アラントイック液からの高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産

Avian Orthoavulavirus-1としても知られるニューカッスル病ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスまたはウイルスベクターワクチン1,2,3,4,5,6,7の両方として使用される可能性のあるエンベロープ鳥パラミクソウイルスである。ごく最近、SARS−CoV−2のスパイクタンパク質を発現するように操作されたNDVは、マウスおよびハムスターチャレンジモデルにおいて有効な鼻腔内ワクチンとして特徴付けられている⁷、^8、9。癌免疫療法として使用される場合、それは自然免疫細胞、具体的にはナチュラルキラー細胞の動員、I型インターフェロンの産生、および抗腫瘍特異的T細胞の生成をもたらす10、^11、12、13。これらの強力な免疫刺激特性に加えて、NDVは強力な安全性プロファイルおよび十分に確立された逆遺伝学系を有する^14、15。これらの望ましい特性は、多数の前臨床試験およびヒト臨床試験(NCT04871737、NCT01926028、NCT04764422)^16、17におけるNDVの評価を促している。この非常に有望な免疫刺激性ウイルスベクターをさらに進めるためには、インビボで安全に投与できる高力価の超高純度NDVを産生および精製するための詳細な方法が必要である。

NDVは鳥類パラミクソウイルスであるため、受精した鶏卵で最も頻繁に増幅されます。NDVを伝播するために利用可能な細胞ベースの系がある一方で、そのほとんどは、受精したニワトリの卵で達成されたものと同様の力価を産生することができなかった¹⁸。それにもかかわらず、卵ベースの生産が長く、容易に拡張可能ではないという事実、大量のSPF鶏卵の調達が問題となる可能性があること、および卵アレルゲンによる汚染の可能性が存在することを含む、卵でNDVを生産することにはいくつかの欠点がある^13,18,19,20.最近、あるグループは、無血清培地中の懸濁液中で増殖したVero細胞が、精製前に卵で達成されたものに匹敵する力価へのNDVの複製を支持できることを示した²¹。しかしながら、これにはウイルスをVero細胞に適応させるためにウイルスの連続継代が必要であり、そして懸濁液Vero細胞からNDVを精製する方法の最適化は依然として必要である²¹。

先に強調したように、高力価の インビボグレードウイルスを精製するために使用される方法は、問題²²のウイルスによって異なる。組換えNDVの生成に利用可能な十分に確立された逆遺伝学システムがある。このプロセスは、cDNAクローン、ヘルパープラスミド、およびT7 RNAポリメラーゼを発現するヘルパーウイルスの使用を含む、^15、23で以前に詳細に説明されている。このプロトコルは、レントゲン性またはメソゲン性NDVのいずれかに適用することができる。このプロトコールに記載されるウイルスは、個々の転写単位としてウイルスP遺伝子とM遺伝子の間に挿入されたクラゲ Aequorea victoria 由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする組換えメソゲンNDVであり、これは以前に外来導入遺伝子挿入の最適部位として記載されている²⁴。

密閉された方法は、100〜500nmの範囲のサイズおよびその密度¹⁵に基づいてNDVの精製を概説する。これにより、卵を受け取ったときから最終力価になるまで、約3週間でin vivoグレードの高力価NDVストックを生成することができました。タンジェンシャルフローろ過、デプスろ過、密度勾配超遠心法などの卵ベースのウイルスの大規模生産に頻繁に使用される技術が記載されており、これらの方法のより大規模な生産への変換が可能です。NDVの精製のための以前に記載された技術は、ウイルス安定化緩衝液の組み込み、密度勾配超遠心分離中のヨウジキサノールの使用、およびインビボグレードの品質を確保するための様々な品質管理措置の説明によって改善された¹⁵。これにより、0.8 ~ 1.0 Lのアラントウ液から3 ×^{10 10} PFU/mLまでの力価に達するin vivoグレードNDVの精製が可能になりました。

動物の使用を含むすべての作業は、カナダ動物ケア評議会に従って、ゲルフ大学アニマルケア委員会によって承認されました。すべての作業は、中原性NDVがリスクグループ2病原体であるカナダのバイオセーフティレベル2(BSL2)研究所で行われます。NDVの増幅および精製に関与するすべてのステップは、安全性および無菌性の目的のために、タイプIIA生物学的安全キャビネットで実施されるべきである。

