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方法論記事

循環器死ドナー心臓を用いた異所性ラット心臓移植モデル

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DOI:

10.3791/63844

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2022年5月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Department of Surgery, Virginia Commonwealth University, 2Pauley Heart Center, Virginia Commonwealth University Health System, 3Department of Surgery, McGuire Veterans Administration Medical Center, 4Department of Pharmacotherapy and Outcome Science, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 5Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Virginia Commonwealth University

この記事について

サマリー

ここでは、循環死ドナー心臓を利用したマウス異所性心移植の調製と技術的な詳細について述べる。

要約

このプロトコルの目的は、循環器死 (DCD) ドナー心臓後の提供を伴うラット異所性心臓移植モデルを設定することです。このプロトコルには、心臓ドナー設定とレシピエント設定の2つの設定があります。心臓ドナーのセットアップでは、Sprague Dawleyラットに麻酔をかけ、気管内に挿管し、換気を行います。右頸動脈にカニューレを挿入して、ヘパリンと麻痺薬の臭化ベクロニウムを送達します。DCDプロセスは、換気を終了することによって開始されます。20分後、心臓が露出し、腕頭枝の遠位にある大動脈が固定されます。人工呼吸器の終了から 25 分後に、氷のように冷たいウィスコンシン大学 (UW) の溶液が頸動脈カテーテルを介して灌流され、心臓が洗い流されます。心臓は、大動脈、肺動脈、大静脈、肺静脈を分割して調達し、UW溶液に貯めて着床します。レシピエントのセットアップでは、ルイスラットをイソフルランで麻酔します。徐放性ブプレノルフィンは、術後のスムーズな回復を促進するために皮下投与されます。正中線腹部切開を通じて、腎下大動脈と下大静脈を分離し、非外傷性血管クランプで固定します。ドナーの心臓大動脈と肺動脈は、それぞれレシピエントの腹部大動脈と大静脈に縫合され、8-0プロレーヌ。血管クランプを取り外して心臓を再灌流します。腹壁を閉じ、ラットを回収する。設定された間隔(24時間から2週間)の後、レシピエントラットに麻酔をかけ、移植した心臓を露出させ、バルーン先端カテーテルを頂点を介して左心室に挿入し、データ収集システムを使用して発達した圧力とdP / dtを記録します。心臓組織は、組織学、免疫学、または分子分析のために収集されます。DCDドナーラット心臓移植モデルが成功すれば、DCDドナーからの心臓移植転帰を改善するための心臓保護アプローチに関するさらなる研究が可能になります。

概要

心臓移植(HTx)の小動物モデルは、移植された心臓に影響を与える病態生理学的状態を研究する研究を行うために重要です。OtoとLindseyによって記述されたように、マウスモデルにおけるヘテロトピアHTxは、研究者が虚血および再灌流の条件で観察される病態生理学的変化を研究することを可能にしました1。伝統的に、移植用のドナー心臓は、脳死後ドナー(DBD)ドナーとしても知られる鼓動する心臓ドナーから調達されてきました。しかし、HTx2を必要とする患者の数は不釣り合いに増加しています。最近では、循環死ドナーからの心臓、または循環死後ドナー(DCD)ドナーとも呼ばれ、実験環境での移植に使用されています3。DBDとDCDドナー心臓の主な違いは、後者では、心臓はさまざまな期間の虚血にさらされるため、日常的なHTx診療での使用が不可能であることです。

マウスのヘテロトピー性HTxに関する前述の文献は、鼓動する心臓ドナー条件のみを利用しています4,5,6。ヘテロトピア性DCD心臓移植には微妙な修正が必要であり、それなしでは移植された心臓は鼓動しません7。このプロトコルは、ラットにおけるDCD HTxの洗練された技術を読者と共有することを目的としています。全体的な心筋虚血は、DCD臓器提供に先天的です。全体的な心筋虚血を模倣した実験セットアップは、ex vivoセットアップ5でのみ研究されています。ex vivo 研究の結果は、in vivo (DCD) と ex vivo の全球虚血モデルとの間に有意差が存在するため、DCD HTx 研究には適用されない可能性があります5。ex vivoモデルで再灌流心筋虚血を緩和するための介入から得られる結果、またはその欠如は、DCD HTxモデルでは再現できない場合があります。したがって、ヒトDCD HTxを動物モデルでシミュレートすることが不可欠であり、その結果はより高い並進値を持つことができます。ここで説明するDCD HTxモデルにより、研究者は臨床DCD HTxを綿密にシミュレートし、ドナーの心臓とレシピエントの両方への介入を通じて再灌流障害を軽減する機会を提供できます。レシピエントラットが回復すると、移植された心臓の機能、組織病理学、および免疫学を移植時からさまざまな間隔で研究できます。

