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方法論記事

エンテロイド由来単分子膜を用いた早産小腸障害および治癒の in vitro モデルに対するヒアルロン酸35 kDaの効果

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DOI：

10.3791/63758

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2022年7月28日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、非ヒト霊長類回腸から単離された3次元(3D)エンテロイドに由来する2次元(2D)単層上で引っかき傷アッセイを確立して実行する方法を記載する。

要約

in vitro 引っ掻き傷創傷アッセイは、さまざまな組織タイプにおける上皮治癒のメカニズムと特性を調査するために一般的に使用されます。ここでは、回腸末端の腸管陰窩に由来する3次元(3D)非ヒト霊長類エンテロイドから2次元(2D)単層を生成するプロトコルを記載する。次に、これらのエンテロイド由来の単分子膜を in vitro スクラッチ創傷アッセイで利用して、母乳HA模倣体であるヒアルロナン35 kDa(HA35)が上皮創傷縁に沿った細胞移動と増殖を促進する能力をテストしました。単層をコンフルエントに成長させた後、手動で引っ掻き、HA35(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)またはコントロール(PBS)で処理しました。ギャップへの細胞移動および増殖は、生細胞イメージング用に装備された透過光顕微鏡を用いてイメージングした。創傷閉鎖は、ImageJの創傷治癒サイズプラグインを使用して創傷治癒率として定量化された。スクラッチ領域および細胞移動速度および創傷閉鎖の割合を24時間にわたって測定した。 in vitro でのHA35は、おそらく創傷端での細胞増殖および創傷領域への移動の組み合わせを通じて、小腸腸単層の創傷治癒を促進する。これらの方法は、早産のヒト小腸における腸管再生を探索するためのモデルとして潜在的に使用することができる。

概要

壊死性腸炎(NEC)は、早産児の最も一般的な胃腸緊急事態の1つです1。この疾患は、腸壊死、敗血症、および潜在的に死に至る可能性のある重度の腸の炎症を特徴としています。病因は不明ですが、証拠はNECが多因子性であり、摂食、異常な細菌コロニー形成、および未熟な腸上皮の複雑な相互作用の結果であることを示唆しています2,3。早産児は、腸透過性の増加、異常な細菌コロニー形成、および低い腸細胞再生能力4,5を有し、腸管バリア機能障害、細菌転座、およびNEC発症のリスクを高めます。したがって、腸上皮の成熟を促進し、腸上皮の再生または治癒を促進するための戦略または介入を特定することは、この致命的な病気を予防する上で重要です。

研究によると、母乳(HM)は早産児のNECに対して保護的であることが示されています6、7、8、9、10、11。ヒトと動物の両方の研究は、ウシベースの処方が腸透過性を増加させ、腸上皮細胞に直接毒性があることを示しました2,12。完全には解明されていませんが、HMの保護効果は、ラクトフェリン、免疫グロブリンA(IgA)、HMオリゴ糖などの生理活性成分を介して媒介されることを示唆する証拠があります13。HMはまた、D-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミン二糖を繰り返す独特の非硫酸化グリコサミノグリカンであるヒアルロナン(HA)も豊富です14,15。重要なことに、マウスNEC様腸損傷モデルにおいて、HM HA模倣体である経口35 kDaHA(HA35)が腸損傷の重症度を減弱させ、細菌の転座を防ぎ、死亡率を低下させることを示した16,17。

ここでは、in vitroでの腸の治癒と再生に対するHA35の効果をさらに調査します。現在、腸の創傷および修復のために最も広く使用されているin vitroアッセイは、結腸直腸癌(CRC)細胞単層において行われる引っかき傷アッセイである。CRC細胞の創傷修復は、幹細胞駆動の修復プロセスではなく、癌細胞の高度に増殖する性質に大きく依存しているため、早産児腸に対するそのようなモデルの生理学的関連性は限られています18。この制限を克服するために、早産の非ヒト霊長類(NHP)から初代幹細胞由来の小腸エンテロイドを単離および維持する手順を含む、2D腸介スクラッチ創傷モデルの確立をここで説明する。早産NECが遠位小腸で最も頻繁に報告されていることを考えると、腸の損傷と修復のモデルにおける初代上皮細胞オルガノイドの使用は、従来の結腸直腸単分子膜を利用する既存のモデルと比較して、より生理学的に翻訳可能なin vitroモデルを提供します18,19。

