本プロトコールは、ブロイラー胚における脂肪組織から前駆脂肪細胞を単離するための簡単な方法を記載する。この方法は、高収率での単離、初代培養、および前駆脂肪細胞の脂肪生成分化を可能にする。オイルレッドO染色および脂質/DNA染色は、分化培地で誘導された単離細胞の脂肪生成能力を測定しました。
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この記事について
サマリー
要約
初代前駆脂肪細胞は、脂肪細胞の分化と代謝を制御する分子経路を理解するための貴重な実験系です。ニワトリ胚は、脂肪発生の初期段階から前駆脂肪細胞を単離する機会を提供する。この初代細胞は、前駆脂肪細胞の増殖および脂肪生成分化に影響を及ぼす因子を同定するために使用することができ、小児肥満および家禽における過剰な脂肪沈着の制御に関連する研究のための貴重なモデルとなる。出生後の脂肪組織の急速な成長は、ブロイラー鶏の筋肉成長から離れてそれを割り当てることによって効果的に飼料を無駄にします。したがって、脂肪組織発達の初期段階を理解する方法は、この傾向を調節し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する手がかりを提供する可能性がある。本研究は、市販のブロイラー(肉型)ニワトリ胚の発生脂肪組織から単離された前駆脂肪細胞の単離、初代培養、および脂肪生成分化のための効率的な方法を開発するために設計された。この手順は、高い生存率(〜98%)および成熟脂肪細胞への分化能力の増加を有する細胞を産生するように最適化されている。胚性前駆脂肪細胞の単離、培養、および分化のこの簡単な方法は、早期の脂肪の成長と発達の機能解析をサポートします。
概要
肥満は、成人と子供の両方にとって世界的な健康上の脅威です。太りすぎまたは肥満の子供は、成人として肥満になる可能性が約5倍高く、心血管疾患、糖尿病、および他の多くの併存疾患のリスクが著しく高くなります。2〜5歳の米国の子供の約13.4%が肥満1を有しており、過剰な体脂肪を蓄積する傾向が人生の非常に早い段階で動き出すことができることを示している。非常に異なる理由から、過剰な脂肪組織の蓄積はブロイラー(肉型)鶏にとって懸念事項です。現代のブロイラーは信じられないほど効率的ですが、生理学的に必要であるよりも多くの脂質を蓄積します2,3。この傾向は孵化直後に始まり、筋肉の成長から離れて割り当てることによって、最も高価な生産成分である飼料を効果的に無駄にします。したがって、子供とブロイラー鶏の両方にとって、非常に異なる理由にもかかわらず、脂肪組織の発達に影響を与える要因を理解し、人生の早い段階で脂肪膨張を制限する方法を特定する必要があります。
脂肪細胞は、前駆脂肪細胞から形成され、成熟した脂質貯蔵脂肪細胞を発達させるために分化を受ける脂肪組織由来幹細胞である。したがって、インビトロでの脂肪前駆細胞は、肥満研究のための貴重な実験モデルである。これらの細胞は、脂肪デポーの間質血管画分から単離され、脂肪細胞の分化....
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プロトコル
すべての動物の手順は、テネシー大学施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。受精したばかりの市販ブロイラー卵(Cobb 500)は、地元の孵化場から入手しました。卵を、胚発生日16〜18日目に解剖するまで相対湿度60%で38°Cでインキュベートした(E16−E18)。脂肪組織は、皮下(大腿骨)デポーから採取した。
1. 単離・培養の準備
- カルチャーフードと楽器を準備します。
- 解剖を開始する前に、層流フードに作業領域を設定します。作業領域とすべての機器を70%エタノールで拭いて消毒します。滅菌材料を使用してすべての手順を実行します。
注:容器および器具を細胞培養フードに戻す前に、必ず70%エタノールで綿棒で拭いてください。胚間で器具を容易に滅菌できるように、ボンネット内にベンチトップ器具滅菌器を配置することが推奨される。
警告: 器具滅菌器を使用する場合は、火傷や組織損傷を防ぐため、熱い器具を適切に冷却してください。最低冷却時間は3分を推奨します。使用前に70%エタノールで綿棒を拭きます。 - ストレート鉗子(120 mm)、ピンセット(110 mm)、2対の湾曲した鉗子(100 mm)、2対のストレートはさみ(140 mm)、湾曲した外科用はさみ(115 mm)、組織ストレーナー(250 μmナイロンメッシュ)、細胞ストレーナー(40 μmナイロンメッシュ)、円錐形遠....