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プロトコル

すべての動物実験は、施設のガイドラインと、国立衛生研究所が発行した実験動物のケアと使用に関するガイド(NIH Publication No. 86-23, revised 2011)8に従って実施されました。以下の手順は、バージニアコモンウェルス大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、OSHA(労働安全衛生局)のガイドラインと推奨される滅菌技術9に従って行われました。Sprague Dawleyラットは、23°Cの温度と12時間の暗/明サイクルで制御された湿度の下で飼育されました。

1. ラボのセットアップ

注:手術用顕微鏡で無菌のげっ歯類の生存手術を行うための専用スペースを割り当てます。手術室の周囲温度を暖かく保ちます。手術と回復プロセスの両方に加温パッドを使用することは、レシピエントラットの体温を維持するために不可欠です。

  1. 注射器、生理食塩水0.9%(NaCl)、麻酔薬(イソフルラン、ケタミン/キシラジン)、ヘパリン、臭化ベクロニウム、保存液、アイスバケツ、鎮痛剤(ブプレノルフィン徐放性)などの必需品(材料表)を備蓄し、すぐに利用できるように保管してください。
  2. 顕微手術器具(図1A、B)を術野にきちんと置きます。汚染された必須器具をすぐに洗浄するために、フラッシュ滅菌キットをすぐに利用できるようにしておいてください。

