ヒト精子の機能異常を検出するためのバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

サマリー

本プロトコルは、単一のサイトメーターでヒト精子のアポトーシス、ミトコンドリア膜電位、およびDNA損傷の測定を可能にする実用的なソリューションを提供します。

要約

従来の精液パラメータ分析は、男性の生殖能力を評価するために広く使用されています。しかし、研究によると、不妊症患者の~15%は、従来の精液パラメータに異常を示さないことがわかっています。特発性不妊症を説明し、微妙な精子の欠陥を検出するには、追加の技術が必要です。現在、精子のアポトーシス、ミトコンドリア膜電位(MMP)、DNA損傷などの精子機能のバイオマーカーは、精子の生理機能を分子レベルで明らかにし、男性の生殖能力を予測することができます。

フローサイトメトリー(FCM)技術では、ヒト精液サンプルでこれらのマーカーを迅速、正確、正確に測定できますが、すべてのバイオマーカーを1台のサイトメーターで検査する必要がある場合、時間コストが大幅に増加し、結果が妨げられる可能性があります。このプロトコルでは、液化のために37°Cで収集および即時インキュベートした後、精液サンプルは、アネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)/ヨウ化プロピジウム(PI)染色を使用して精子のアポトーシスについてさらに分析されました。MMPを5,5',6,6'-テトラクロロ-1,1',3,3'-テトラエチル-ベンズイミダゾリルカルボシアニンヨウ化物(JC-1)プローブで標識し、アクリジンオレンジ(AO)染色による精子クロマチン構造アッセイ(SCSA)を用いてDNA損傷を評価しました。したがって、精子機能マーカーのフローサイトメトリー解析は、不妊症の診断とベンチとベッドの両方での精子機能の評価のための実用的で信頼性の高いツールキットとなり得ます。

概要

不妊症は公衆衛生上の問題となっており、男性不妊症は全症例の40%〜50%を占めています^1,2。従来の精液の質分析は、男性の生殖能力を決定する上で重要な役割を果たしますが、不妊症患者の約15%は、精子数、運動性、形態などの精子パラメータが正常です³。さらに、定期的な精子検査は再現性が低く、精子機能に関する情報が限られており、男性の生殖能力を正確に評価したり、精子の微妙な欠陥を反映したりすることができません。精子機能をテストするために、ヘミゾナアッセイ(HZA)、精子浸透アッセイ、低浸透圧腫脹試験、抗精子抗体検査など、複数の技術が開発されていますが、これらの方法は時間がかかり、オペレーターの主観的な影響を受けやすいです。そのため、精子機能解析のための迅速かつ正確な手法の開発が必要です。

FCMは、1970年代に開発された高速シングルセル解析技術で、細胞生物学や医学の様々な分野で広く利用されています。FCMは、特異的蛍光プローブで標識された精子を解析する精子機能評価のための堅牢なツール^である4。精子はシングルチャンネルまたはマルチチャンネルのレーザーを通過し、レーザービームによって散乱光と放出された蛍光が生成されます。散乱光には、前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)があり、テストされたセルのサイズとセルの粒度または内部構造を反映します。これらの信号は、コンピュータシステムによって収集、表示、分析され、その結果、精子からの一連の特性が迅速かつ正確に測定されます。したがって、FCMは、精子分析の分野でますます注目を集めている、迅速で客観的、多次元、およびハイスループットの手法です。FCMの適用は、従来の方法の欠点を補うことができ、精子の内部構造と機能を検出するための新しいアプローチを提供します。

精子のアポトーシスは男性の生殖能力と密接に関連しています⁵.精子のアポトーシスの検出は、精子の機能を分子レベルで評価するための重要な指標です。FCMは、アネキシンV-FITC/PI染色を用いて精子のアポトーシスを検出するための信頼性が高く高感度な方法として広く認識されています。基本原理は、ホスファチジルセリン(PS)がアポトーシスの初期段階で細胞膜の内層からその外層に移動することです。アネキシンVは、PSに対して高い親和性を有する^Ca2+依存性リン脂質タンパク質(通常FITCによって標識される)であり、したがって、細胞膜の外表面に露出したPS^{を検出する6。}壊死とアポトーシスは、Pl染色と組み合わせて区別できます。したがって、アネキシンV-FITC/PI二重染色の方法は、異なるアポトーシス精子細胞を迅速、シンプル、かつ簡単に検出できるため、広く使用されています。