1. 特定病原体非含有受精鶏卵を用いたNDVの増幅

1. SPF受精鶏卵の接種
   注:典型的には、8ダースのSPF受精鶏卵が、NDVの1つの インビボグレードバッチを生成するために使用される。出荷中の損傷と生存率の変動性を説明するために、1〜2ダースの余分な卵を注文してください。受精した鶏の卵は生物学的材料であり、制度上のガイドラインに従って取り扱う必要があります。ただし、胚は孵化していないため、施設動物愛護委員会の承認は必要ありません。
   1. SPF受精鶏卵を受けた後、37°C、湿度60%の卵インキュベーター内で9日間インキュベートする。インキュベーターが1時間ごとに卵を自動的に揺らす/回転させるように設定されていることを確認します。
      注:卵は室温で最大24時間、または4°Cで最大72時間保存できます。しかし、これは胚の生存率を低下させる可能性がある。
   2. 孵化の8-11日後(理想的には9日目)、卵をろうそくで胚の生存率を決定します。生存可能な胚の指標として、ウェブ状の血管系(図1A)と胚の動きを探します。これらの特徴を欠いている卵を処分する(図1B)。
   3. 生存可能な卵に、鉛筆で気嚢と胚の間の界面に「X」の印を付けます(図1A)。この注射部位が血管系の穿孔を引き起こさないことを確認する。接種剤が準備されている間、マークされた卵をインキュベーターに戻します。
   4. すべてのSPF受精鶏卵を注入するのに必要なウイルスの量を計算します。各卵が100μLの容量で100PFUのウイルスを受け取ることを確認する。ウイルスをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1 ×¹⁰³ PFU/mLの濃度に希釈する。ウイルス投与の不正確さを説明するために、接種の余分な20%を準備します。
   5. 帯電防止ワイプを使用して、70%エタノールで希釈した10%ヨウ素溶液でマークされた卵の上部をきれいにします。溶液が乾燥するまで約1〜2分待ちます。
   6. 滅菌された鋭いピンセットを使用してシェルを慎重に突き刺します。ピンセットを卵の間の70%エタノールで消毒する。
   7. 1 mL シリンジと 25 G 針を使用して、ステップ 1.1.4 で調製した接種剤 100 μL を脈絡膜血管腔に注入します (図 1C)。卵に対して約90°の角度で針でアプローチします。針を絨毛膜の上部に挿入します。
   8. 接種後、マニキュアを使用して穿刺部位を覆い、卵をインキュベーターに戻します。接種後24時間までロッキング設定がオンになっていることを確認します。
   9. 接種後24時間で卵子の生存率を確認してください。絨毛膜および胚運動における血管系を欠いている死んだ卵を捨てる(図1B)。
      注:これらの卵は、NDVからではなく、接種プロセスのために死亡しました。
   10. 卵をインキュベーターに戻し、ロッカーをOFFにして、卵タンパク質による外来液の汚染を防ぎます。
   11. ステップ1.1.9で説明したように、12〜24時間ごとに卵をチェックして、死んだ卵を特定します。自己分解を最小限に抑えるために、接種後24時間後に死亡した卵を4°Cに移動します。冷やしてから2〜12時間以内にアラント液を収穫する。
   12. 卵を少なくとも72時間孵化させる。
       注:NDVのメソゲン株を増殖させる場合、インキュベーション時間が長くなると、アラント液の透明度が低下するため精製プロセスを損なう可能性があるため、最適なインキュベーション時間は60〜72時間です。この問題は、レントゲン性NDV株を増殖させる際には、胚を殺すのにはるかに長い時間がかかるほど重要ではありません。
   13. 適切な潜伏期間の後、残りの卵を4°Cに2〜12時間移動させてから、アラント液を採取する。
2. NDVを含むアラント系液体の収穫
   1. 冷やした卵をバイオセーフティキャビネットに移動します。卵のてっぺんを70%エタノールできれいにします。
   2. 滅菌ピンセットと外科用はさみを使用して、空気嚢がある卵の頂端側をこじ開けます。
   3. 殻を取り除いて絨毛膜を明らかにする(図1D)。
   4. 膜を慎重に穿刺し、剥がしてアラント腔を露出させます(図1E)。卵黄嚢が誤って穿刺されていないことを確認するだけでなく、これは卵を台無しにします。
   5. 鈍い鉗子を使用して胚をつかみ、胚嚢を開きます。
      注:胚嚢内の流体にもNDVが含まれています。
   6. 鉗子で胚を押し下げ、10mLの血清学的ピペットを使用してアラント液を採取する。
   7. 透明になるまで、氷上のアラント液を15mLの円錐管に保管する。
      注:アラント液が黄色の場合、卵黄嚢が損なわれており、アラント液は廃棄する必要があります。
   8. アラント液を含む円錐管を1,500× g で4°Cで10分間遠心分離する。
   9. 一時停止点:清澄化されたアラント液を50 mLの円錐形チューブにアリコートし、-80°Cで保存して長期保存(数週間から数ヶ月など)し、凍結融解の過酷な影響からウイルスを保護するために、スクロースを最終濃度5%まで液体で補います。あるいは、短期間(例えば、1〜3日間)の場合、4°Cでの保存の前に、アラント液をスクロース(最終5%)または3xマンニトール - リジン(ML)緩衝液(15%マンニトール、3%リジン;緩衝液レシピについては 補足表S1 を参照)で補い、1xの最終濃度(5%マンニトール、1%リジン)を得る。

