生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。
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方法論記事
ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
腸粘膜は、無数の重要な機能を果たす複雑な物理的および生化学的障壁である。それは微生物叢との共生関係を促進し、微生物の侵入を制限しながら、栄養素および生体異物の輸送、吸収および代謝を可能にする。様々な細胞型とその物理的および生化学的環境との間の機能的相互作用は、腸組織恒常性を確立し維持するために不可欠である。これらの複雑な相互作用と統合された腸内生理学を in vitroで モデル化することは、新しい治療標的および薬物候補の発見および開発方法を変革する可能性を秘めた手ごわい目標です。
オルガノイドとオルガン・オン・ア・チップ技術が最近組み合わされ、腸生理学および病態生理学の機能的側面を インビトロで研究するのに適したヒト関連腸チップが生成されました。小腸(十二指腸)および大腸の生検に由来するオルガノイドは、臓器チップの上部区画に播種され、各腸領域の明確な細胞、分子、および機能的特徴を維持しながら、単層として正常に拡張される。ヒト腸管組織特異的微小血管内皮細胞は、オルガンチップの底部区画に組み込まれ、上皮・内皮界面を再現する。この新規プラットフォームは、栄養素、薬物、および微生物への管腔曝露を容易にし、腸内輸送、透過性、および宿主 - 微生物相互作用の研究を可能にする。
ここでは、ヒト十二指腸(十二指腸チップ)および結腸(colon chip)を表す腸チップの樹立、ならびに連続的な流れおよび蠕動運動様変形下でのそれらのその後の培養のための詳細なプロトコルが提供される。我々は、プロトタイプ誘導物質および基質を用いて十二指腸チップにおける薬物代謝およびCYP3A4誘導を評価するための方法を示す。最後に、大腸チップ内のインターフェロンガンマ(IFNγ)媒介性バリア破壊(リーキーガット症候群)の in vitro モデリングのためのステップバイステップ手順を提供し、副細胞透過性の変化、サイトカイン分泌の変化、およびチップ内の細胞のトランスクリプトームプロファイリングを評価する方法を含む。
概要
人間の腸は、自己再生が可能な複雑でマルチタスクの器官です。それは小腸と大腸に分かれています。小腸の主な機能は、胃から来る食物をさらに消化し、すべての栄養素を吸収し、残渣を大腸に渡して水と電解質を回収することです。小腸はさらに、解剖学的に異なる複数の領域(十二指腸、空腸、回腸)に分割され、それぞれが特定の機能を実行するように適応されています。例えば、十二指腸は、空腸内のタンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラルを含む栄養素の適切な吸収を可能にするために、粥(胃の内容物)の分解を助けます。小腸のこの近位部は、腸管の薬物吸収および代謝の主要な部位でもあり、回腸および結腸1におけるそれらの発現と比較して、薬物代謝酵素(例えば、CYP3A4)の発現が高いことを特徴とする。栄養素の消化吸収におけるその主な役割に加えて、腸はまた、病原性微生物、微生物代謝産物、食事性抗原、および毒素などの潜在的に有害な管腔内容物に対する効果的な障壁でもある2,3。ヒトの結腸には、栄養、代謝、および免疫に多くの利点を提供する人体の全細胞のそれをはるかに超える多数の微生物が生息していることは注目に値する。したがって、腸上皮細胞によって形成される粘膜障壁の完全性の維持は、腸内微生物叢と宿主細胞との間の共生関係を物理的に分離して不必要な免疫細胞活性化を回避することを可能にするために重要である
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プロトコル
注:すべての細胞培養物は、適切な無菌技術を使用して処理する必要があります。
この研究で採用されたヒト腸オルガノイドはジョンズホプキンス大学から入手し、すべての方法は承認されたガイドラインおよび規制に従って実施された。すべての実験プロトコールは、ジョンズホプキンス大学施設内審査委員会(IRB #NA 00038329)によって承認されました。
細胞培養試薬の調製
- 製造業者の指示(材料表)に従ってヒトオルガノイド増殖培地を調製し、100μg/mLのプリモシンで補う。
- 製造業者の指示(材料表)に従ってヒト微小血管内皮細胞増殖培地を調製し、100μg/mlのプリモシンの代わりに1:20体積/体積FBSおよび50μg/mlを補充する。
- Y-27632(Rho-キナーゼ阻害剤)をDPBS中の滅菌0.1% BSAに再懸濁し、10mMストック溶液を調製した。滅菌マイクロチューブにアリコートし、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。
- CHIR99021(GSK-3阻害剤)を滅菌ジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁し、5mMストック溶液を調製した。滅菌マイクロチューブにアリコートし、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。
- 1:1 vol/vo....