成熟した哺乳類の精子には約72〜80個のミトコンドリア⁷が含まれており、精子のミトコン^ドリア8が保持される生物学的理由が示唆されている。精子のミトコンドリアは、精子の運動性と生殖能力の維持に重要な役割を果たすことがわかっています⁹。JC-1染色は、様々な細胞タイプでMMPの指標として使用でき、精子のミトコンドリア活性評価に最もよく使用される蛍光色素の1つである¹⁰。JC-1は、ミトコンドリアに電位依存的に蓄積するカチオン性色素です。JC-1は525 nm(緑)で最大蛍光を発し、高電位(ΔΨm、80-100 mV)の膜に結合するとJ凝集体¹¹を形成し、蛍光発光が~590 nm(橙赤)にシフトします。その結果、精子のミトコンドリアの脱分極は赤/緑の蛍光強度比の低下によって示され、FCMを使用してヒト精液サンプル中のMMPレベルを検出できます。

SCSA法は、Evensonらによって発明され¹²、1,024×1,024チャンネルスケールで独自のデュアルパラメータデータ(赤色蛍光と緑色蛍光)を使用した正確で再現性のあるテストと見なされています¹³。損傷した精子では、精子核のDNAと変化したタンパク質がAOによって標識され、DNA鎖の切断は赤色蛍光によって測定され、無傷の二本鎖はFCMで緑色の蛍光を発します¹⁴。今日では、精子DNAの完全性を推定するために多くの方法が開発されています。しかし、SCSAとは異なり、これらのアッセイはしばしば労働集約的であり、男性不妊症を診断する能力に欠けています。SCSA検査の結果は、ヒトのDNA妊娠および流産と有意に相関しており、SCSAがヒト精液分析に有用である可能性があるという説得力のある証拠を提供し、不妊症の臨床医にとって貴重なツールとして役立つ可能性があります¹⁵。

クロマチンの完全性、MMP、およびアポトーシスは、精子機能のさまざまな側面を反映しているため、これらのバイオマーカーの組み合わせにより、精子の状態に関するより包括的な洞察が得られる可能性があります。FCMは、ヒト精液検体中のクロマチン完全性、MMP、またはアポトーシスのいずれかを個別に測定するために使用できます。FCMの費用と染料のコストは、リプロダクティブヘルスのための臨床検査室でのこれらの技術の幅広い適用を制限してきましたが、繁殖力推定のためのそれらの価値は受け入れられています。

しかし、いずれの実験も精子サンプルの前処理が必要であり、前処理したサンプルはできるだけ早く検査する必要があるため、1つのFCMで3つのバイオマーカーを同時に測定すると、一部の実験の待ち時間が長くなり、結果の信頼性が損なわれる可能性があります。これは、3つの実験すべてを考慮してプロトコルが適切に配置されていない場合、待機プロセス中に精子が追加の損傷を受けるためです。この論文では、長い待ち時間によって引き起こされる実験品質を大幅に損なうことなく、1回のサイトメトリーで3つのバイオマーカーすべてを流暢に測定することを実現するプロトコルを提示します。

プロトコル

注:フローサイトメトリーによる精子機能障害のバイオマーカー検出のワークフローには、(1)細胞調製、(2)蛍光試薬による染色、(3)フローサイトメトリー解析およびデータ解釈が含まれます(図1)。プロトコルは、陸軍医科大学の倫理委員会のガイドライン(1.0 / 2013.4-12)に従います。

1. 細胞調製

1. プラスチック製の臨床検体瓶での自慰行為により、できれば3〜5日間の禁欲後にヒト精液サンプルを入手します。
2. 精液サンプルを直ちに37°Cのインキュベーターでインキュベートし、サンプルを完全に液化します(最大1時間)。