- 解剖を開始する前に、層流フードに作業領域を設定します。作業領域とすべての機器を70%エタノールで拭いて消毒します。滅菌材料を使用してすべての手順を実行します。
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結果
初代前駆脂肪細胞は形態学的に線維芽細胞に類似しており、不規則で星のような形状と中心核を有する(図2A-C)。細胞は組織培養プラスチックに容易に接着し、付着後すぐに増殖し始める。それらは、培地中に脂肪酸を供給されると、脂質滴(図3D)を急速に分化し、蓄積する。ここで表わされる単離物において報告された生存率(色素排除に基づく98%)は典型的である。細胞はかなり堅牢ですが、単離中の積極的な取り扱いは細胞の損傷につながり(図3E)、付着が悪く増殖に失敗する細胞を生成します。微生物汚染を防ぐために組み込まれた手順にもかかわらず、非滅菌材料の移送が起こり得る(図3F)。それらの急速な増殖速度のために、ひよこ胚前駆脂肪細胞は、培地中のグルコースを高い速度で消費する。メディアは、エネルギーの供給を維持するために48時間ごとに交換する必要があります。<.......
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ディスカッション
いくつかのよく記載されたプロトコールが前駆脂肪細胞14、15、16、17の単離を報告しているが、胚性前駆脂肪細胞に対する単離は最適化されており、これはブロイラーひよこの初期脂肪の成長および発達の機能分析に使用することができる。このプロトコールは、高い分化能を有する高い生存率胚性脂肪細胞前駆細胞を生じる。さらに、前駆脂肪細胞を単離するための提示された手順は、胚に限定されず、孵化後のひよこにおいて使用することができる。しかし、それはE16胚での使用に最適化されており、孵化後のひよこからの収量は、ひよこが急速に成長するにつれて結合組織の相対量の増加による可能性が高い(表1)。
細胞単離の成功は、最終的に、付着した細胞の形状および数を観察することによって評価される(
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開示事項
著者らには開示するものは何もありません。
謝辞
著者らは、このプロトコルを支援し最適化してくれたUT AgResearchと動物科学科に感謝する。この作業はUSDAの助成金によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mLピペット | Eppendorf | Z683825 | シングルチャンネルピペット、100 - 1000 µL |
| 1 mL ピペットチップ | フィッシャーサイエンティフィ | 02-707-402 | |
| 100% イソプロパノール | フィッシャーサイエンティフィック | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL フラスコ | パイレックス | 4980-25 | |
| 37% ホルムアルデヒド | フィッシャーサイエンティフィ | F75P-1GAL | |
| 6 ウェルプレート | ファルコン | 353046 | 組織培養処理 |
| 96ウェルアッセイプレート | Costar | 3632 | |
| 96ウェルプレート、ブラックボトム | Costar | 3603 | 組織培養処理 |
| 済みアディポレッド | ロンザ | PT-7009 | |
| アムホテリシンB | Gibco | 15290026 | |
| ベンチトップワイパー(キムテックワイパー) | キンバリークラーク | 34155 | |
| タジン | アップ&アップ | NDC | 1167300334 20%ワーキングソリューション |
| セルカウンター | コーニング | 6749 | |
| セルストレーナー、40&マイクロ;m | SPL | 93040 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5702 | |
| チキン血清 | Gibco | 16110082 | |
| 円錐形遠心分離管、15 mL | VWR | 10025-690 | |
| 円錐形遠心分離管、50 mL | ファルコン | 352098 | |
| クライオバイアル | Nunc | 343958 | |
| 湾曲鉗子、100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| 湾曲した外科用ハサミ、115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| 蒸留水 | ミリポア | SYNSV0000 | 必要に応じて |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| エタノール | Decon Labs | 2701 | 70% ワーキングソリューション |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| 蛍光顕微鏡 | EVOS | M7000 | |
| 蛍光プレートリーダー | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap ヘビーデューティ アルミ ホイル、125 平方フィート | |
| 冷凍容器 | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| ゼラチン | ミリポア | 4055 | 2% ワーキングソリューション |
| 血球計算量計(計数チャンバー) | Corning | 480200 | 0.1 mm 深さ |
| インキュベーター | フィッシャーサイエンティフィック | 6845 | |
| 器具滅菌器 | VWR | B1205 | |
| リノール酸-オレイン酸酸-アルブミン | Σ | L9655 | 1x ワーキングソリューション |
| 顕微鏡 | Evos | AMEX1000 | |
| マルチチャンネルピペット | Thermo Scientific | 4661070 | 12チャンネルピペッター、30 - 300 µL |
| Na2HPO4Σ | S-7907 | ||
| NaH2PO4 | Σ | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| オイルレッド O | Σ | O-0625 | |
| オービタルシェーカー | IKA | KS130BS1 | |
| ペーパータオル | Tork | RK8002 | |
| パラフィルム | パラフィルム M | PM996 | |
| ペニシリン/ステプトマイシン (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri Dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri Dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | ロシュ | 11814389001 | |
| 試薬予約 | VWR | 89094-680 | |
| 小型ビーカー、100mL | レックス | 1000-100 | |
| 光度計プレートリーダーBiotek | ナジーH1 | ||
| 滅菌ガーゼ | マッケソン | 762703 | |
| ストレート鉗子、120mm | ロボズサージカル | RS-4960 | |
| ストレートハサミ、140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer、250 & micro;m | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water | Bath Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman グレード 1 濾紙 | Whatman | 1001-110 |
参考文献
- Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).
- Siegel, P. B. Evolutio....
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再版と許可