2. アラント液からのNDVの浄化

1. アラント液の深さろ過
   1. 清澄化されたアラント液を-80°Cで保存し、精製前の夜に4°Cで解凍する。
   2. 生物学的安全キャビネットに、 図2に示すようにチューブとペリスタルティックポンプをセットアップします。
   3. まだ実施していない場合は、アラント液と3x MLバッファーを最終濃度1xになるまで組み合わせます。
   4. デプスフィルターを取り付ける前に、50 mL の 0.5 M NaOH をシステムを通して廃棄物容器に通してチューブを滅菌します。
   5. チューブをすすぎ、滅菌した分子グレードの水 100 mL をシステム内および廃棄物容器に通します。
      注:NaOHはNDVを不活性化するため、ウイルス含有アラント液を導入する前にラインを適切に洗浄することが重要です。
   6. 50 mLのPBSを通し、チューブに約5 mLのPBSが残っているときにポンプを停止して、システムをプライムします。
   7. 1 ~ 3 μM の保持定格のデプスフィルターをチューブに取り付け、デプスフィルターの頂端側にある 2 番目のキャップを取り外してフィルターを通気します。システムを介してさらに 50 mL の PBS の実行を開始します。
   8. PBS がフィルター上部の通気口を流れ始めたら、ポートを閉じ、PBS をラインに流し続けます。
      メモ: 小さな気泡でも問題ありませんが、大量の空気が存在すると、手順 2.1.7 および 2.1.8 で説明されているように、フィルタを再度通気する必要があります。
   9. チューブ内に約5mLのPBSが残っている場合は、ポンプを停止します。
   10. 廃棄物容器を新しい滅菌回収容器に交換し、デプスフィルターを通してアラント液の流しを開始します。
       注:圧力は10psiを超えてはなりません、これはウイルスの剪断をもたらすからです。圧力は、ポンプの流量を減少または増加させることによって操作することができる。圧力が10psiを超え始め、流量をこれ以上下げることができない場合は、新しい深度フィルタを使用する必要があります。この場合、アラント液の流れを再開する前に、ステップ2.1.6-2.1.8を実行する必要があります。
   11. すべての蛍光液がフィルターを通過したら、50 mL の 1x ML バッファーをラインに通し、ウイルス回収率を最大化します。
   12. ラインが乾くまで液体を集めます。ウイルスを一晩または4°Cで36時間まで保存します。
       注:ウイルスがデプスろ過されたら、デプスフィルターが完了してから36時間以内に精製プロセスを続行します。
   13. デプスフィルターを取り外し、0.5 M NaOHで保管する前に、100 mLの0.5 M NaOH、400 PPM漂白剤をシステムを通して42°Cに予温してチューブを消毒します。
2. NDVの濃度のための接線流ろ過
   1. 図3Aに描かれているように(そして前に²⁵に示すように)カセットの構成要素を生物学的安全キャビネットに組み立てる。
      メモ:マニホールドとエンドプレートは洗剤で洗って乾燥してから使用してください。シリコンガスケットは再利用可能であり、カセットとともに0.5 M NaOHに保管する必要があります。
   2. タンジェンシャルフローろ過(TFF)(クロスフローろ過とも呼ばれる)システムを「オープン」コンフォメーションでセットアップします(図3B)。
      1. カセットを初めて使用する場合は、TFFカセットを溶出コンフォメーションに組み立て、100 mLの滅菌分子グレードの水で洗い流します(図3C)。
      2. リザーバタンクに5 mLの水しか残らなくなったら、ポンプを一時停止し、TFFシステムのセットアップを閉じた立体構造に変更します(図3D)。
      3. 100 mLの0.5 M NaOH、42°Cに予温した400 PPM漂白剤をリザーバに加え、システムを30〜60分間循環させます。
      4. フローを一時停止し、TFFシステムを溶出セットアップに戻して、フローを再開して洗浄液を溶出させます。
      5. リザーバに約 5 mL が残っている場合は、ポンプを一時停止し、100 mL の滅菌分子グレードの水を加えてシステムをすすぎます。
      6. リザーバに約5mLが残っている場合は、ポンプを一時停止し、TFFシステムをオープンコンフォメーションに配置します(図3B)。ステップ 2.2.3 に進みます。
   3. ペリスタルティックポンプを使用して、100 mLの0.5 M NaOHをシステムに通すことによって、カセットとチューブを滅菌します。カセットの完全性を維持するために、圧力が 30 psi を超えていないことを確認します。
   4. リザーバ内に約5 mLの0.5 M NaOHが残っているときにポンプを一時停止します。
   5. 100mLの滅菌分子グレードの水をリザーバに加え、液体をカセットに通すことを再開する。リザーバを旋回させて、リザーバの側面からすべてのNaOHを洗浄し、ウイルスの不活性化を防ぎます。リザーバ洗浄ステップを繰り返します。
   6. 貯水池に約5mLの滅菌分子グレードの水が残っている場合は、ポンプを一時停止します。
   7. 100mLのPBSをリザーバに加え、無菌の分子グレードの水を確実にするために旋回し、側面から洗浄する。カセットを通る液体の流れを再開します。
   8. リザーバに約5mLが残っているら、ポンプを一時停止し、デプス濾過されたアラント液をリザーバに追加し、ポンプの流れを再開します。
