このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

カエノラブディティス・エレガンスゲノムDNAの小規模抽出

5.7K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/63716

⸱

2022年6月7日

 ,  , 
1Department of Biology, Texas Woman’s University

この記事について

サマリー

ここで提示されるのは、市販の組織キットを用いた1匹または数匹の動物からの Caenorhabditisエレガンス ゲノムDNAの単純かつ比較的迅速な単離の説明である。得られたgDNA調製物は、PCRに好適な鋳型である。

要約

単一または少数の Caenorhabditis elegans からのゲノムDNA抽出は、ジェノタイピングライン用のPCR、クローニング、シーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを持っています。 C. elegans からのゲノムDNA抽出のための伝統的なプロテイナーゼKベースの方法は数時間かかる。 C. elegans キューティクルを効果的に開封し、ゲノム DNA を抽出する市販の抽出キットは限られています。 C. elegans のゲノムDNAを抽出する簡単で高速(約15分)、費用対効果の高い方法が、教室や研究用途によく適していることがここで報告されています。このDNA抽出方法は、PCRを実行するための信頼性の高い鋳型を得るための出発物質として、単一または少数の後期幼虫(L4)または成虫線虫を使用するように最適化されています。この結果は、DNA品質がPCRによって異なるサイズの遺伝子標的を増幅するのに適しており、1反応あたり成人1人のゲノムDNAの50分の1に希釈しても、単一または数匹の動物のジェノタイピングを可能にすることを示している。報告されたプロトコルは、PCRベースのアプリケーション向けに、単一または少量の C. elegans サンプルからDNAテンプレートを迅速に製造するために確実に使用できます。

概要

ここでは、PCRベースのアプリケーションのためにDNAをアクセス可能にするために、Caenorhabditis elegansの溶解のための2つの関連するプロトコルが提示されています。PCRは、クローニングやシーケンシングのためのDNA断片のジェノタイピングや増幅など、多くの用途で使用される一般的に使用される分子技術です。小型(1mm)の自由生活型回虫C. elegansは、生物学的研究に人気のある動物システムです。単一の動物または数匹の動物から適切なゲノムDNAを得ることは、PCRによって配列を増幅するのに十分である。後期L4幼虫および成虫は、子宮内に〜1,000個の体細胞(いくつかの多核、倍数体細胞を含む)、生殖細胞、および(動物が雌雄同体である場合)子孫のみを含む1。しかしながら、これらの動物は、ゲノムDNA2を抽出するために破壊されなければならないキューティクルによって保護されている。PCR用の線虫ゲノムDNAテンプレートを調製するための標準的な方法は、複数のステップを伴い、数時間かかる。動物を最初にプロテイナーゼKを含むワーム溶解緩衝液(−70°C以下)中で少なくとも15〜45分間凍結する(いくつかのプロトコルではより長いことが推奨される)3、4、5、6。このステップは動物をひび割れさせます。

凍結後、動物をプロテイナーゼKが機能するために60〜65°Cで1時間インキュベートし、次いで酵素を95°Cで15〜30分間失活させる。 プロテイナーゼKは、DNAを分解するヌクレアーゼを破壊する。PCR前のプロテイナーゼKの不活性化は、プロテイナーゼKがDNAポリメラーゼを分解するのを防ぐために重要である。ここで説明する2つのキットベースのプロトコルは、日常の研究および教育ラボアプリケーションのために、単一の動物または少数の線虫のいずれかからゲノムDNAを抽出するための迅速で信頼性が高く、費用対効果の高い方法です。使用されたキットは、もともと動物組織、唾液、および毛髪からDNAを抽出するために製造業者によって最適化されました7。独自の組織調製溶液と抽出溶液を使用して細胞を溶解し、ゲノムDNAをアクセス可能にします。その後、独自の中和溶液がPCRを阻害する可能性のある成分(塩、イオン、Mg2+結合分子など)を中和します。

ジェノタイピングの際、1匹の動物を試験することができる。株がホモ接合性かどうかを判断する場合、1匹の動物から6匹以上の子孫を試験すると、系統がホモ接合性であるかどうかの高い信頼性が得られます(ヘテロ接合性の親から6つのホモ接合型変異体子孫をランダムに摘み取る確率は0.02%です[(1/4)6 × 100% = 0.02%])。この方法は1)簡単で、プロテイナーゼK法よりも少ないステップで、および2)鋳型調製時間を15分に短縮する。この研究の結果は、開発されたプロトコルが単一または少数のワームからゲノムDNAを抽出する際に堅牢に機能し、PCRを含む高度に精製されたDNAを必要としない下流アプリケーションに確実に使用できることを示しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. C.エレガンスの メンテナンス