2. コンピュータ支援精子分析(CASA)を用いて精子細胞を計数

1. 液化した精液サンプルを完全に混合します。
2. 精液計数室に精液10μLを加えます( 材料表を参照)。
3. 精子クラスアナライザー( 材料表を参照)でスライドをスキャンし、精子濃度を推定するために、少なくとも6つの領域と400の精子を数えます。
   注:精子のアポトーシスおよびMMP分析のために、精液サンプルは凍結ではなく新鮮でなければなりません。

3. 精子細胞の染色

1. アネキシンV-FITC/PI染色による精子アポトーシスの検出
   1. 1.5mLの遠心チューブに1×10個の⁶ 個の精子細胞を加えます。
   2. 細胞を500 μLの低温リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
   3. 精子細胞懸濁液を300× g で7分間遠心分離し、上清を捨てる。
   4. 精子細胞を200 μLの1x Binding Bufferに再懸濁します。
   5. 2 μL の FITC アネキシン V と 2 μL の PI を添加します( 材料表を参照)。
   6. 細胞を穏やかにボルテックスし、暗所で室温(25°C)で15分間インキュベートし、すぐにフローサイトメーターに入れて分析します。
2. JC-1プローブを用いたミトコンドリア膜電位の解析
   1. 2×10⁶ 個の精子細胞を1.5mLの遠心チューブに加え、600× g で5分間遠心分離します。
   2. 精子細胞懸濁液を1 mLのJC-1ワーキング溶液に再懸濁します( 材料表を参照)。
   3. 細胞を穏やかにボルテックスし、暗所で37°Cで20分間インキュベートします。
   4. 懸濁液を600 × g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
   5. ペレットを1mLのPBSで600× g の速度で5分間ずつ2回洗浄します。
   6. 染色した精子細胞をフローサイトメーターチューブ内のPBS1 mLに再懸濁し、チューブをすぐにフローサイトメーターに入れて分析します。
   7. シアン化カルボニル m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)をポジティブコントロールとして使用します。精子細胞(ステップ3.2.1で前述)を1 mLのCCCPワーキング溶液( 材料表を参照)に再懸濁し、細胞を静かにボルテックスし、室温で20分間インキュベートします。懸濁液を600 × g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。手順3.2.2-3.2.6を繰り返します。
3. 精子クロマチン構造アッセイ
   1. 液化生精液(0.25 mL)のアリコートをクライオチューブに入れ、SCSAの準備ができるまで精液サンプルを液体窒素(-196°C)で直ちに凍結します。
   2. 精液サンプルを37°Cのウォーターバスで解凍し、TNEバッファー( 材料表を参照)で1〜2〜10⁶ 細胞/ mLの濃度×希釈します。
   3. 希釈したサンプル200 μLをフローサイトメーターの試験管に加え、400 μLの酸溶液( 材料表を参照)と30秒間混合します。
   4. サンプルを1.2 mLのAO染色溶液( 材料表を参照)で染色し、すぐにフローサイトメーターに入れて分析します。
   5. リファレンスサンプルを内部標準として使用して、フローサイトメーターのセットアップとキャリブレーションを行います。レファレンスサンプルを4°CのTNE緩衝液で1-2×10⁶ 細胞/mLの濃度に希釈します。手順3.3.1-3.3.4を繰り返します。
      注:すべての溶液と緩衝液は4°Cで保存されています。 (1)急速凍結する前に精液を希釈しないでください。生精液サンプルは、フローサイトメトリー測定時にTNEバッファーで解凍および希釈する必要があります。(2)不妊治療クリニックの場合、~0.25 mLの生精液を超低温冷凍庫またはLN2タンクで急速冷凍する必要があります。これらの冷凍アリコートは、ドライアイスまたはLN2ドライシッパーでSCSA診断ラボに送ることができます。(3)DNA完全性の不均一性を示すヒト射精サンプル(例:15%DNA断片化指数[DFI])を内部標準リファレンスとして使用しました。

4. フローサイトメーターのセットアップ

注:フローサイトメーターを起動する前に、分析性能を検証するために装置のシステムチェックを行う必要があります。すべてのチェックが完了し、合格した後、サンプルを実行します。

