Method Article

消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術

DOI:

10.3791/63853

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May 2nd, 2022

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1Department of Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

In This Article

Summary

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この原稿の目的は、 KitV558Δ/+マウスモデルと、マウス標本の解剖と処理を成功させるための技術を説明することです。

Abstract

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胃腸間質腫瘍(GIST)は最も一般的なヒト肉腫であり、典型的にはKIT受容体の単一の変異によって駆動される。腫瘍の種類を超えて、次世代のがん治療法を調査するために、多数のマウスモデルが開発されてきた。しかし、GISTでは、ほとんどの in vivo 研究は、固有の制限を有する異種移植マウスモデルを使用する。ここでは、 KitV558Δ/+ 変異を保有する消化管間質腫瘍の免疫能を有する遺伝子操作マウスモデルについて説明する。このモデルでは、ほとんどのGISTの原因となる癌遺伝子である変異KITは、その内因性プロモーターによって駆動され、ヒトGISTに見られる組織学的外観および免疫浸潤を模倣するGISTにつながる。さらに、このモデルは、標的分子療法と免疫療法の両方を調査するために首尾よく使用されています。ここでは、 キットV558Δ/+ マウスコロニーの飼育と維持について述べる。さらに、この論文では、 KitV558Δ/+ マウスにおけるGISTの治療と調達、腸間膜リンパ節の排出、隣接する盲腸、ならびに分子および免疫学的分析のためのサンプル調製について詳述します。

Introduction

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GISTはヒトで最も一般的な肉腫であり、米国では約6,000例の発生率を有する1。GISTは、Cajalの間質細胞と名付けられた胃腸ペースメーカー細胞に由来するようであり、典型的にはチロシンキナーゼKITまたはPDGFRA2の単一の変異によって駆動される。手術はGISTの治療の柱であり、治癒的であり得るが、進行した疾患を有する患者は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)、イマチニブで治療することができる。20年以上前に導入されて以来、イマチニブはGISTの治療パラダイムを変革し、進行した疾患の生存率を1年から5年以上に改善しました3,4,5。残念なことに、イマチニブは後天的なKIT変異のために治癒することはめったにないので、この腫瘍には新しい治療法が必要です。

マウスモデルは、がんにおける新規治療法の調査において重要な研究ツールである。複数の皮下異種移植片および患者由来異種移植片モデルが開発され、GIST6,7で調査されている。しかし、GIS....

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Protocol

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すべてのマウスを、NIHガイドラインに従い、ペンシルベニア大学IACUCの承認を得て、ペンシルベニア大学で病原体を含まない条件下で飼育した。安楽死は、ペンシルベニア大学実験動物資源の標準作業手順に従って実施した。

1. キットV558Δ/+ マウス飼育

  1. C57BL/6Jマウスを用いて 、キットV558Δ/+ マウスをC57BL/6Jバックグラウンド上に10回以上バッククロスした。これを行うには、雄の キットV558Δ/+ マウスと雌のC57BL/6Jマウスを1:2の比率で繁殖させます。
    注:ホモ接合型キットV558 Δ/V558Δ遺伝子型は子宮内で致死的です。雌のキットV558Δ/+マウスと雄のC57BL/6Jマウスの交配は可能ですが、ごみの大きさは雌の野生型C57BL/6Jマウスの約半分です。さらに、雌のキットV558Δ/+マウスは、生後4ヶ月後に限られた同腹仔を産生する。
  2. つま先クリッピングにより生後7〜14日で仔犬を遺伝子型化し、 キットV558Δ/+

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Results

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KitV558Δ/+マウスモデルは、免疫適格マウスモデルにおける治療薬の調査を可能にします。キットV558Δ/+マウスの平均寿命は、進行性の腸閉塞により8ヶ月である(図4)。KitV558Δ/+マウスの腫瘍は、チロシンキナーゼKITおよび膜貫通チャネルDOG1(図5)、ならびに転写因子ETV1(図示せず)を含むGISTの正準マーカーを発現する。腫瘍は、下流マーカーERKおよびAKT(図6)、またはヒトGIST8、11、12