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プロトコル

この研究のすべての動物の手順は、オクラホマ大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。施設の承認に続いて、早産の非ヒト霊長類(NHP、妊娠90%、オリーブヒヒ、 パピオアヌビス)からの胎児小腸便宜サンプルが、別の研究のために安楽死後に取得されました(プロトコル#101523-16-039-I)20。

1. 早産非ヒト霊長類3次元腸管エンテロイドの樹立

  1. メディアの準備
    注:培地は、標準的な無菌技術に従って、陰窩分離の1週間前までに調製できます。ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度1%)は、必要に応じて、初代細胞用の広域スペクトル抗生物質の代わりに使用できます。
    1. ヒトオルガノイド増殖培地+ Y-27632(HOGMY)を調製し、50 mLのオルガノイド増殖培地とヒト基礎培地50 mLを混合します(材料の表)。200 μLの広域抗生物質(最終濃度100 μg/mL)(材料表)とY-27632(最終濃度10 μMまで)を加えます。ベンチトップで室温まで温めます。
    2. 50 mLのオルガノイド増殖培地とヒト基礎培地50 mLのオルガノイドサプリメントを混合することにより、ヒトオルガノイド増殖培地(HOGM)を調製します。200 μLの広域抗生物質(100 μg/mL)を追加します。ベンチトップで室温まで温めます。
      注意: HOGMは、通過後最初の2〜3日を超えてメディアを交換する場合に使用されます。
    3. カルシウムまたはマグネシウムを含まない1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)100 mLを氷冷するまで冷やします。
    4. カルシウムまたはマグネシウムを含まない1x PBSと0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を組み合わせて、50 mLの洗浄バッファーを調製します。氷が冷えるまで冷やします。
    5. 500 mLのDMEM/F12(ダルベッコ改変イーグル培地/栄養ハム混合物F12 + 15 mM HEPESバッファー)に1 mLの広域抗生物質(100 μg/mL)を加えて、DMEM-F12洗浄バッファーを調製します。氷冷に保ちます。
  2. クリプト分離とメッキ
    注:細胞外マトリックス(ECM)ベースのヒドロゲルは、手順全体を通して氷上に残しておく必要があります。この手順は、6つのECMベースのヒドロゲルドームに留置するのに十分な組織を想定しています。異なる密度の陰窩が収穫された場合は、それに応じてドーム番号を変更する必要があります。
    1. 150 μLの成長因子還元(GFR)基底膜抽出物(BME)(フェノールレッドフリー)を2〜8°Cの氷上で一晩解凍します。
    2. 24ウェル平底組織培養処理ポリスチレンプレートをインキュベーター内で37°C、5%CO2 で最低30分間インキュベートします。
    3. NHP安楽死と組織採取に続いて、使い捨てペトリ皿で氷冷した1x PBSを使用して、1,000 μLのピペットチップで回腸部の破片を洗い流します。
      注:健康なエンテロイドを収穫するには、新鮮な組織を迅速に採取し、氷冷に保つ必要があります。
    4. 回腸を腸全体に沿って縦方向に切断し、氷冷PBSで3回洗浄します。チューブに最も近い回腸セグメントの部分から始めて、15 mLの氷冷PBSを含む50 mLのコニカルチューブ上で滅菌ハサミで組織を小さな断片(長さ約2 mm)にミンチします。
    5. 10 mLの血清学的ピペットを使用して、5〜10倍上下にピペッティングして陰窩を破壊します。組織セグメントをチューブの底に沈降させてから、上清を取り除き、新鮮で氷のように冷たいPBSと交換します。上清が透明で破片がなくなるまで、このプロセスを最低7x〜10x繰り返します。
    6. 透明になったら、上清を取り除き、陰窩を25 mLの細胞解離試薬に再懸濁します。チューブを20rpmのロッキングプラットフォームに室温で15分間置きます。