1. フローサイトメーターソフトウェアを開き、サイトメーターを起動します。
2. サンプル データを収集します。
   1. まず、コントロールサンプルをフローサイトメーターにロードし、RUNをクリックしてデータ収集を開始します(必要に応じて設定を調整します)。装置がサンプルの吸引を開始し、検出されたイベントのリアルタイムプレビューを提供するのを待ちます。
      注:対照サンプル:精子アポトーシスのネガティブコントロール(未染色精子細胞)。MMPのポジティブコントロール(CCCP処理細胞)。SCSA の参照サンプル。
   2. データを表示するためのドットプロットを作成し、x/y軸のパラメータ(FSC、SSCなど)と線形を選択してデータを指定します。多角形ゲートを選択して適用し、分析のために精子集団を描写し、機器がリアルタイムで検出されたイベントをプロットできるようにします。
   3. 領域内の精子イベントを分析します。
      1. 精子のアポトーシスの場合、FL1をx軸、FL2をx軸に設定します。生細胞、アポトーシス細胞、または壊死細胞を単離するには、象限ゲートをタップしてドラッグし、精子集団を 4 つの特定の集団にサブセット化します。
      2. MMP の場合、FL1 を x 軸、FL2 を y 軸として設定します。多角形ゲートを作成して、精子の集団を 2 つの特定の集団にサブセット化します。
      3. SCSAの場合、FL4をx軸(赤色蛍光、125/1,024フローサイトメトリーチャンネル)として設定し、FL1をy軸(緑色蛍光、475/1,024フローサイトメトリーチャンネル)として設定します。ゲートを45°の角度で描画して、細胞デブリのシグナルを排除します。
   4. データの収集を停止するタイミングを示す実行制限を設定します。精子アポトーシス、MMP、およびSCSA分析のために、各サンプルに対して合計10,000個の精子細胞を計算します。
   5. セル数に応じて、流路系レート(低速、中速、高速、またはカスタム流路系レート)を設定します。
      注:SCSA分析の場合、精子濃度を決定するには、凍結生サンプルを解凍し、FCMで実行します。流量が>250/sの場合は、サンプルを正しい流量に希釈します。すべてのサンプルを個別に 2 回測定し、平均値を計算します。10〜15サンプルごとに測定したときに参照サンプルをテストして、機器の標準化と安定性を日常的に確認しました。
   6. 閾値を設定して、細胞サンプルから破片やノイズを除去します。これらの設定を実験のすべてのサンプルに適用します。
   7. 必要に応じて、色補正を設定して蛍光の漏れ込みを補正します。
   8. サンプルをフローサイトメーターにロードする前に、サンプルを静かにバックピペット化し、サンプルに名前を付けて、サンプルを泳動します。
   9. すべてのサンプルを実行したら、さらにソフトウェア分析を行うために、サンプル データにファイル名を付けて FCS ファイルとして保存します。現在の実験の作業テンプレートを保存して、今後の実行で取得できるようにします (オプション)。

5. データ解析

1. フローサイトメーターのデータ解析ソフトウェアにデータをインポートします( 材料表を参照)。
2. ワークスペースで最初のサンプルをダブルクリックします。グラフウィンドウが開き、FSCパラメータとSSCパラメータに沿ったイベントのプロットが表示されるまで待ちます。ゲート内に含まれる精子集団を分離するゲートを作成し、イベントの親セットから「子」集団を生成します。
3. ゲート領域内をダブルクリックし、精子イベントのみを含む新しい グラフ ウィンドウを開きます。x軸とy軸のパラメータを設定して、蛍光チャンネルを選択します。
4. ゲートツールを選択します。プロット内をクリックしてゲートを表示し、作成されたゲートによって異なる細胞集団が分離されるようにします。
5. 強調表示された行のいずれかを右クリック (または Control キーを押しながらクリック) し、[分析を グループにコピー] を選択します。グループ内のすべてのサンプルにゲーティングツリーを適用します。
6. データテーブルを保存してエクスポートします。