   9. 圧力計1(図3B)を監視して、ウイルスのせん断を防ぐために10psiを超えないようにします。ペリスタルティックポンプの速度とCクランプの使用を組み合わせて使用し、廃棄物への溶出を増加させます。
      メモ:ペリスタルティックポンプとCクランプの速度を組み合わせると、圧力が上昇します。
   10. リザーバに50〜100mLのアラント液が残っている場合は、ポンプを一時停止して、150〜200mLの1x MLバッファーを加えてバッファー交換を行います。
   11. ポンプの流れを再開し、圧力計1(図3B)を再び監視して、10psiを超えないようにします。
   12. リザーバに5〜10mLが残っている場合は、ポンプを一時停止します。
   13. 2 つの C クランプを使用して、 図 3C に示すように 2 本の廃棄物ラインを閉じます。
   14. リザーバに供給する保持ラインを結合解除し、50mLの円錐管に挿入します(図3C)。
   15. ポンプの流れを再開し、リザーバタンクに数滴の流体が残っているときに一時停止します。
   16. 廃棄物ラインからCクランプを取り外し、保持液供給ラインをリザーバタンクに取り付け直します(図3B)。
   17. 20 ~ 25 mL の 1x ML バッファーを加え、リザーバタンクに約 5 mL が残るまでポンプの流れを再開します。
   18. 手順 2.2.13 ~ 2.2.16 を繰り返します。
       注:3^回目の 溶出は、ステップ2.2.17および2.2.13〜2.2.16を繰り返してウイルス収量を増加させることによって行うことができます。しかし、ウイルスのほとんどは、最初の2つの溶出に存在する。
   19. 溶出を終えたら、ウイルスを氷上または4°Cに置きます。
   20. ラインをクレンジングするには、図3Dに示すように、廃棄物ラインがリザーバにフィードバックされる閉ループ形式(図3D)になるようにシステムを設定します。
   21. 42°Cに予温した0.5 M NaOH、400 PPM漂白剤250 mLを加えてシステムの洗浄に進みます。
   22. 洗浄液を一晩システム内に流します。
       メモ:洗浄液を再循環させながら、ポンプを50mL/minの速度で稼働させる場合は、約5psiの圧力を観察する必要があります。圧力がこれを超えると、カセットが汚れており、洗浄液を交換し、プロセスを繰り返す必要があります。
   23. 廃棄物ラインと保持ラインの両方を廃棄物容器に向けることによって、洗浄液を溶出させる。
   24. 400-500mLの滅菌水を貯水池に加え、システムを通って廃棄物容器に流します。
   25. 約5 mLがリザーバに残っているら、ポンプを一時停止し、100〜200 mLの0.5 M NaOHをリザーバタンクに加え、溶液を旋回させてリザーバ容器を洗浄する。
   26. リザーバがほぼ空になったら、ステップ2.2.23をさらに2回繰り返します。
   27. TFFセットアップを分解し、TFFカセットとガスケットを0.5 M NaOHの少量で4°Cで再密封可能なビニール袋に保管します。
       注:チューブは、0.5 M NaOHに沈めた室温で保存することができます。
3. ヨウジキサノール密度勾配超遠心
   1. 超遠心分離機の電源を入れ、4°Cに予冷するように設定します。 目的のローターも4°Cで予冷します( 材料表を参照)。
      メモ:ローターは4°Cで保管してください。
   2. ストック60%ヨージキサノール溶液(購入時の濃度)を使用して、PBSおよび3x MLバッファーで希釈して40%、20%、および10%ヨージキサノール溶液を1x最終濃度のMLバッファーに生成します。
   3. 13.2 mLのオープントップ薄壁超遠心チューブに、それぞれ40%、20%、および10%のヨウジキサノール溶液を0.5 mL、2.5 mL、および2.5 mL重ねます(図4A)。
      注:超遠心チューブを横に傾け、溶液をゆっくりと排出すると、2つのグラジエント層が混合するリスクが大幅に低減されます。各レイヤーの分離は明白で、グラデーションの各レイヤー間に「ハロー」が表示されます。
   4. マーカーペンを使用して、さまざまなグラデーションレイヤーのインターフェイスにマークを付けます。
   5. 層6-6.5 mLのTFF手順から溶出したウイルスを密度勾配の上に。ステップ 2.3.3 の説明に従ってウイルスを慎重に加え、密度勾配を乱さないようにします。
   6. オープントップスケールを使用して、超遠心チューブをスイングバケットローター( 材料表を参照)のインサートにロードし、インサートを互いに0.01g以内にバランスさせます。PBSまたは余分なウイルス溶離液を使用して、体重差を考慮します。
   7. チューブのバランスが取れたら、チューブにキャップをかけてローターにセットします。
   8. 4°Cで125,000 × g で1.5時間遠心分離する。
      注:これは、遅延開始機能を備えた超遠心分離機が利用可能な場合、一晩で実行できます。
   9. 超遠心分離に続いて、一対の滅菌鉗子を用いてチューブを取り外す。ターゲットバンド(10%と20%のグラデーションの間の大きなバンド)を探します(図4B)。
   10. レトルトスタンドを使用してビーカーの上にチューブを吊り下げます。
   11. 18G x 1.5インチの針を5mLシリンジに取り付け、超遠心チューブの側面を穿刺します。
       注:チューブは、針を上向きの角度にしてターゲットバンドの少し下に穴を開け、ターゲットバンドに入るように上向きに傾ける必要があります。
   12. プランジャーをゆっくりと伸ばして、ターゲットバンドを取り外します。