    7. ロッカーからチューブを取り外し、細胞を約30秒から1分間沈降させ、上清を取り除きます。10 mLの氷冷洗浄バッファーを追加します。p1000ピペットで上下にピペットし、さらに単一の陰窩に解離します。
    8. 組織を70 μmのセルストレーナーを通して新しい50 mLコニカルチューブにろ過します。元の50 mLコニカルチューブを10 mLの氷冷洗浄バッファーですすぎ、70 μmストレーナーでろ過して、すべての陰窩が元のチューブから除去されていることを確認します。この組織の洗浄を合計4回繰り返します。
    9. ろ液を300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。600 μLのHOGMYを加え、200 μLのピペットで上下にピペッティングしてペレットを破壊します。溶液が氷のように冷えるまでチューブを氷の上に置きます。
      注意: 溶液が氷冷でない場合、ドームはメッキ時に適切な構造を維持しません。ECMベースのヒドロゲルドームをピペッティングするときは、気泡がプレート底部への適切な付着を妨げるため、気泡の導入は避けてください。
    10. 600 μLの氷冷ECMベースのヒドロゲルを加えてセルペレットを懸濁し、200 μLのピペットでよく混ぜます。
    11. インキュベーターから24ウェルプレートを取り出し、37°Cプレートウォーマーの上に置きます。氷冷したHOGMY/ECMベースのヒドロゲル混合物50 μLを、24ウェル培養プレートの24ウェルの中央にピペットで入れます(ドームあたり50 μL)。
    12. メッキしたら、ドームを37°Cのプレートウォーマーに1分間置き、プレートの底に密着させます。プレートを慎重に反転させ、プレートの底に結露が蓄積していないことを確認し、反転プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。
    13. 15分後、プレートを裏返し、750 μLの室温HOGMYを各ウェルにピペットで入れます。
      注:新しく形成された3D ECMベースのヒドロゲルドームを破壊しないように注意しながら、培地をウェルの側壁にゆっくりとピペットで入れます。
    14. すべてのウェルが培地で満たされたら、プレートをインキュベーターに入れ、750 μLのHOGMで3日ごとに培地を交換します。7〜10日ごとにエンテロイドを通過します。
  3. 腸腸継代
    注:以下のプロトコルは、NHPエンテロイドを1:2の分割速度で含む1枚の24ウェル培養プレート用です。
    1. エンテロイドを含むECMドームを破壊しないように注意しながら、各ウェルからエンテロイド培地を除去し、1,000 μLのピペットを使用して500 μLの氷冷細胞解離試薬を各ウェルに加え、室温で1分間インキュベートします。
    2. 8〜12倍にピペッティングしてECMを手動で中断します。12ウェルの内容物を1本の15 mLコニカルチューブに移します。
    3. 24ウェル培養プレートからすべての溶液を回収したら、250 μLの細胞破壊試薬を各ウェルに追加して、すべてのNHPエンテロイドが各ウェルから除去されたことを確認し、この最後のすすぎを既存の15 mLコニカルチューブに追加します。
    4. 室温(20°C)で15分間、40rpmのロッキングプラットフォームに置きます。または、チューブを室温で15分間手動で振ってください。
    5. 15分後、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットだけが残るまで、15 mLチューブから上清を取り除きます。
    6. 8 mLの氷冷DMEM +広域抗生物質を1本の15 mLコニカルチューブに加え、ペレットが十分に破壊されていることを確認します。300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    7. 600 μLのHOGMYを加え、1,000 μLのピペットで上下にピペッティングしてペレットを破壊します。溶液が氷のように冷えるまでチューブを氷の上に置きます。溶液が氷冷になったら、600 μLの氷冷ECMを加えて細胞ペレットを懸濁し、1,000 μLのピペットでよく混ぜます。手順 1.3.2.-1.3.7 を繰り返します。残りの12ウェル用。
      1. 残りの手順については、手順 1.2.11.-1.2.16 を参照してください。

