLの滅菌1Mリン酸(KH2PO4)緩衝液、pH6.0;1mLの1M塩化カルシウム溶液;1mLの1M硫酸マグネシウム溶液を含む。
4. マグネチックスタープレート上で媒体を攪拌して均一な混合物を得、不均一な冷却および固化を防止する(〜5分)。攪拌子が渦を作るのに十分な速さで回転するが、気泡が導入されるほど速くないことを確認してください(〜250-300rpm)。
5. 各10cmのペトリプレート(合計で約40枚のプレート)に約25mLの培地を注ぎます。プレートを室温で一晩乾燥させます(通常16〜25°C)。
6. エシェリヒア・コリOP50のコロニーを30-50 mLのLBブロス中で37°Cで一晩成長させる。
7. 各プレートに500 μLの 大腸菌 OP50培養物を種まきし、使用前に室温(典型的には16〜25°^C)で乾燥させる8。プレートを4°Cで最大3週間保管してください。
8. C. elegansをワイヤーピックまたは他の方法を用いて播種プレートに移し、株に必要な温度でL4または成体段階まで成長させる(典型的には16〜25°C、ダウアーとして飢えた動物を播種した場合は1〜2日、動物を胚として播種した場合は3〜4日)⁸。

2. シングルワームDNA抽出

注:この方法は、単一のワーム(総容量1.8μL中に1つのワーム)からDNAを抽出するのに有用である。一度に複数のワームが溶解する場合は、マスターミックスを作成できます。

1. サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
2. キットから抽出溶液0.8 μLを氷上の0.2 mL PCRチューブの内壁にアリコートします。キットから0.2 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
3. 解剖顕微鏡⁹でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体を特定するには、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を探します。成体の雌雄同体を特定するには、プレート上で最大の動物を探し、子宮内に楕円形の胚が見える可能性があります。
4. 白金ワイヤーピックを用いて、選択された動物を溶液¹⁰に移す。
5. チューブを室温で短時間(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)遠心分離し、チューブの底にある内容物を回収する。
6. チューブをサーモサイクラーに置き、ステップ2.1で設定した溶解プログラムを実行します。
7. プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから0.8 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
8. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
9. 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
   注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である⁷。

3. 少数の個人のDNA抽出

注:この方法は、いくつかのワームからDNAを抽出するのに便利です。マスターミックスは、複数の株が一度に溶解される場合に調製することができる。

1. サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
2. キットから抽出溶液 2.0 μL を氷上の 0.2 mL PCR チューブの内壁にアリコートします。キットから0.5 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
3. 解剖顕微鏡⁹下でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体は、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を有する。成体の雌雄同体はプレート上で最大の動物であり、子宮内に楕円形の胚が見えることがあります。
4. 白金ワイヤーピックを用いて、数匹の動物を溶液に移す:9匹の動物は0.5 μLの溶解物あたり1匹相当のゲノムDNAを、16匹の動物は0.25 μL(3.5線虫/μL)で約1匹相当のゲノムDNAを収穫^する10。
   注:このボリュームに16匹を超える動物を移すことは困難です。
5. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
6. チューブをサーモサイクラーに入れ、ステップ3.1で設定した溶解プログラムを実行します。
7. プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから2 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
8. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
9. 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
   注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である⁷。

4. PCR反応

注:このワーム溶解技術の1つの下流のアプリケーション、すなわち高速ポリメラーゼを使用して欠失変異を検出することが記載されている。1反応あたりのワームの1/50^までの 希釈でPCRを成功させるためのゲノム鋳型DNAの産生における2つのワーム溶解プロトコルの有効性も実証されています。

1. ステップ2およびステップ3で前述したように、野生型N2および変異株を用いて、単一のワームおよび16個のワームからDNAを抽出する。
2. 野生型N2動物からシングルワームDNAの2倍、10倍、20倍、および50倍希釈液を調製する。
3. 目的の配列に固有のプライマーとホットスタート PCR マスターミックスを使用して、メーカーのプロトコールに従って PCR 反応を設定します (表 1 および 表 2)。各反応では、1 μL の希釈されていない DNA または 2 μL の希釈 DNA を鋳型として使用します。
4. ゲル電気泳動およびイメージング¹¹によりPCR産物を確認する。

単一または少数の野生型成虫からのゲノムDNAを、市販のキットまたは従来の溶解プロトコールを用いて抽出し、これら2つの方法の有効性を比較した。次いで、これらの溶解物をPCRのテンプレートとして使用し、〜2,100 bpのより大きな標的( blmp−1をコードする)または〜500 bpのより小さい標的( sma−10の一部をコードする)のいずれかを増幅した。どちらの方法も、適切なPCR産物を首尾よく得た(図1A)。

次に、キット抽出されたゲノムDNAが様々なDNAポリメラーゼの鋳型として機能する能力が実証された。抽出したゲノムDNAを鋳型として、異なる能力(速度、忠実度、製品サイズを含む)を有する4つのポリメラーゼを用いて0.5kbの産物を増幅した。予想されるサイズの生成物は、単成体溶解または9成人溶解からのテンプレートを使用して、これらのポリメラーゼによって生成された(図1B)。テンプレート配列を正しく増幅するPCRポリメラーゼのテンプレート配列および忠実度は、シークエンシングによって確認することができる(補足図S1)。この結果は、キットプロトコルから抽出されたゲノムDNAが、様々なポリメラーゼに適切な鋳型を提供することを示している。