2. In vivo ラットDCDドナー調製

  1. ラットに麻酔をかけ、気管挿管と頸動脈カニューレ挿入を行います。Sprague Dawleyラット(8〜12週齢)を3%イソフルランチャンバーで鎮静し、ケタミン/キシラジン(100/10 mg / kg、筋肉内)で麻酔します。.
  2. 気管と右頸動脈を露出させるには、完全に麻酔をかけたラットの仰臥位を置き、アルコールとポビドン溶液で首と胸の前部を洗浄します。.V字型の切開を行い、Vのピークを正中線のラットの顎に近づけ、Vの各肢が対応する肩を指すようにします。皮下組織から皮膚を分離し、皮膚を胸に裏返して首のストラップ筋を露出させます(図2A)。
    1. 正中線ストラップ筋(胸骨乳様突起筋と胸骨舌骨筋)を鉗子で分離して気管を露出させることにより、ラットに挿管します(図2B)。気管を5-0シルクで囲み、気管リング間の筋肉組織を部分的に分割して開きます。
    2. 14 Gの血管カテーテルを気管に挿入し、5-0シルクで固定します(図2C)。血管カテを人工呼吸器に接続します(90呼吸/分で1 mL / kg)。
    3. 右頸動脈カニューレ挿入術の場合は、総頸動脈(気管と平行ですぐに右側にある)を特定し、首の全長まで慎重に分離し、遠位(頭蓋)の端を5-0シルクで結びます。
    4. 頸動脈のカニューレ挿入を容易にするために、牽引のためにタイの自由端に止血器を取り付けます。
    5. 頸動脈の近位端(首の付け根に向かって)を動員し、血管止血剤を使用してクランプします。手術用顕微鏡で、マイクロアイリスハサミを使用して、頸動脈を最も遠位端の前方に部分的に分割することにより、頸動脈を開きます。頸動脈を22G血管カテでカニューレし、5-0シルクタイで固定します(図2D)。
    6. 血管腫に三元フローストップコックアダプターを取り付けて、薬物や心臓麻痺溶液を頸動脈に簡単に送達し、圧力センサーに接続してDCDプロセス中の心拍数と圧力を監視します(図2D)。近位血管クランプが解放されると、血液の拍動性逆流に注意する必要があります。
    7. 固定したら、頸動脈カテーテルを圧力センサーに接続し、ヘパリン(1,000 U/Kg)と臭化ベクロニウム(4 mg/kg)を送達します。
    8. DCDプロセスの開始:臭化ベクロニウムを1分間循環させます。動物の苦痛の兆候がないか注意し、必要に応じて追加の麻酔を提供します。人工呼吸器(低酸素症/虚血)を停止して、DCDプロセスを開始します。呼吸活動がないことを観察します。
      注:DCD虚血時間は、人工呼吸器のサポートが引き抜かれた時点から始まります。ラットでは、25 分間の虚血が、重大ではあるが可逆的な損傷をもたらす最大時間として特定されています7。圧力トレースは、~3.5分で換気サポートが中断された瞬間から、全身圧力が50mmHg未満に低下し、心臓を効果的に灌流するには不十分と見なされる圧力であることを示しています(図3)。
  3. ドナーの心臓調達: 心臓の調達と冷温心麻痺の投与に 4 ~ 7 分を割り当てます。目標の虚血時間である25分を達成するためには、換気サポート終了後18〜21分後に心臓の調達を開始します。
    注:調達時間の長さは、調達を実行する人の経験に基づいて変更してください。
    1. 剣状突起のレベルから始めて、肋骨縁に沿って腹壁を分割し、次に胸郭を両側の胸骨に平行に鎖骨まで分割して、両側の前方開胸術を行います(図4A)。このステップを容易にするために、低倍率(5倍)で手術用顕微鏡を使用します。
    2. 鎖骨にヒンジで固定された分割された胸壁を頭に向けて反転させ、止血器で固定します(図4B)。
    3. 下大静脈(IVC)を5-0シルクで囲み、肝臓のドームの近くでマイクロハサミで部分的に分割します(図4C)。部分的に開いたIVCは、心臓の右側を広げるため、心臓麻痺の出口を可能にします。
    4. 上行大動脈と肺動脈(PA)の間の平面を解剖し、次に、先端が鈍く湾曲した鉗子で横静脈洞を介して肺幹を分離します。マイクロハサミで肺動脈を分岐点の近くで慎重に分割します(図4C)。
    5. 大動脈弓を鈍的解剖で囲みます。これは、小さな直角血管クランプを無名動脈の起点から遠位の大動脈弓を横切って配置するためのアクセスを可能にするためです。
    6. 人工呼吸器の終了から25分のマークで、大動脈弓をクランプし、手動で心臓麻痺(ウィスコンシン大学の溶液10 mLを4°Cで2〜3分かけて)を頸動脈カテーテル(図4D)を通じて送達します。
    7. マイクロハサミを使用して、大動脈弓の手前で上行大動脈を遠位に分割します(図4E)。
    8. IVCを5-0シルクで心臓に向けて結び、遠位に分割します。
    9. 肺静脈と上大静脈(SVC)を5-0シルクと一緒に結紮します(図4F)。これらのネクタイは大量の組織を保持するため、器具のネクタイよりも手のネクタイが好まれます。綿先綿棒で心臓を腹部に向かってそっと引き下げ、心房付属器をネクタイに束ねずに肺静脈結紮を促進します。
    10. マイクロアイリスハサミで肺静脈を分割し、心臓を採取し、氷冷した生理食塩水に入れます(図4G)。