2. 腸状単分子膜および引っかき傷アッセイの確立

  1. 培地と治療の準備
    1. カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBS5mLを氷冷するまで冷やします。
    2. 500 mLのDMEM/F12(ダルベッコ改変イーグル培地/栄養ハム混合物F12 + 15 mM HEPESバッファー)に1 mLの広域抗生物質(100 μg/mL)を加えて、DMEM-F12洗浄バッファーを調製します。氷冷に保ちます。
    3. 手順1.1.1で説明されているように、100 mLのHOGMYを準備し、ベンチトップで室温まで温めます。
    4. 25 mLの0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を37°Cの水浴中で温めます。
    5. カルシウムまたはマグネシウムを溶媒として使用しない滅菌PBSを使用して、細胞処理用に50 μg/mL、100 μg/mL、および200 μg/mLの濃度のHA35を調製します。HA35の最終希釈では、溶媒としてHOMGYを使用します。
      注:HA35は5 mg / mLを超える濃度で溶液から出てくることが多いため、HA35製剤にはいくつかの希釈が必要になる場合があります。
  2. 腸状単分子膜形成
    注:次の手順では、腸状単層の24ウェルプレートを1枚生成するのに十分な容量が得られます。必要な単層数に合わせて音量を調整します。
    1. 96 μLのECMベースのヒドロゲルBME(フェノールレッドフリー)を氷上で2〜8°Cで一晩解凍します。 ECMベースのヒドロゲルをカルシウムまたはマグネシウムを含まない氷冷PBSで1:50の比率で希釈します。24ウェル組織培養プレートの各ウェルに、200 μLの氷冷希釈ECMベースのヒドロゲルをコーティングします。
    2. ECMベースのヒドロゲルコーティングプレートを37°Cおよび5%CO2で最低1時間インキュベートします。単層用の3Dエンテロイドを含む24ウェル培養プレートから培地を吸引し、500 μLの細胞解離試薬/ウェルと交換します。
    3. ECMベースのヒドロゲルドームを8x〜12xピペッティングして手動で破壊し、12ウェルの内容物を15 mLのコニカルチューブに移します。
    4. 12個の空のウェルを250 μLの細胞解離試薬で洗浄し、すべてのエンテロイドが除去されたことを確認し、内容物を15 mLのコニカルチューブに移します。手順 2.2.5 を繰り返します。およびステップ 2.2.6.残りの12ウェルについては、第2の15mLコニカルチューブを使用した。
    5. コニカルチューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。10 mLの氷冷DMEM-F12洗浄バッファーを15 mLコニカルチューブに加え、チューブを反転させて腸内ペレットを懸濁します。300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    6. 上清を除去し、細胞ペレットを12 mLの37°Cトリプシン-EDTAに再懸濁した。チューブを37°Cの水浴に10分間、または細胞が溶解するまで入れます。3 mLのDMEM-F12洗浄バッファーを各チューブに加えてトリプシン-EDTAを希釈し、チューブを反転させて混合し、氷上に置きます。
    7. 解離したエンテロイドを37 μMメッシュのセルストレーナーでろ過し、内容物をきれいな15 mLコニカルチューブに集めます。チューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    8. 細胞が遠心分離機でペレット化している間に、ECMベースのヒドロゲルコーティングされたプレートをインキュベーターから取り出し、コーティングされた表面を傷つけたり、プレートを完全に乾燥させたりすることなく、余分なECMベースのヒドロゲル溶液を吸引します。
    9. コニカルチューブから上清を取り除き、細胞ペレットを6 mLのHOMGYで再懸濁します。合わせた12 mL HOMGY細胞懸濁液を、ECMベースのヒドロゲルでコーティングした24ウェルプレートの各ウェルに、約3 x 105 細胞/ウェルの播種密度で500 μL加えます。蓋をしてプレートを回転させ、ウェル内の細胞が均一に分布するようにします。