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結果
図1D は、腸チップ培養のタイムラインを要約し、チップ上に播種する前および播種時の腸内皮細胞およびオルガノイドを示す。さらに、十二指腸チップと結腸チップとの間の明確な形態学的差異を示し、十二指腸チップにおける絨毛様の形成の存在によって強調され、小腸アーキテクチャの代表である。
図3A、Bは、3つの異なるオルガノイドドナーからの十二指腸チップにおけるフォールドCYP3A4誘導応答を示す。チップを20 μM RIFまたは100 nM VD3に48時間曝露し、CYP450酵素のmRNAレベル(A)および/またはフォールド触媒活性(B)を評価するために使用した。テストステロン代謝産物のレベルの増加は、6βヒドロキシテストステロン(6β−OH−T)、RIFおよびVD3に曝露された十二指腸チップにおいて観察されたCYP3A4 mRNA遺伝子発現の上昇と一致し、試験した3人のド.......
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ディスカッション
臓器オンチップ技術と腸オルガノイドの組み合わせは、ヒトの腸内生理学および病態生理学の正確なモデリングに有望である。ここでは、マイクロ流体デバイスで共培養された生検由来小腸または結腸上皮と腸微小血管内皮細胞を含む腸チップの樹立のためのシンプルで堅牢なステップバイステッププロトコル( 図1に概説)を提供する。このチップベースのヒト腸のシミュレーションには、生理学的、内腔的、血管の流れと蠕動運動のような動きが組み込まれています。さらに、十二指腸チップの薬物代謝や結腸チップのバリア機能など、重要な腸機能を評価するための手順についても説明します。
腸内膜恒常性の維持、したがってチップ上の腸組織の正確なモデリングに不可欠な上皮 - 内皮細胞相互作用を再現するためには、PDMS膜の両側に機能的で無傷の細胞単層を確立することが重要です。チップシーディングを成功させるための第一歩は、PDMS表面とECMタンパク質との間の安定した結合の発達を可能にするPDMS表面の化学的活性化である。不適切な活性化は、細胞の付着を妨げ、不完全な細胞単分子層の.......
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開示事項
Gauri Kulkarni、Athanasia Apostolou、Lorna Ewart、Carolina Lucchesi、Magdalena Kasendraは、Emulate Inc.の現在または以前の従業員であり、株式を保有する可能性があります。Emulate Inc.は、オルガンチップデバイスを製造する会社であり、この記事に記載されている作業に関連する特許を公開しています。
謝辞
腸生検由来オルガノイドを提供してくれたMark Donowitz教授と、チップ、ポータブル、培養モジュールの科学的なイラストレーションをデザインしてくれたBrett Clairに感謝します。残りの科学イラストはすべてBioRenderを使用して生成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 小腸 ヒト腸微小血管内皮細胞 | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; 凍結保存された |
| 結腸 ヒト腸微小血管内皮細胞 | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; 凍結保存された |
| 生検由来のヒト十二指腸オルガノイド | ジョン・ホプキンス大学 | オルガノイドは、Mark Donowitz教授(Institutional Review Board Number:NA_00038329)によって提供されました。 | |
| 生検由来のヒト結腸オルガノイド | ジョン・ホプキン大学 | - | オルガノイドは、Mark Donowitz教授(Institutional Review Board Number:NA_00038329)によって提供されました。 |
| ゾウムル;CM-1&トレード; Culture Module | Emulate Inc. (英語) | - | 培養モジュール |
| Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. (英語) | - | 5%のCO2、真空ストレッチ、および電源 |
| Chip-S1™Stretchable Chip | Emulate Inc. (英語) | - | オルガンチップ |
| ポッド&貿易;ポータブルモジュール | エミュレート Inc. | ・ | ポータブルモジュール |
| UVライトボックス | エミュレート Inc. | ● | |
| チップクレードル | エミュレート 株式会社 | - | 1平方培養皿1個につき |
| Steriflip®-HV | フィルターEMDミリポア | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDFフィルター |
| スクエア細胞培養ディッシュ(120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | - |
| ハンドヘルド 掃除機 吸引器 | Corning | 4930 | - |
| 吸引 ピペット | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, ポリスチレン、個別 ラッピング |
| 吸引のヒント | - | 滅菌済み(オートクレーブ済み) | |
| 血清学的 ピペット | - | 2 mL、5 mL、 10 mL、 および 25mL 低エンドトキシン、滅菌 | |
| ピペット | P20、P200、 P1000 および標準のマルチチャンネル | ||
| ピペット ヒント | P20、P200、 および P1000です。 | ||
| コニカルチューブ (タンパク質 LoBind®チューブ) | エッペンドルフ | 0030122216; 0030122240 | 15 mL、50 mLチューブ |
| エッペンドルフ チューブ® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
| 96 wells black walled plates | - | - | 上皮透過性分析用 |
| 顕微鏡(カメラ付き) | - | - | 明視野用 イメージング |
| ウォーターバス(またはビーズ) | - | 37°に設定します。C | |
| バキュームのセットアップ | - | - | 最小 圧力: -70 kPa |
| 細胞スクレーパー | バイオチウム | 220033 | |
| T75 フラスコ | BD ファルコン | 353136 | 細胞培養フラスコ |