3. in vivo ラットDCDヘテロトピア性心移植

  1. イソフルランチャンバー(3%誘導)でレシピエントを鎮静させ、腹部の髪をクリップし、ポビドンとアルコールでその領域を洗浄します。.レシピエントを抗凝固させないでください。これは、吻合からの過度の出血と移植片の失敗につながります。
  2. ラットの仰臥位を加熱パッドの上に置きます。ラットと加熱パッドの間にプローブを配置して、温度を監視します。ラットの体温を38°Cに保ちます。 ラットの腹部の両側に、温かい生理食塩水またはガラスビーズを充填した50mLの滅菌済み遠心チューブを2本置き、ラットを暖かく保ちます。
  3. 上記の手順にもかかわらず、体温が37.5°C未満に下がった場合は、室温(RT)を上げ、オートクレーブ滅菌されたアルミホイルを使用して体の露出部分をすべて覆い、腹部手術を行うのに十分な領域を残します。
  4. ノーズコーンを介して3%イソフルランで全身麻酔を誘発し、徐々に2%まで減少させます。.
  5. linea-albaに沿って腹部を開き(図5A)、腹壁リトラクターを配置して作業スペースを露出させます(図5B)。
  6. 滅菌綿チップアプリケーターを使用して、拡張した結腸または完全な結腸を移動させ、オペレーターの左側にある温かく湿ったガーゼに入れ、温かい(38°C)生理食塩水で定期的に洗浄します(図5C)。結腸を脇に動かすと、DCD心臓は非常に硬く、腹部に収容するために追加のスペースが必要なため、DCD心臓により多くのスペースが提供されます。
  7. 綿先綿棒を使用して鈍い解剖で正中線の後腹膜を開きます。腎下大動脈とIVCを露出させます。
  8. 非外傷性小児多角度血管クランプを使用して、吻合のために腎下大動脈とIVCの3〜5mmを分離します(図5D)。
  9. 100単位のヘパリンを混合した生理食塩水で満たされた1cm3 シリンジに30Gの針を取り付けて大動脈に入ります。0.2〜0.3mLの溶液でフラッシュします(図5E)。ヘパリンが吸収され、縫合線からの出血を引き起こす可能性があるため、滅菌綿チップアプリケーターで余分な溶液を軽くたたきます。
  10. マイクロハサミを使用して、ドナーの大動脈のサイズに合わせて長軸に沿って大動脈を開きます。この時点ではIVCは開かず、IVCと大動脈の間に平面を作ろうとはしません。これは出血につながります。
  11. 吻合中のドナーの心臓の適切な向きは重要です(図5F).右心室の前面が天井を向いており、頂点がオペレーターの右側を指し、ドナー大動脈が肺動脈よりわずかに低くなるように、吻合のためにドナー心臓を向けます。この向きにより、肺動脈吻合部への緊張が軽減されます。
    1. 大動脈吻合:微小血管吻合には、先の尖った針ドライバーと精密ピンセットを使用します。8-0で吻合を行います0.3mmの先端ニードルホルダーに装填されたテーパー状の4mm針にモノフィラメント縫合糸を装着し、ニードルドライバーロックを取り外して、ロックおよびロック解除時の偶発的な組織外傷を防ぎます。
    2. 大動脈吻合の6時位置にステー縫合糸を留置します。これは、対称的で止血性の縫合ラインを提供するために行われます。次に、12時の位置から、ドナー大動脈の外側から内側へ、レシピエント大動脈の内側から外側に吻合を開始します(図6A、B)。作業用縫合糸は5〜7cmのみ保持し、残りは切り捨てます。
    3. 反時計回りに動き、6時の位置に向かって短い距離を移動し、心臓を左に反転させて12時の位置まで反時計方式で吻合を完了します(図6C)。
    4. 結ぶ前に縫合線が緩んでいないか確認してください。
      注:安全な吻合は対称的である必要があり、隙間なくドナーとレシピエントの内膜に近似する必要があります。
    5. 肺動脈吻合:肺動脈を大動脈から解放し、ねじれなくIVCに吻合の向きを合わせます。ドナーの心臓を満たすためにレシピエントの血液量を準備し、3〜5 mLの皮下(首のうなじ)生理食塩水を注射して低血圧を回避します。
    6. ラットの呼吸パターンを監視し、肺動脈吻合が完了に近づいているため、イソフルランを2.0%から1.5%に減らします。.
    7. 大動脈吻合に関連してIVCセファラッドをマイクロ虹彩ハサミで開きます(図6C)。0.2〜0.3mLの生理食塩水を使用してIVCを洗い流します。少数の血栓が見られます。それらを慎重に洗い流します。
    8. 大動脈吻合とは異なり、滞在縫合なしで肺吻合を開始します。露出を妨げます。12時の位置から開始し、針をドナー肺動脈の外側から内側に、レシピエントIVCを内側から外側に移動します。縫合糸を結び、まず後壁の吻合を時計回りに完了します。
    9. 6時の位置になったら、12時の位置に達するまで時計回りに縫合を続け、前のタイの縫合糸の短い方の端に結びます。狭窄すると心臓からの静脈ドレナージが制限されるため、吻合を締めないように注意してください。平均して、両方の吻合を完了するのに30分以内かかります。
    10. 針穴からの出血を封じ込めるために、吸収性止血剤の小片を吻合の上に置きます。
    11. 血管のクランプを解除し、必要に応じて針穴に吸収性止血剤を追加します(図6E)。移植された心臓は、リズミカルな呼吸を再開する前に、時折細動を伴って鼓動を開始します。心臓が鼓動し、明らかな出血がない限り、吸収性止血剤を5分間そのままにしておきます。
    12. 止血に満足したら(3~5分)、滅菌綿チップアプリケーターを使用して余分な吸収性止血剤を取り除き、生理食塩水で洗浄し、腸を腹腔に戻します(図6F)。止血を助けるために、大網を吻合の上に置きます。
    13. 最初にlinea albaを閉じ、次に皮膚を閉じることにより、13 mmの切断針に5-0 monocrylを使用して腹壁を2層に閉じます(図6G、H)。