    10. プレートを37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、 単層が>90%コンフルエントに達するまで2日ごとにHOMGY培地を交換します。
  3. 単層治療と引っかき傷アッセイ
    1. 単層が>90%のコンフルエントに達したら、培地を吸引して、付着していない細胞を除去します。細胞を500 μLのHA35(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)またはPBSで24時間処理します。
    2. 24時間後、単層の表面を乱さないように注意しながら、メディアを取り外します。200 μLのピペットチップを使用して、単層が乾かないように注意しながら、各ウェルの単層の全面直径全体に直線状の引っかき傷を作ります。
    3. 傷のある単層を500 μLの1x PBSで1回洗浄します。HOMGYに溶解したHA35(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)またはPBSを500 μL加え、プレートを37°Cおよび5%CO2インキュベーター内の生細胞分析装置(材料表)に移します。
    4. 生細胞解析ソフトウェア(材料表)のスケジュールアイコンの下で、新しい船舶の追加ウィザードの起動アイコンをクリックし、スケジュールに従ってスキャンするスキャン頻度を設定します。スキャンタイプで新しいホールウェル容器を作成し、スキャン設定(つまり、画像チャンネルのフェーズと対物レンズの4倍)を指定して、[次へ]をクリックします。
    5. 表示されたリストからプレートの製造元とカタログ番号を選択します。 [スケジュール] アイコンの下で、生細胞分析装置内でプレートを配置するプラス記号を選択します。目的の スキャンパターンを選択し、プレートレイアウトページで「+」を選択してプレートマップを作成します。 分析を後で延期するを選択し、4時間ごとに24時間スキャン スケジュール を設定し、 船舶ウィザードの概要 ページで取得設定を確認します。最後に、[スケジュールに追加] を選択します。
    6. 24アッセイが完了したら、 Viewアイコンの下で容器 名をダブルクリックし、画像と動画をエクスポートします。ウェルと一連の画像を選択して表示し、JPEG として書き出します。ステップ2.4に従って、ImageJ21の創傷治癒サイズプラグインを使用して、創傷治癒率について画像を分析します。以下に。
  4. 引っかき傷解析
    1. ImageJソフトウェアを開きます。引っ掻き傷アッセイ画像をアップロードします(.TIFF または .JPG)。
    2. 画像を 24 ビット RGB から 8 ビットに変更するには 、[イメージ>タイプ] > [8 ビット ] を選択します。 [プラグイン] > [マクロ] >を選択して [創傷治癒サイズプラグインをインストールする] を選択して>創傷治癒サイズプラグインをインストールします。
    3. スクラッチが垂直になるように画像を回転させ、創傷治癒サイズツールプラグインを初期化します。
    4. ダイアログボックスでプラグインパラメータを選択して、傷傷に最もフィットします。創傷治癒サイズオプションのパラメータの値を次のように設定します:分散ウィンドウ半径を20、「しきい値」を100、「飽和ピクセルの割合」を0.001に設定し、「スケールグローバルを設定」で「はい」を選択します。[OK]ボタンをクリックして選択を確定します。選択した領域が創傷領域であるかどうかを確認します。上記のパラメータは、ラボ間で標準化が必要な場合があります。
    5. 手順 2.4.2.-2.4.4 を繰り返します。各スクラッチの残りの時間ポイント。
    6. 以下のように、24時間にわたる遊走または増殖細胞の創傷治癒の引っかき傷領域創傷治癒の割合を計算する:
      %創傷治癒= figure-protocol-1
      ここで、T 0 = 時間 0 時間の面積 %、および Tc = 0 時間、4 時間、12 時間、または 24 時間の面積の割合。