結果

図2は、アネキシンV-FITC/PI染色を用いた精子のアポトーシスの測定結果を示しています。FITCシグナル(緑色蛍光)はFL1チャンネルで、PIシグナル(赤色蛍光)はFL2チャンネルで測定しました。Annexin V/PI二変量解析では、象限メーカーは4つの特徴的な精子集団を特定しました。結果は、アネキシンV^-/PI−精子(生細胞または生細胞)、アネキシンV⁺/PI−精子(初期アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞)、アネキシンV+/PI+精子(後期アポトーシス細胞)、およびアネキシンV⁻/PI⁺精子(壊死細胞)の割合で表した^16,17(図2B)。ネガティブコントロール(未染色精子細胞)も、代償と象限を設定するために使用しました(図2A)。

図3 は、JC-1プローブを用いたヒト精子中のMMPの測定結果です。MMP %は、サイトグラムの解析により、橙赤/(緑+橙赤)蛍光比として表されます。良質の精液サンプルは、通常、高い橙赤色蛍光と低い緑色蛍光(活性ミトコンドリア、左上の象限)を示します(図3A)。逆に、質の悪い精液サンプルは、通常、ミトコンドリアの破壊が原因で、橙赤色の蛍光が低く、緑色の蛍光が高い(不活性なミトコンドリア、右下の象限)ことが原因です(図3B)。

図4に^SCSA13,14のデータを示す。これらの典型的なSCSAサイトグラムは、2つの個別のサンプルから得られた。サンプルAは肥沃な男性から、サンプルBは不妊症の男性から採取されました。フローサイトメトリーデータの解析は、FlowJoソフトウェアを用いて行いました。サイトグラムは、SCSAデータの各構成要素の出所を示す。x軸(赤色蛍光の1,024階調の赤色蛍光)は、断片化されたDNAを示します。Y軸(1,024階調の緑色蛍光)は、天然DNA染色性を示します。y = 750の点線は、正常な精子の境界を表しています。y = 750のそのラインの上には、未熟な精液として決定された部分的に非縮合クロマチンを持つ精液があります。

図1:フローサイトメトリーによる精子機能損傷のバイオマーカー検出のワークフロー。 精液サンプルを採取し、プロトコルステップ1に記載されているように前処理しました。(1)細胞調製、(2)蛍光試薬による染色、(3)フローサイトメトリー解析とデータ解釈。略語:MMP =ミトコンドリア膜電位;SCSA = 精子クロマチン構造アッセイ;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;AO =アクリジンオレンジ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:アネキシンV-FITC/PI染色を用いた精子アポトーシスの代表的な結果。左下の象限にはアネキシンV^-/PI−精子(生細胞または生細胞)が含まれ、右下の象限はアネキシンV+/PI−精子(初期アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞)を示し、右上の象限はアネキシンV+/PI+精子(後期アポトーシス細胞)を表し、左上の象限にはアネキシンV⁻/PI⁺精子(壊死細胞)が含まれています。(A)ネガティブコントロール(未染色精子細胞);(B)精子アポトーシスを有する試料。略語:FITC =フルオレセインイソチオシアネート;PI = ヨウ化プロピジウム。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:JC-1プローブを用いたミトコンドリア膜電位の測定 。 (A)MMPが高い精子亜集団。(B)MMPが低い精子亜集団。FL1-AとFL2-Aをそれぞれx軸(緑色蛍光)とy軸(橙赤色蛍光)として設定します。略語:MMP =ミトコンドリア膜電位。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:精子クロマチン構造アッセイを用いたヒト精子のDNA損傷の検出。 (A)クロマチン構造が正常な精液サンプル。(B)クロマチン構造に異常のある精子の割合が高い精液サンプル。FlowJoソフトウェアを使用して、1)正常精子、2)HDS精子、3)DFI精子、4)細胞破片として識別された細胞集団の周囲にコンピューターゲートを作成し、HDSおよびDFI精子の割合を計算しました。略語:SCSA =精子クロマチン構造アッセイ;HDS = 高いDNA染色性;DFI = DNA断片化指数。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ヒト精子のクロマチン完全性、MMP、およびアポトーシスは、生殖転帰の貴重な予測因子であることがわかっています。ヒト精液の検査と処理に関する最新のWHO検査マニュアル(第6版)も、精子数などの日常的なパラメータの基本的な検査を超えた拡張検査として、これらの指標のいくつか(クロマチンの完全性とアポトーシス)を強調しています¹⁸。最近の出版物はまた、これらの指標が外部の有害暴露に対する反応のより敏感なマーカーである可能性があることを示唆しており、早期段階で生殖障害を特定する可能性を示しています^19,20。これらの指標を定期的な検査と組み合わせることで、精子機能障害のプロファイルと集団における男性の生殖障害の複雑さについて、より包括的な理解が得られる可能性があります。