PCR有効性は、市販のキットを用いて単一の動物から抽出された異なる濃度のゲノムDNAを用いて試験した。DNAを2倍、10倍、20倍、または50倍に希釈し、1反応あたりワームの約2分の1、10分の1、20分の1、および50分の1に相当するものをPCRに使用しました。これらのDNA鋳型濃度は、約2.1 kbのより大きな標的または約0.5 kbのより小さい標的のいずれかの増幅を支持した(図1C)12。0.5 kb PCR産物のDNA濃度依存的な収率は観察されたが、2.1 kb PCR産物の収率はすべての反応において同等に見えた。

これらのプロトコールがPCRジェノタイピングに適したC. elegansからゲノムDNAを産生することを実証するために、単一および16の野生型およびblmp-1機能喪失変異体(blmp-1(tm548))からゲノムDNAを抽出した。blmp-1遺伝子は、遠位先端細胞遊走、体の大きさ、および発生において重要な役割を有する転写因子をコードする12、13、14、15、16。blmp-1変異体は、エクソン3およびイントロン315の一部を除去する810 bp欠失を有する。プライマーは、野生型DNAテンプレートを使用すると2,134 bpの産物、blmp-1(-) DNAを使用すると1,324 bpの産物が得られるように設計されました。適切なサイズのPCR産物を、L4ステージ動物からのシングルワーム(反応あたり約0.5ワーム)または16ワーム溶解(反応あたり3.5ワーム)のいずれかの1 μLを使用して検出しました(図1D)。この結果は、いずれかのプロトコルを用いてキット抽出されたゲノムDNAが、遺伝子型株に対するPCRのための同様に有効なテンプレートを提供することを示している。

これらの結果は、単一および複数の動物からの市販の組織DNA抽出キットを用いた C. elegans ゲノムDNA調製物が、PCRのテンプレートとして確実に使用できることを示している。

図1:単一線虫および複数の線虫からの市販キットを用いたDNA調製物は、PCRによる堅牢な増幅を可能にする。 PCR 産物を 1x TAE バッファー (5 μL (A,B) または 10 μL (C,D) の 1% アガロースゲルにロードし、90 ~ 100 V で 30 分から 2 時間実行しました。2対数DNAラダーをすべてのゲルに使用した。(a)2つのプライマーセットを用いて鋳型を作成する従来のプロテイナーゼK法とキットによるDNA溶解の比較。野生型成虫を溶解し、1匹の動物に相当するものをすべての反応のテンプレートとして使用した。レーン 1 ~ 4、2.1 kb 製品。レーン1は、プロテイナーゼKによるシングルワーム溶解からのPCR、レーン2はキット法によるシングルワーム溶解からのPCR。レーン3は、プロテイナーゼKによる9匹のワーム溶解からのPCR、レーン4はキット法による9匹のワーム溶解からのPCR。レーン 5 ~ 8、0.5 KB 製品。レーン5は、プロテイナーゼKによるシングルワーム溶解からのPCR、レーン6はキット法によるシングルワーム溶解からのPCR。レーン7は、プロテイナーゼKによる9匹のワーム溶解からのPCR、レーン8はキット法による9匹のワーム溶解からのPCR。(B)DNA溶解のためのキット法は、複数のポリメラーゼによるPCRのための適切な鋳型を提供する。野生型成虫をキット法を用いて溶解し、0.5kb産物のPCRテンプレートとして動物の半分に相当するものを用いた。ポリメラーゼの詳細については、 材料表 を参照してください。レーン1は、高速ポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン2は、高速ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。レーン3は、 Taq ポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン4は、 Taq ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。レーン5は、高フィデリティポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン6は、高忠実度ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。レーン7は、高速、高忠実度ポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン8は、高速、高忠実度ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。(C)1つの野生型L4ワーム溶解の希釈物は、PCRのためのテンプレートを提供する。レーン 1 ~ 5、2.1 kb 製品。レーン 6 ~ 10、0.5 KB ターゲット。レーン1およびレーン6は、希釈されていないDNA。レーン2およびレーン7は、DNAを2倍希釈した。レーン3およびレーン8は、DNAを10倍希釈した。レーン4およびレーン9は、DNAを20倍希釈した。レーン5およびレーン10は、DNAを50倍希釈した。(D)1 μLの単一および16-ワームDNA調製物を鋳型として用いたPCRにより blmp-1 遺伝子座をジェノタイピングする。レーン1は、野生型シングルワーム溶解からのPCRである。レーン2、 blmp−1(−) シングルワーム溶解からのPCR。レーン3は、野生型16-ワーム溶解からのPCRである。レーン4は、 blmp−1(−)16 −ワーム溶解からのPCRである。略語:準備=調製方法;kb = キロベース;st. = 線虫期;dil. = DNAの希釈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:プライマーのリスト。

表2:PCR反応成分。

補足図S1:市販キットで調製したゲノムDNAの品質の確認のためのシークエンシング。 2つのシーケンシング反応の結果は、16-ワーム溶解からの高速、高忠実度ポリメラーゼ(Pol E)によって増幅された1,600ヌクレオチド以上のDNAの予想される配列と完全に一致します(表1、 表2A、および 表2D)。シーケンシング読み取り端は、低品質のベース読み取りを除去するためにトリミングされました。アラインメントは、EMBL-EBIマルチプル配列アラインメントツールMUSCLE(MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17を用いて行った。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、開示する利益相反はありません。