       メモ:針をターゲットバンド内で動かして、抽出されたウイルスを最大化します。他のバンドや破片がターゲットバンドと混ざらないように注意し、透析カセットの使用が増えるため、余分な溶液を服用しないでください。
   13. ターゲットバンドが抽出されたら、針を取り外し、残りの溶液を廃棄物ビーカーに排出します。ターゲットバンドを50 mLの円錐形チューブに分配して、他のすべての超遠心チューブからすべてのバンドが抽出されるまでします。
   14. すべての超遠心チューブからすべてのターゲットバンドが抽出されるまで、手順2.3.10-2.3.13を繰り返します。
   15. ステップ2.3.10~2.3.13で説明したようにターゲットバンドを抽出する別の方法
       1. ターゲットバンドを重ねた液体をピペットでゆっくりと取り出します。ターゲットバンドに達したら、ピペットを使用して抽出し、50mLの円錐形チューブにウイルスを保管します。
          注:これにより、超遠心チューブを再利用することができます。
4. ウイルス溶液からのヨウジキサノールの除去
   注:NDV含有バンドは、15%〜16%の間のヨウジキサノール密度で現れる。溶液中のヨウジキサノールの濃度は、標準曲線を参照して340nmにおける吸光度を測定することにより求めることができる(補足図S1)。この濃度のヨウジキサノール溶液をC57BL/6マウスに投与した場合、有害作用または急性毒性は観察されなかったため、この工程は省略することができる。
   1. 0.5〜3mLの分子量10kDaのカットオフ透析カセットをPBSに1分間沈めることによってプリウェットする。
      注:透析膜は、滑らかな外観からフリルまたはでこぼこした外観に変わるはずです。抽出したウイルスの容量が10mLを超える場合は、0.5~3mLの透析カセットを2カセットまたは5~12mLの透析カセットを使用してください。
   2. 必要に応じて、5 mL または 10 mL シリンジと 18 G x 1.5 インチの鈍い充填針を使用して、50 mL の円錐管からウイルスを採取します。
   3. シリンジを使用して透析カセットに入り、膜を突き刺さないように注意し、ウイルスを注入します。
      メモ:透析カセットを回転させて、カセット内のエアポケットの位置を操作できます。カセットから針を取り外す前に、エアポケットを取り外す必要があります。
   4. 1Lビーカーに滅菌1x PBSを充填し、スターラーバーと透析カセットを内部に置き、カバーします。穏やかに攪拌しながら4°Cでインキュベートする。
      メモ:押し出されたポリスチレンフォームと弾性バンドを使用して透析カセットを取り付け、PBSに浮かぶようにします。カセットはMLバッファーのためにわずかに膨潤することがあります。
   5. 1〜2時間後、新鮮な1x PBSと交換し、わずかな攪拌でさらに8〜10時間4°Cでインキュベートし続ける。
      注:これは一晩で行うこともできます。
   6. もう一度新鮮な1x PBSと交換し、室温で1〜2時間インキュベートする。
5. ウイルス液の濃度
   1. 透析バッファーから透析カセットを取り出し(図4C)、密封可能な小さなビニール袋に入れます。透析カセットが完全に水没するように、40 ,000MWポリエチレングリコールを15〜25mL加える。
   2. ロッキングしながら室温でインキュベートする。カセット内のウイルスの量を、5 mLまたは10 mLのシリンジと18 G x 1.5インチの鈍い充填針を使用して定期的に確認します。
      注: ウイルスの濃縮に必要な時間は、開始ボリュームと希望する終了ボリュームによって異なります。典型的には、最終的な所望の体積は、アラント液の開始体積にかかわらず、1〜1.5mLの間である。ボリュームをチェックするときは、ポートの整合性が損なわれ、ポリエチレングリコール溶液とウイルスが混在する可能性があるため、同じポートを使用しないように注意してください。
   3. 透析カセットから濃縮ウイルスを除去する前に、カセットを1x PBSで短時間すすぎ、18G x 1.5インチの鈍い充填針に空気を充填します。
   4. 空気充填シリンジを透析カセットに挿入し、プランジャーを押し下げます。導入された空気を一切除去せずに濃縮ウイルスを除去することができるように装置を回転させる。
   5. 濃縮したウイルスを50mLの円錐形チューブに分注し、分注した量を書き留めます。
   6. 同じシリンジと針を使用して、適量の60%スクロースを透析カセットに注入し、以前に除去したウイルスと組み合わせると、最終濃度が5%スクロースになるようにする。
   7. 手袋をはめた指を使って膜をマッサージし、膜に付着した可能性のある残留ウイルスを取り除き、膜を傷つけないように注意してください。透析カセット内の余分な空気の一部を除去して、脱落プロセスを容易にします。
   8. この洗浄を、すでに50mLの円錐形チューブに入っているウイルスと組み合わせます。
      注:ウイルスは現在5%スクロース中にあり、20 μL、50 μL、100 μL、または200 μLのアリコートに分注し、-80 °Cで保存する準備ができています。 あるいは、長期保存のために、NDVを凍結乾燥し、セクション2.6に記載されているように4°Cで保存することができる。
6. NDVの凍結乾燥
   1. 1.5 mL 遠心分離チューブまたは 15 mL 円錐チューブに小分けしたウイルスを、44 × 10-3 MBAR および ^- 52 °C で 16 時間凍結乾燥します。
   2. 凍結乾燥サンプルをウイルス力価の有意な低下なしに4°Cで保存する。