FCMによる精子分析の成功を大きく左右するいくつかの重要な問題があります。まず、精子のMMPとアポトーシスの測定は、精液が液化した後、すぐに検査する必要があります。時間コストを最小限に抑えるために、MMPの前処理とサンプルのアポトーシス分析を2人の技術者が別々に担当することができます。アポトーシスの前処理は単純であるため、MMP解析よりも早くフローサイトメトリーステップに移行します。SCSA分析では、液化後、新鮮な精液サンプルが利用可能になり次第、直ちに凍結保存する必要があります。精子サンプルは、液体窒素中で比較的長期間保存することができ、すぐに検査する必要はありません。

したがって、実験の現場時間コストは、MMP分析の期間と精子分析のフローサイトメトリーステップである40分に圧縮できます。次に、フローサイトメトリープラットホームでのゲーティングの設定は、サンプルのバッチごとに個別に決定する必要があります。散布図にクリアセルサブグループを持つ精子サンプルを、ゲーティング領域を描画するための参照として選択できます。第三に、この実験の指標には広く受け入れられている臨床的基準値がないため、過去の結果は品質管理の重要なツールとして使用できます。ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、特にSCSAとMMPの場合、測定の各バッチで設定することも推奨されます。

ここで提供される精子分析の代表的な結果は、Accuri C6を使用して導き出されます。ただし、この手法は、マイナーな変更で他の商用プラットフォームに適用できます。通常、すべての指標の測定要件を満たすには、合計5×10⁶ 個の精子細胞が必要です。サンプルの精子濃度が平均レベルよりもはるかに低い場合、精液の量の必要性が増加します。

通常の精子パラメータと同様に、ヒト精子のクロマチン完全性、MMP、およびアポトーシスにも顕著な個人内変動があります²¹。したがって、異なる時期に収集されたサンプルの複数のテストは、精子機能の損傷レベルのより正確な推定を提供する可能性があります。フローサイトメトリー分析の精子サンプリングの前に推奨される禁欲期間はありませんが、WHOによる定期的な精子分析に提案されている2〜7日間の射精禁が採用される場合があります。これは、検査室間および同じ男性から収集された異なるサンプル間での結果の比較可能性を向上させるのに役立つ可能性があります。

この方法の主な制限は、テストされた3つのバイオマーカーのうち2つ(アポトーシスとミトコンドリア膜電位)が新鮮な精液サンプルを必要とすることです。これにより、精液サンプルを検査室に提供できる男性に限定される可能性があります。DNA損傷(SCSA)の検査では、実験前に参照サンプルを調製してフローサイトメーターを校正する必要があります。注目すべきは、本プロトコルの適用にはラボでのFCM機器が必要であり、これは多くの臨床検査室にとって依然としてかなりの課題であるが、一部の地域ではサードパーティサービスとの協力が代替の選択肢となる可能性がある。