4. 復旧と監視

  1. 腹部閉鎖が完了したら、回復のために暖かいパッドでラットを腹に向けます。ノーズコーンを介してイソフルランを1%で5分間続け、その後停止します。.
  2. 自発呼吸が規則的になったら、ラットを清潔な回復ケージに移し、暖かいパッドの上に置いて回復プロセスを続けます。ラットの突然の動きは、出血のリスクや吻合のねじれを引き起こします。手術開始前に長時間作用型鎮痛薬を投与することで、スムーズな回復過程を大いに促進します。

5. 制御鼓動心臓の調達と移植

  1. 虚血がない場合のドナー心臓の質を評価するためのコントロールとして、コントロールビートハートドナー(CBD)心臓を調達します。
    注:CBDドナーは、換気サポートの終了を除いて、DCD心臓について説明したすべての手順を経ます。CBDの心臓は、鼓動しながら調達され、人工呼吸器で完全に支えられます。心臓麻痺の投与は心臓を停止し、DCD心臓の場合と同様に調達と移植が完了します。

6.移植された心機能評価:

  1. 心臓移植時から所定の間隔(24時間から14日)で、レシピエントラット(3%吸入イソフルラン)に麻酔をかけ、温かいパッド仰臥位に置き、腹部切開を開いて移植した心臓を露出させます。
  2. 左心室の頂点にバルーンチップカテーテルを留置し、発達圧力(DP)、最大+dP/dt、および最小-dP/dtを測定します。
    注:ここでは、PowerLabステーションを血圧記録のデータ収集システムとして使用しました。

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結果

異所性心臓移植の24時間から14日後、腹部を再度開き、心臓を露出させて左心室によって発達した圧力を測定することができます。DCD(またはCBD)心臓の左心室にバルーンチップカテーテルを挿入し、発達圧力(DP)、最大+dP/dt、および最小-dP/dtを測定します。 図7 は、移植後24時間後のCBD心臓と比較したDCD心臓の予想されるDP、+dP/dt、および-dP/dtの例を示しています。CBD心臓と比較して、DCD心臓のDPは大幅に低下し、+dP/dt(max)と-dP/dt(min)が悪化しました。

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図1:異所性ラット心臓移植に使用される微小血管器具( 1)先端が湾曲した...

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ディスカッション

DCDヘテロトピアラットHTxを成功させるためには、実験の細心の注意を払って思慮深いセットアップを確立することが重要です。詳細なセットアップでは、1)若いラットをDCDドナーとして選択する、2)イソフルランを麻酔薬として選択すること、3)ドナーの心臓に心臓麻痺を効果的に送達すること、4)ドナーの心臓を氷冷溶液で保存すること、5)腰部血管を損なうことなく腹部解剖を制限し、腎下大動脈と大静脈のみを露出させることなど、いくつかの要素を考慮に入れています。 6)手術中および手術後にレシピエントの体温を維持する、7)吻合のためにIVCと大動脈を分離できる無血管クランプを利用する、8)レシピエント腹部に硬いDCDドナー心臓のための十分なスペースを確保する、9)微小血管器具の選択、10)レシピエントの抗凝固療法を避ける、11)細心の止血吻合、 12)手術からのスムーズな回復のための先制鎮痛を提供します。ここで説明するプロトコルは、結果を正常に再現するためのすべてのステップの詳細を提供します。

ここで述べるDCDラットHTx法は、...