3. 品質管理アッセイ

1. ゲノム確認のためのウイルスRNA単離および逆転写PCR
   1. 20 μLのウイルスアリコートを解凍する。キットに付属のウイルス RNA 単離プロトコルに従ってください。
   2. 単離したRNAを直ちに逆転写PCR(RT-PCR)の鋳型として使用するか、-80°Cで保存してください。
   3. 製造業者が提供するプロトコルに記載されているように逆転写反応を調製する。
   4. 得られたcDNAを各種精度コントロールPCR反応の鋳型として使用し、NDV病態型(表1、Fタンパク質プライマーセット)および必要な遺伝子コントロールエレメントの存在(表1、導入遺伝子プライマーセット)を確認した。
      注:プライマーは、伝播されるNDVの歪みに基づいて設計する必要があります。
      1. 病態型の主要な決定因子であるFタンパク質切断部位を配列決定するには、Fタンパク質プライマーセットを使用する(表1)。長さが435塩基対のPCR産物を探します。
         注:ここでは、プライマーはNDVのラソータ株(GenbankアクセッションAF077761.1)に基づいて設計されました。最適な導入遺伝子発現は、P遺伝子とM遺伝子²⁴の間に外来導入遺伝子が挿入されたときに起こることは十分に確立されている。
      2. 導入遺伝子プライマーセットを使用して、導入遺伝子の遺伝子開始要素と遺伝子終了要素の完全性を確認します。PCR産物を配列決定し、遺伝子開始および遺伝子終了配列の完全性を確認した。
   5. PCR産物をDNAシーケンシング用に送り、相同性の鋳型と比較します。
2. SDS PAGEおよびクーマシー染色により、汚染タンパク質を検出
   1. 最初に6%および15%ポリアクリルアミド溶液を調製することによって密度勾配SDS PAGEゲルをキャストする(補足表S1)。10 mL のピペットを使用して 5 mL の 15% 溶液を抜き取り、続いて 5 mL の 6% 溶液を吸い込みます。
   2. 溶液からピペットを取り出し、短時間空気を吸い上げて気泡を発生させます。
      メモ: 気泡が上方に移動すると、解が混合されて SDS PAGE グラデーションが作成されます。
   3. 溶液を鋳造装置に分配し、30分間固化させる。
   4. 20 μLの最終容量で、ウイルスのアリコートと4倍の還元バッファー(補足表S1)を最終濃度が1倍になるように組み合わせ、サーモサイクラーで95°Cで10分間沸騰させます。ウイルスの少なくとも 1 × 10⁷ PFU をロードします。
   5. SDS PAGE を実行中のバッファー (補足表 S1) に沈め、サンプルをロードします。
   6. ゲルを120Vで1〜1.5時間実行します。
   7. ランニングバッファーからゲルを取り出し、小さな容器に移します。
   8. クーマシー染色溶液(補足表S1)を加えてゲルを覆う。室温で4〜5時間インキュベートする。
   9. 染色溶液を除去し、染色除去溶液(補足表S1)を加え、攪拌しながら室温で4〜8時間インキュベートする。デシミ溶液を3〜4回交換します。
      注:ゲルは透明で、その色は染色前と同じでなければなりません。
   10. 比色設定でゲルをイメージします。アラント液および精製ウイルスからのサンプルを含むクーマシー染色SDS PAGEゲルの代表的な画像については、 図5 を参照してください。
3. 組織培養感染線量中央値(TCID₅₀)および免疫蛍光アッセイによる感染性ウイルス力価の定量
   注:ベロセルはDF1セルの代替として使用できます。しかし、細胞変性効果(CPE)はVero細胞ではあまり顕著ではない。このアッセイでは、菌原性を増強するL289A変異を保有し、 P 遺伝子と M 遺伝子の間でGFPを発現するNDVが用いられている。
   1. 2%ウシ胎児血清(FBS)および125μg/mLトリプシンを添加したDMEMを使用して、前日にDF1細胞の96ウェルプレートを80μLの容量で20,000細胞/ウェルで播種する。細胞を37°Cおよび5%_CO2でインキュベートする。
   2. 翌日、氷上で20μLのアリコートのウイルスを解凍する。
   3. 1.5 mL チューブを使用して、段階希釈液を調製します。まず、10 μL のウイルスを 990 μL の PBS で希釈し、^10-2 希釈液を調製します。900 μLのPBSと前の希釈液の100 μLの添加で作られた、少なくとも10^〜10 個までの他のすべての希釈液を準備します。
      メモ: 希釈液間を移動するときは、新しいピペットチップを使用してください。
   4. 各希釈液の20 μLを使用して、 図6に示すように96ウェルプレートの各ウェルに感染させます。
      注:各ウェルの最終容量は100 μLになります。
   5. CPE/GFPの存在を調べるか、間接免疫蛍光アッセイ(IFA)を実行する前に、プレートを37°Cおよび5%_CO2で少なくとも48時間インキュベートします。
      注:これらの培養条件下では、CPEは10時間後に明らかであり(図7A-D)、次の24時間にわたって増加します(図7E-H)。プレートは、GFPまたはCPEによってスコアリングする場合、CPEの強度を改善するためにより長くインキュベートすることができる。