さらに、染料やその他の試薬の費用も、検査を必要とする可能性のある男性にとって経済的要因です。最後に、異なるブランドまたはバージョンのFCMを使用してバイオマーカーを調べる場合、プロトコルの変更が必要になることがあります。要約すると、この論文は、単一のフローサイトメトリーマシンによってヒト精子損傷の3つのバイオマーカーを推定するための実用的なアプローチを提示します。これは、男性のリプロダクティブヘルスに関する貴重な情報を提供し、定期的な精子検査を補完する可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.1 M クエン酸バッファー	Sigma-Aldrich Chemical Co., USA	251275-5G	21.01 g/L クエン酸一水和物 (FW = 210.14; 0.10 M) を 1.0 L H2O に加えます。
0.2 M Na2PO4バッファー	Sigma-Aldrich Chemical Co., USA	V900061-500G	28.4 g リン酸二塩基性ナトリウム (FW = 141.96; 0.2 M) を 1.0 L H2O に加えます。
10 mM CCCPストック溶液	Sigma-Aldrich Chemical Co., USA	C2759	10.0 mL DMSOに20.46 mg CCCPを加え、CCCPの最終的な濃度まで10mMで、アリコートして&マイナスで保存します。80°C。
10 µM CCCP作業溶液			10mLのPBSを15mLのポリプロピレン遠心チューブに加え、10μ;L CCCPストック溶液、10µMの濃度でCCCPの最終的なものまで作る。
1 mM JC-1ストック溶液	Sigma-Aldrich Chemical Co.、USA	T4069	JC-1を凍結乾燥して購入しました。バイアルに少量のDMSOを加え、すべての色素が溶解するまで数分間ボルテックスします。溶液を軽量チューブに移し、バイアルを適切な量のDMSOですすぎ、JC-1の最終濃度まで1 mg / mL にします。アリコートとストア −20°C。
37度;Cインキュベーター	Thermo Scientific, USA
5 µM JC-1作業溶液			10mLのPBSを15mLのポリプロピレン遠心チューブに加え、50μ;解凍したJC-1ストックアリコートのL。穏やかに攪拌して、均一な希釈を確保します。この溶液は、暗闇に保管し、すぐに使用する必要があります。
Accuri C6 Flow cytometer	BD Pharmingen, San Diego, CA, United States
酸性溶液、pH 1.2			20.0 mL 2.0 N HCl (0.08 N)、4.39 g の NaCl (0.15 M)、および 0.5 mL の Triton X-100 (0.1%) を H2O に混ぜ合わせると、最終容量は 500 mL になります。5 mol/L HClでpHを1.2に調整します。
アクリジンオレンジ(AO)ストック溶液、1.0 mg/mL	Polysciences, Inc, Warrington, Pa	65-61-2	クロマトグラフィー精製されたAOをdd-H2Oに1.0 mg/mLで溶解します。
AO染色液(ワーキングソリューション)			600 μ各100 mLの染色バッファーに対するAOストック溶液のL。
生物学的安全フード	エアテック、米国
コンピューター支援精子分析システム(CASA)	Microptic、バルセロナ、スペイン		精子クラスアナライザー5.3.00
精子計数室	Goldcyto、スペイン
Equipments
FITC Annexin V アポトーシス検出キットI	BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ	556547	含まれるもの:(1)FITCアネキシンVは100 ng/µで瓶詰めされています。L;(2)ヨウ化プロピジウム(PI):PI染色液は50μで構成されています。g PI/mL in PBS(pH 7.4)で、0.2 µM 滅菌ろ過済み。(3) 10x Binding Buffer:0.1 M Hepes (pH 7.4)、1.4 M NaCl、25 mM CaCl2。1xワーキング溶液の場合、10x Annexin V Binding Bufferの1部を9部の蒸留水に希釈します。4°Cで保管します。Cで、長時間光にさらされないように保護されています。凍結しないでください。
フロージョ 10	Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA
水平遠心分離機	Thermo Scientific, USA
液体窒素タンク	Thermolyne, USA
strong>Materials
PBS	Beyotime, Shanghai, China	C0221A	すぐに使えるPBSバッファーを購入し、室温で保管します
染色緩衝液、pH 6.0			0.10 M クエン酸緩衝液 370 mL、0.20 M Na2PO<>sub4 バッファー、EDTA 372 mg(二ナトリウム、FW = 372.24、1 mM)、NaC1 8.77 g(0.15 M)を組み合わせます。攪拌板で一晩混合し、EDTAが完全に溶液中にあることを確認します。飽和NaOH溶液でpHを6.0にします。
SCSA分析			参照サンプルを冷水(4°C;C)TNEバッファーを1&ndashの作業濃度に。2 ×106細胞/mLで、緑色を475/1,024フローサイトメトリーチャネルに設定し、赤色を125/1,024フローサイトメトリーチャネルに設定するために使用します。
TNEバッファー、1x、pH 7.4(標準溶液)			60 mLの10x TNEと540 mLのH2Oを組み合わせ、pH(7.4)を確認します。
TNEバッファー、10x、pH 7.4	Perfemiker、上海、中国	PM11733	Ready-to-useバッファーは購入し、4°Cで保存します。