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結果

さまざまな組織や臓器の組織修復と創傷治癒に対するHAの影響は十分に文書化されています。ただし、胎児または新生児の小腸の治癒と再生に対する分子量35 kDaのHAの具体的な影響は現在不明です。.胎児または新生児の小腸のモデルでHA35が創傷治癒を促進する能力をテストするために、NHP回腸組織から3D腸管エンテロイドを生成し、さらにこの組織を単一細胞に解離させて2Dエンテロイド由来の単分子膜を作成しました(図1A、B)。単層をコンフルエントに成長させ、P200ピペットチップを使用して手動で引っ掻きました(図1B、C)。次に、単層をHA35(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)またはコントロール(PBS)で処理しました。間隙への細胞遊走および増殖は、生細胞イメージング用に装備された透過光顕微鏡を用いて、合計24時間にわたって4時間毎に画像化された22。細胞遊走速度の尺度である創傷閉鎖速度を...

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ディスカッション

早産児の胃腸管は、嚥下障害、炎症性細菌代謝物および毒素、および断続的低酸素症に関連する環境侮辱への繰り返し曝露による継続的な再生圧力下にあります23,24。残念ながら、早産児の腸上皮は機能的完全性を迅速に確立することができず23、バリア機能障害、腸透過性の増加、そして重症の場合、横行する腸の炎症とNECの発症をもたらします。

グリコサミノグリカン(GAG)は、母乳に多く見られる多糖類の一種であり、NEC15,16の発症から保護する可能性のある生理活性因子です。HAは、ヒアルロン酸合成酵素によって産生されるグルクロン酸とN-アセチルグルコサミン25,26の繰り返し二糖類の直鎖状ポリマーです...

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開示事項

著者は開示するものはなく、利益相反もありません。

謝辞

この内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。HCは、国立衛生研究所からの助成金P20GM134973によってサポートされています。KBは、小児病院財団(CHF)と長老派健康財団(PHF)の助成金によってサポートされています。Cancer Functional Genomicsコアが提供する生細胞イメージングサービスは、オクラホマ大学健康科学センタースティーブンソンがんセンターに授与された国立総合医学研究所の助成金P20GM103639および国立がん研究所の助成金P30CA225520によって部分的にサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 mL Serological PipetFisher Scientific13-675-49
100x21mm ディッシュ、Nunclon DeltaThermoFisher Scientific172931
15 mL コニカルチューブVWR89039-666
24-well, TC-Treated, Flat Bottom PlateCorning3524
37 & micro;M 可逆細胞ストレーナーSTEMCELL Technologies27215
50 mL コニカルチューブVWR89039-658
70 µm 滅菌細胞ストレーナーフィッシャーサイエンティフィックFB22-363-548
アルブミン、ウシ (BSA)VWR0332-100G
CellTiter-Glo 3D 細胞生存率アッセイPromegaG9681
ダルベッコの改良イーグルス培地/栄養ハムの混合物 F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES バッファーSTEMCELL Technologies36254
ジェントルセル セル解離試薬STEMCELL Technologies100-0485
ImageJNIHimagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis InstrumentSartorius4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software ModuleSartorius9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010これはHOGMYですが、Y-27632や抗生物質は含まれていません。HOGMのベースとしても使用されますが、抗生物質が不足しているだけです。
大腸菌O111:B4由来のリポ多糖類、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製Millipore SigmaL3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-FreeCorning356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermoFisher Scientific136101
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、1X [-]カルシウム、マグネシウム、pH 7.4コーニング21-040-CM
プリモシンInvivogenant-pm-1これは広域抗生物質です
ヒアルロン酸ナトリウム、研究グレード、HA20KLifecore BiomedicalHA20K-1
TC20 自動セルカウンター会社: バイオ・ラッド1450102
トリプシン-EDTA 1X、0.25% トリプシンフィッシャーサイエンティフィックMT25053CI
Y-27632STEMCELLテクノロジーズ72302

参考文献

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