| エミュレート試薬-1 (ER-1) | 株式会社エミュレート | - | チップコーティング液 |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | エミュレート株式会社 | - | チップコーティング液 |
| ダルベッコのPBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| 細胞培養グレード 水 | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 細胞計数用 |
| TryplE エクスプレス | サーモフィッシャー 科学 | 12604013 | オルガノイド 解離 および内皮細胞 分遣隊 ソリューション |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher 科学 | 12634028 | 媒体 |
| カルト&貿易;オルガノイド増殖培地(ヒト) | 幹細胞技術 | 06010 | オルガノイド増殖培地 |
| 内皮細胞増殖培地 MV 2 | プロモセル | C-22121 | 内皮培地 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | シグマ | F4135 | 血清 |
| プリモシン&貿易; | InvivoGen | ANT-PM-1 | 抗菌剤 |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | フラスコ用コーティング溶液 |
| マトリゲル - 成長因子 還元 | コーニング | 356231 | 可溶化基底膜マトリックス |
| コラーゲン IV | シグマ | C5533 | ECM 成分 |
| フィブロネクチン | コーニング | 356008 | ECM 成分 |
| Y-27632 | 幹細胞技術 | 72304 | オルガノイド培地サプリメント |
| CHIR99021 | リプロセル | 04-0004-10 | オルガノイド培地サプリメント |
| 細胞回収ソリューション | コーニング | 354253 | 地下室 メブレーンマトリックス解離液 |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | シグマ | A9576 | 30%、滅菌細胞 |
| 培養グレード 水 | コーニング | MT25055CV | 滅菌、水 |
| DMSO | シグマ | D2650 | 溶剤 |
| 3KDa デキストランカスケード | ブルー Invitrogen | D7132 | 10 mg 粉末 |
| リファンピシン (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP 誘導剤 |
| テストステロン水和物 | Sigma | T1500 | CYP 基質 |
| 1,25-ジヒロキシ ビタミン D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP 誘導剤 |
| アセトニトリルと 0.1% (v/v) ギ酸 | Sigma | 159002 | LCMSストップソリューション |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% パラホルムアルデヒド (PFA) | EMS | 157-4 | 固定剤 |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| ノーマル ドンキー セラム (NDS) | Sigma | 566460 | |
| 抗オクルージン | サーモフィッシャー Scientific | 33-1500 | タイトジャンクションマーカー |
| アンチクローディン 4 | ThermoFisher 科学 | 36-4800 | タイトジャンクションマーカー |
| 抗E-カドヘリン | Abcam | ab1416 | 上皮付着ジャンクションマーカー |
| 抗VE-カドヘリン | Abcam | ab33168 | 内皮付着ジャンクションマーカー |
| 抗Zonula Occludens 1(ZO-1) | サーモフィッシャー | 339194 | タイトジャンクション |
| マーカーDAPI | サーモフィッシャー Scientific | 62248 | 核染色 |
| 2-メルカプトエタノール | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA 溶解、分離、精製キット |
| SuperScript™IV VILO™マスターミックス | Invitrogen 11756050 | 逆転写酵素キット | |
| TaqMan™Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR reagent |
| QuantStudio™ 5 リアルタイムPCRシステム | Applied Biosystems | A28573 | リアルタイムPCRサイクラー |
| 18S プライマー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Hs99999901_s1 | 真核生物 18S rRNA |
| CYP3A4 プライマー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Hs00604506_m1 | シトクローム ファミリー 3 サブファミリー Aメンバー4 |
| ス&トレード;Coomassie Plus (Bradford) アッセイキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23236 | タンパク質定量キット |
| MSD Tris溶解バッファー | メソスケール診断 | R60TX-3 | タンパク質溶解バッファー |
| 切断/全カスパーゼ-3 全細胞溶解物キット | メソスケール診断 | K15140Dカスパーゼ3検出キット | |
| V-PLEX 血管損傷パネル2 ヒトキット | メソスケール診断 | K15198D | |
| V-PLEX ヒト炎症誘発性パネル II (4-PLEX) | メソスケール診断 | K15053D | |
| ツァイス LSM 880 | ツァイス | - | 共焦点顕微鏡 |
| ツァイス LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | ツァイス | - | 20X 長距離対物レンズ |
| ツァイス AXIOvert.A1 | ツァイス | - | 明視野顕微鏡 |
| ツァイス LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss-10X対物レンズ |
参考文献
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
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