注:N2(野生型)および blmp-1(tm548)C.エレガン ス株を、標準線虫増殖培地(NGM)プレート上で20°Cで維持した。

  1. 2Lフラスコ内の973 mLの水に23.005 gのNGM粉末を溶解してNGMプレートを調製する。フラスコの開口部をアルミホイル(または通気可能なオートクレーブ可能なキャップ)で覆い、オートクレーブテープでカバーを固定します。オートクレーブは、粉末を溶解し、少なくとも30分の滅菌サイクルで内容物を滅菌する。
  2. 水浴中で培地を60°Cに冷却する。
  3. 冷却した培地に、25mLの滅菌1Mリン酸(KH2PO4)緩衝液、pH6.0;1mLの1M塩化カルシウム溶液;1mLの1M硫酸マグネシウム溶液を含む。
  4. マグネチックスタープレート上で媒体を攪拌して均一な混合物を得、不均一な冷却および固化を防止する(〜5分)。攪拌子が渦を作るのに十分な速さで回転するが、気泡が導入されるほど速くないことを確認してください(〜250-300rpm)。
  5. 各10cmのペトリプレート(合計で約40枚のプレート)に約25mLの培地を注ぎます。プレートを室温で一晩乾燥させます(通常16〜25°C)。
  6. エシェリヒア・コリOP50のコロニーを30-50 mLのLBブロス中で37°Cで一晩成長させる。
  7. 各プレートに500 μLの 大腸菌 OP50培養物を種まきし、使用前に室温(典型的には16〜25°C)で乾燥させる8。プレートを4°Cで最大3週間保管してください。
  8. C. elegansをワイヤーピックまたは他の方法を用いて播種プレートに移し、株に必要な温度でL4または成体段階まで成長させる(典型的には16〜25°C、ダウアーとして飢えた動物を播種した場合は1〜2日、動物を胚として播種した場合は3〜4日)8。

2. シングルワームDNA抽出

注:この方法は、単一のワーム(総容量1.8μL中に1つのワーム)からDNAを抽出するのに有用である。一度に複数のワームが溶解する場合は、マスターミックスを作成できます。

  1. サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
  2. キットから抽出溶液0.8 μLを氷上の0.2 mL PCRチューブの内壁にアリコートします。キットから0.2 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
  3. 解剖顕微鏡9でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体を特定するには、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を探します。成体の雌雄同体を特定するには、プレート上で最大の動物を探し、子宮内に楕円形の胚が見える可能性があります。
  4. 白金ワイヤーピックを用いて、選択された動物を溶液10に移す。
  5. チューブを室温で短時間(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)遠心分離し、チューブの底にある内容物を回収する。
  6. チューブをサーモサイクラーに置き、ステップ2.1で設定した溶解プログラムを実行します。
  7. プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから0.8 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
  8. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
  9. 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
    注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である7。

3. 少数の個人のDNA抽出

注:この方法は、いくつかのワームからDNAを抽出するのに便利です。マスターミックスは、複数の株が一度に溶解される場合に調製することができる。

  1. サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
  2. キットから抽出溶液 2.0 μL を氷上の 0.2 mL PCR チューブの内壁にアリコートします。キットから0.5 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
  3. 解剖顕微鏡9下でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体は、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を有する。成体の雌雄同体はプレート上で最大の動物であり、子宮内に楕円形の胚が見えることがあります。
  4. 白金ワイヤーピックを用いて、数匹の動物を溶液に移す:9匹の動物は0.5 μLの溶解物あたり1匹相当のゲノムDNAを、16匹の動物は0.25 μL(3.5線虫/μL)で約1匹相当のゲノムDNAを収穫する10。
    注:このボリュームに16匹を超える動物を移すことは困難です。
  5. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
  6. チューブをサーモサイクラーに入れ、ステップ3.1で設定した溶解プログラムを実行します。
  7. プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから2 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
  8. チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
  9. 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
    注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である7。

4. PCR反応

注:このワーム溶解技術の1つの下流のアプリケーション、すなわち高速ポリメラーゼを使用して欠失変異を検出することが記載されている。1反応あたりのワームの1/50までの 希釈でPCRを成功させるためのゲノム鋳型DNAの産生における2つのワーム溶解プロトコルの有効性も実証されています。

  1. ステップ2およびステップ3で前述したように、野生型N2および変異株を用いて、単一のワームおよび16個のワームからDNAを抽出する。
  2. 野生型N2動物からシングルワームDNAの2倍、10倍、20倍、および50倍希釈液を調製する。
  3. 目的の配列に固有のプライマーとホットスタート PCR マスターミックスを使用して、メーカーのプロトコールに従って PCR 反応を設定します (表 1 および 表 2)。各反応では、1 μL の希釈されていない DNA または 2 μL の希釈 DNA を鋳型として使用します。
  4. ゲル電気泳動およびイメージング11によりPCR産物を確認する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