      1. CPE または GFP でスコアリングし、IFA を実行しない場合は、手順 3.3.18.1 に進んでください。
   6. IFAを行う場合は、100 μLの1x PBSで細胞を2回すすいでください。
   7. PBSで希釈した4%パラホルムアルデヒド100μLを各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートする。
   8. 細胞を100 μLの1x PBS、0.1% Tween 20(0.1% PBS-T)でそれぞれ3 x 5分間洗浄します。
   9. PBSに0.1% NP-40の100 μLを添加し、室温で10分間インキュベートすることによって細胞を透過させる。
   10. 細胞を100 μLの0.1% PBS-Tで3x 5分間洗浄します。
   11. 0.1% PBS-Tで希釈した5%(V/V)正常ヤギ血清からなるブロッキングバッファー100 μLを室温で1時間、または4°Cで一晩加えます。
   12. 0.1% PBS-Tで希釈した初代マウス抗NDVリボヌクレオタンパク質抗体を1 μg/mLに1ウェルあたり100 μL加え、室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートする。
   13. 細胞を100μLの0.1%PBS-Tで5分間3倍洗浄する。
   14. 0.1% PBS-Tで希釈したAlexaFluor 488ヤギ抗マウス二次抗体を2 μg/mLに100 μL加えます。室温で1時間インキュベートする。
   15. 細胞を100μLの0.1%PBS-Tで5分間3倍洗浄する。
   16. 最終洗浄後、細胞を100 μLの0.1% PBS-Tのままにする。
   17. 倒立蛍光顕微鏡を用いてウェルを画像化する。
   18. IFAを行う場合、陰性対照ウェルに見られるものよりも大きい蛍光を探し、 図8に示すようにウェルがNDVに対して陽性であることを示す。
       1. NDV CPEを特徴付けるシンシチアと大きく丸みを帯びた細胞の存在を探します。GFPを発現するウイルスに感染したウェルをスコアリングする場合は、GFPの存在を探します。
   19. スピアマン・カーバー力価計算機²⁶に適切な情報を入力して、ウイルスのPFU/mLを決定します(表2)。TCID₅₀ 力価プレートの例については図 6 を参照してください。
4. 定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)によるウイルス力価の定量
   注: 時間を節約し、サンプルの操作を減らすために、ワンステップの qRT-PCR キットをお勧めします。プローブベースのアッセイは、ウイルス配列の検出の特異性を高めるために使用されます。
   1. 既知量のウイルス配列の標準曲線を作成する(補足図S2A、B)。
      注:これは、NDV L遺伝子の合成500 bp二本鎖DNA断片を購入することによって行うことができます。NDV L遺伝子の500 bp断片の配列は、 補足図S2Cに見ることができる。
   2. ウイルスDNA断片(通常、製造業者によってナノグラムまたはフェムトモールとして提供されている)の量を、アボガドロの数および分子に対するモル数式(Eq (1))を使用して、DNA断片の分子またはコピー数に変換する。
      (1)
   3. 1.00 × 10 10 コピーから 1.00 × 10 0 コピーまでの^既知の ウイルス DNA フラグメント コピーの¹⁰ 倍の希釈シリーズを調製して、標準曲線サンプルを調製します。
   4. 未知のサンプル中のNDV RNAの量を決定するために、RNA抽出キットを用いてNDV RNAを抽出する。キットに付属のプロトコルに従ってください。RNA が抽出されたら、ワンステップ qRT-PCR キットに記載されている推奨プロトコルに進みます。
   5. 以下の温度およびサイクリング条件でリアルタイムPCR装置で反応を実行します:1)55°Cで10分間の逆転写の1サイクル;2)95°Cで1分間の初期変性を1サイクル;3)変性(95°Cで10秒)、伸長(60°Cで30秒)、蛍光シグナル取得の40サイクル。
   6. qRT-PCRアッセイが完了したら、リアルタイムPCR機器ソフトウェア(補足図S2A、B)を使用して、標準曲線サンプルに基づいて標準曲線を生成します。
      注:ソフトウェアは、標準曲線に基づいて未知のサンプル中のNDV RNAの量も計算します。
5. マウスの急性毒性に対する安全性試験
   1. 1 ×¹⁰⁸ PFUのウイルスを尾静脈 を介して 静脈内注射し、8週齢のBALB/Cマウス3匹に急性毒性を評価した。
   2. 体重減少(>20%)、むしゃぶりついた姿勢、フリルのついたコート、嗜眠、呼吸の変化などの有害事象についてマウスを監視します。最初の48時間に毎日3〜4回評価します。マウスは48時間後に回復し始めるはずなので、完全に回復するまで毎日1〜2回監視してください。
      1. 生理食塩水を皮下投与し、必要に応じて支持療法を行う。例えば、回復ダイエットジェル、ピーナッツバター、またはヒートパックを使用してください。動物ケア施設のガイドラインで概説されているように、エンドポイント基準に達したマウスを、イソフルランの過剰摂取とそれに続く子宮頸部脱臼によって安楽死させる。