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Discussion

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KitV558Δ/+ マウスモデルは、GIST の分子および免疫学的解析における強力な研究ツールです。育種戦略では単一の交配が必要ですが、腫瘍応答を分析する実験でKitV558Δ/+マウスコホートを使用するには、広範な交配が必要です。マウスは、同様の腫瘍重量を確保するために年齢と性別が一致している必要があり、腫瘍が確立された8週齢前にマウスの10%が死亡する。CTやMRIなどの高度なイメージング技術を使用して個々のマウス内の腫瘍体積を追跡する場合、それほど広範囲ではない繁殖戦略が可能です。それにもかかわらず、KitV558Δ/+マウスは他のノックアウトマウスモデルまたは誘導性マウスモデルとの交配に成功し、重要な免疫および分子メカニズムを明らかにしました12。

KitV558Δ/+マウスの腫瘍細胞は、KIT(CD117)のカラムソーティングまたはフローサイトメ

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Disclosures

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著者らは、開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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キットV558Δ/+ マウスは遺伝子操作され、Peter Besmer10博士によって共有されました。この作業は、NIHの助成金R01 CA102613およびT32 CA251063によって支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100ミクロンフィルターEMSCO1194-2360
1x RBC lysis bufferLife Technologies00-4333-57
3mL syringeThermo Fisher Scientific/BD Biosciences14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX プレキャストプロテインゲル、10 ウェル、30 µlバイオ・ラッド4561083
4% パラホルムアルデヒド溶液サーモフィッシャーサイエンティフィックAAJ19943K2
40 ミクロンフィルターEMSCO1194-2340
5M NaClSigma AldrichS6546
70 ミクロンフィルターEMSCO1194-2350
AKT 抗体 (C67E7)Cell Signaling4691
C57BL/6J マウスジャクソン研究所
コラゲナーゼIVシグマ アルドリッチC5138
完全ミニ EDTA フリープロテアーゼ阻害剤トーマス・サイエンティフィC852A34
カウンテス II 自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィック
ディスポーザブルメスサーモフィッシャーサイエンティフィック/エクセルインターナショナル14-840-00
Dnase IThomas ScientificC756V81
Dog1 抗体abcamab64085
EDTASigma AldrichE9884
ERK 抗体 (p44/42)Cell Signaling9102
FBSThomas ScientificC788U23
FIJI softwareFIJIhttps://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 ホモジナイザーサーモフィッシャーサイエンティフィック15-340-169
HBSSペンシルベニア大学 Cell Center
Imatinib mesylateSelleck ChemicalsS1026
KIT 抗体 (D13A2)Cell Signaling3074
KitV558Δ/+ GenotypingTransnetyx
微量遠心チューブ(1.5mL)Thermo Fisher Scientific05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, BasicVector LaboratoriesBMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µmRio-Rad1620145
Nonfat Dry MilkThermo Fisher ScientificNC9121673
Nonidet P 40 SubstituteSigma Aldrich74385
p-AKT antibody (S473)Cell Signaling4060
p-ERK antibody (p44/42)Cell Signaling9101
p-KIT antibody (Y719)Cell Signaling3391
PMSF プロテアーゼ阻害剤サーモフィッシャーサイエンティフィック36978
プロイーナーゼKサーモフィッシャーサイエンティフィックBP170050
丸底ポリスチレン試験(FACS) チューブファルコン/サーモフィッシャーサイエンティフィック14-959-2A
RPMIペンシルベニア大学 セルセンター
フッ化ナトリウム(NaF)シグマ・アルドリッチ
201154 オルトバナジン酸ナトリウム (Na3VO4)Sigma AldrichS6508
SuperSignal West Dura Extended Duration SubstrateThermo Fisher Scientific34076
TBS buffer (10x)University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)Thermo Fisher Scientific/Falcon08-772E
TrisHCLサーモフィッシャーサイエンティフィックサイエン
Tween 20Rio-Rad1706531
 vivaCT 80プラットフォームScanco medical
ック ティフィック BP1757500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
  2. Joensuu, H., DeMatteo, R. P.

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