単一または少数の野生型成虫からのゲノムDNAを、市販のキットまたは従来の溶解プロトコールを用いて抽出し、これら2つの方法の有効性を比較した。次いで、これらの溶解物をPCRのテンプレートとして使用し、〜2,100 bpのより大きな標的( blmp−1をコードする)または〜500 bpのより小さい標的( sma−10の一部をコードする)のいずれかを増幅した。どちらの方法も、適切なPCR産物を首尾よく得た(図1A)。

次に、キット抽出されたゲノムDNAが様々なDNAポリメラーゼの鋳型として機能する能力が実証された。抽出したゲノムDNAを鋳型として、異なる能力(速度、忠実度、製品サイズを含む)を有する4つのポリメラーゼを用いて0.5kbの産物を増幅した。予想されるサイズの生成物は、単成体溶解または9成人溶解からのテンプレートを使用して、これらのポリメラーゼによって生成された(図1B)。テンプレート配列を正しく増幅するPCRポリメラーゼの...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

C. elegansの遺伝子型を決定することは、新しいC. elegans株を作成するための遺伝子交配を行う際の重要なステップです。単一または少数のC.エレガンスを用いたゲノムDNA抽出は、C.エレガンスのジェノタイピングにおける重要なステップである。このプロトコールは、市販のキットを用いたC. elegansからのゲノムDNA抽出を記載する。この方法は高速で、堅牢に機能します。この方法を使用して抽出されたゲノムDNAは、ジェノタイピング、シーケンシング、クローニングなどの下流アプリケーションに使用できます。記載されたDNA抽出方法は、DNAテンプレートの出発物質として単一および数匹のL4または成体動物を使用するC. elegans遺伝子交配のジェノタイピングに最適化されている。1匹の動物の50分の1(図1C)から3.5匹の動物(図1D)に相当するものが、PCRによって標的DNA配列を増幅するための適切な鋳型を提...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

N2株および 大腸菌 OP50細菌は、NIH研究基盤プログラム局(P40 OD010440)から資金提供を受けている Caenorhabditis Genetics Center(CGC)から入手した。 blmp-1(tm548) 株は、国立生物資源プロジェクトから入手した。著者らはWormBaseに感謝している。この研究は、NIH R01GM097591からT.L.G.、テキサス女子大学からT.L.G.への内部資金提供、およびTWUの学生研究センターからM.F.L.への資金提供によって支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オートクレーブテープディフェン43237-2
アルミホイル、ヘビーデューティーレイノルズラップ2182934
塩化カルシウムミリポアシグマ102382(CAS 10035-04-8)
Extract-N-Ampキット(組織調製液、抽出液、中和液を含む)Sigma-Aldrich Co. LLCXNAT2-1KT
Isotempホットプレート/スターラーFisher Scientific11-100-495H
LB培地、レノックス、カプセルMP Biomedicals, LLC3002-131
硫酸マグネシウム、純度97%、無水Thermo ScientificAC413485000 (CAS 7487-88-9)
微量遠心分離機Labnet International, Inc.PrismR, C2500-R
NEB Q5U ホットスタート High-Fidelity DNA ポリメラーゼNew England Biolabs, Inc.M0515S"Pol E"は、Supplemental Figure S1に使用されている高速・高忠実度ポリメラーゼ(20–30 s/kb)
NGM 培地粉末US Biological Life SciencesN1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England Biolabs, Inc.M0531S"Pol D"は、高速、高忠実度のポリメラーゼ(15–30 s/kb)
プライマーインテグレーテッドDNAテクノロジーカスタムDNAオリゴ
PrimeSTAR GXL ポリメラーゼタカラバイオ株式会社R050B「Pol C」は、GCリッチテンプレートおよび最大30 kbのテンプレート用の高忠実度ポリメラーゼ(1分/ kb)
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)ニューイングランド・バイオラボスN0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix株式会社タカラバイオRR350A「Pol A」、図1Aで使用されているポリメラーゼ、C、D、最大5 kbのターゲットに対応する高速ポリメラーゼ(10 s/kb)
Sigma ReadyMix Taq PCR反応ミックスSigma-Aldrich Co. LLCP4600図1Bの「Pol B」、最大7 kbのターゲットに対応するポリメラーゼ(1 min/kb)
SimpliAmpサーマルサイクラーApplied BiosystemsA24812
攪拌子Fisher Scientific14-512-126
ボルテックスミキサーFisher Scientific2215365
worm pickGenesee Scientific Corporation59-AWP
ブ図1Bのズ 図1Bのです 図1Bの

参考文献

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
  2. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
  3. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
  4. Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
  5. Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
  6. Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
  7. Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).
  9. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).
  12. Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).
  13. Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).
  14. Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
  15. Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
  16. Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).
  17. Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
  18. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

ゲノムDNA抽出DNA溶解PCRテンプレートプロテアーゼK法白金線ピックサーモサイクラーによる溶解組織調製線虫のジェノタイピングDNA増幅
カエノラブディティス・エレガンスゲノムDNAの小規模抽出
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。