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開示事項

この原稿の著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、モハメッド・クアダー博士に授与されたメリットレビュー助成金(1I01 BX003859)と、ポーリーハートセンターからモハメッド・クアダー博士とステファノ・トルド博士への資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5-0 ナイロン縫合糸 ポリアミドモノフィラメントAros SurgicalSP17A05N-45
5-0 シルク縫合Surgical SpecialtiesSP116
8-0 モノフィラメント縫合糸Aros SurgicalT06A08N14-13
AutoclaveSterisAmsco Lab 250
BD Insulin Syringe with Detachable Needle 1 mL SyringesFisher Scientific14-820-28
BDシリンジ(Luer-Lokチップ付き)(針なし)10 mLシリンジFisher Scientific14-823-16E
Belzer ウィスコンシン大学低温保存溶液Bridge to Life イリノイ州ノースブルック 米国アデノシン1.34 g / L、アロプリノール0.136 g / L、グルタチオン0.922 g / L、ラクトビオン酸(ラクトンとして)35.83 g / L、硫酸マグネシウム七水和物1.23 g / L、五芒星50 g / L、 水酸化カリウム 5.61 g/L、リン酸カリウム 1塩基性 3.4 g/L、ラフィノース五水和物 17.83 g/L
Buprenorfin SR LabZoopharm LLC
Debakey 非外傷性小児多角血管クランプAesculapF341T
Exel International Disposable Safelet I.V. カテーテル 14 GFisher Scientific14-841-10
Exel International Disposable Safelet I.V.カテーテル 22 Gフィッシャーサイエンティフィック14-841-20
フォガティカテーテルサイズ 4Fエドワンズライフサイエンス120404F
湾曲した先端を持つ鉗子正確な外科手術 &サイエンティフィック・インスツルメンツ・コーポレーションASSI.228
ゲイマー ヒーティング ポンプブレインツリー サイエンティフィック、ブレインツリー、マサチューセッツ州、米国TP700
Germinator-500ブレインツリー サイエンティフィック
ヘパリン ナトリウム注射、USP 1,000 U/mLファイザーNDC 0069-0137-01
アイリス マイクロハサミ ストレート チップ正確な手術 &サイエンティフィック・インスツルメンツ・コーポレーションASSI.5253
イソフルラン USPパターソン 獣医NDC 14043070406
ケタミン HCl 100 mg/mLヘンリー・シャインNDC 6745710810
リドカイン HCl 2%アスペン 獣医07-892-4325
マッケソン ジェネラル メディカル 6IN Q-TIPS 2STER WOOD 100/PACKフィッシャー サイエンティフィックNC0650323 滅菌済みコットンチップアプリケーター
マイクロハサミ、直角、湾曲したチップブレインツリーサイエンティフィックSC-MS 154
ニードルホルダー正確な手術用 &サイエンティフィック・インスツルメンツ・コーポレーションASSI.ロック機構が削除された
通常の生理食塩水バクスター注入は
、PowerLabステーションADインスツルメンツ、デンバー、COデータ収集システム
水酸化ナトリウム/塩酸溶液をpH 7.4
Sprague Dawleyラットの男性、8&ndashに調整します。生後16週、<重量400g
手術用顕微鏡LeikaModel M525 F40
SurgicelEthicon吸収性止血
温度プローブ Therma 防水タイプT 高精度熱電対計ThermoworksTHS-232-107
高精度ポイント付きピンセットExcelta17-456-109
臭化ベクロニウムSigma-AldrichPHR1627PBS で 100 mg/mL Ventelite
Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA
Xylazine 100 mg/mLPivetal AnasedNDC 04606675002
糸 BSL158を供給します 剤

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