アラント系液体の収穫
胚発生鶏の卵からアラント液が採取されるので、それは透明で透明に見えるはずです。流体が不透明で黄色く見える場合は、汚染物質の存在を示します。精製中にこのアラント液を含めると、圧力が急速に上昇し、10psiを超え、ウイルスの剪断および感染性ウイルスの損失をもたらすため、精製プロセスが妨げられる。血まみれに見えるアラントイック液は、卵にあまりにも多くのウイルスのPFUを接種したことを示唆している。この卵のバッチからの収量は予想よりも大幅に低く、このウイルスが インビボで 使用できる可能性は低いです。レンズ原性NDVを接種した卵子は、 図1で視覚化されているように、72時間経過しても血管系が明らかであり、胚は死んではいなかったはずです。もしそうであれば、これは胚が何らかの形で損傷または汚染されていることを示唆しています。

ヨウジキサノール密度勾配超遠心
超遠心分離に続いて、高力価の白色NDV含有バンドを10%と20%のグラデーションの間に配置する必要があります(図4B)。

SDS-PAGEゲルのクーマシー染色
図5は 、未精製(レーン2)と精製ウイルスストック(レーン3)の違いを示す。両者を比較すると、汚染タンパク質バンドの強度の有意な減少と、精製ウイルスストック中の優勢NDVバンドの出現が示されている。

TCID 50によるウイルス力価の定量
NDVの濃縮ストックを力価計算する際に推奨条件を使用する場合、CPEは24時間後に明らかになるはずです(図6)。同様の力価のレンズ原性株NDVと比較して、CPEは、同じ時点で中原性株においてより顕著である。

生後8週齢のBALB/Cマウスにおける急性毒性解析
1×108PFU を静脈内投与した場合、マウスは体重減少>20%、フリルコート、むしゃぶりついた姿勢、異常な呼吸などの有害作用について監視されるべきである。最初の24〜36時間以内に、マウスは体重を減らし始め、フリルのついたコートとぶら下がった姿勢を発達させる可能性があります。しかし、ウイルスが十分に純粋であれば、体重増加および36時間後の姿勢およびコート状態の改善によって観察されるように、マウスは回復し始める。これらの回復の兆候を36時間も示さないマウスは、エンドポイント基準について引き続き注意深く監視されるべきである。典型的には、これは不正確な滴定のために、潜在的にウイルス粒子の凝集のために起こった。

図1:特定の病原体を含まない受精鶏卵からのNDVの感染と収穫(A)胚移動に加えて9日間の孵卵後に明らかになるはずのウェブ様血管系(矢印)。「X」は、絨毛膜と空気腔との間の界面、および卵の接種のために穴を開けるべき場所を示す。(B)死んだ胚を描いた画像。ウェブのような血管系がないことに注意してください。胚の動きの欠如も観察されるであろう。(c)空気腔、卵黄嚢、羊膜嚢、絨毛膜、およびアラント液の位置を示す受精鶏卵の成分の図。(d)脈絡膜を露出させるためのシェルの除去。(E)絨毛膜の開口部に続いて、アラント液および胚がどのように見えるべきかを示す。略語:NDV =ニューカッスル病ウイルス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:デプスろ過に使用される装置の一般的なアセンブリを概説する概略図。圧力計がデプスフィルターの上流に取り付けられていることを確認します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:異なる構成での接線流ろ過のセットアップ。矢印は流体の流れの方向を示します。 (A)TFFカセットの組み立て方法の説明図。(B)流体の精製および濃縮時に使用される「オープン」構成のTFFシステムの概略図。(C)流体がシステムから溶出されるとき、ウイルスおよび洗浄溶液の溶出時に使用されるTFFセットアップの概略図。(d)TFFシステムの洗浄中に使用される「閉じた」構成におけるTFFシステムの概略図。略語:TFF = 接線流ろ過。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:TFFから濃縮されたウイルスの超遠心分離および透析による密度 勾配(A)イオジキサノール密度勾配の組成を示す模式図。(b)精製工程中にML緩衝液を用いて作製したウイルスの超遠心後のウイルスバンディングパターン。主なウイルス含有バンドは、黒い楕円形で示されます。(C)透析手順の終了時にヨウジキサノール勾配を介して調製された10mLのウイルスをロードした透析カセットの典型的なサイズ。略語:TFF =接線流ろ過;ML = マンニトール - リジン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:クーマシー染色SDS-PAGEゲル。 ゲルは、1×105PFU をロードしたときの未精製(レーン2)および精製(レーン3)メソゲンNDVストック間の汚染タンパク質の存在を比較する。レーン1および4=分子量ラダー(MW)。NDV HN、F0、および切断後のそのサブユニット、F1 およびF2、ならびにそれらのそれぞれの分子量27 は、白色フォントで示されている。略語:SDS-PAGE=ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動;NDV = ニューカッスル病ウイルス;PFU = プラーク形成単位;HN = ヘマグルチニン;F0 = フュージョン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:TCID50によるウイルス力価の決定に使用した96ウェルプレートレイアウトの例。 プレートは12カラムに分割され、各カラムは異なる連続希釈を表す。陽性ウェル(CPE、導入遺伝子発現、またはIFAのいずれかによって決定される)は灰色で示されます。この例の陽性ウェルの数を考えると、スピアマン・カーバー力価計算機(表2)を使用した後の予想力価は、TCID50/mLとPFU/mLの両方にリストされています。略語:TCID50= 組織培養感染用量の中央値;CPE = 細胞変性効果;IFA = 免疫蛍光アッセイ;PFU = プラーク形成単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:DF1細胞をレントゲン性またはメソゲン性NDVに感染させた後のCPEの比較。DMEM + 15% FBS、DMEM + 15% FBS + 5% allantoic fluid、またはDMEM + 2% FBS + 125 μg/mLトリプシンの異なる培養条件下での10時間のインキュベーション(A-D)または24時間のインキュベーション(E-H)後に、0.5のMOIを使用した。スケールバー = 200 μm。略語:CPE =細胞変性効果;NDV = ニューカッスル病ウイルス;MOI = 感染の多重度;FBS =ウシ胎児血清;DMEM = ダルベッコのモディファイドイーグルの媒体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:GFP導入遺伝子を欠くレント原性NDVを力価決定するためにIFAが必要な状況の例。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。