眼表面炎症の誘導と関与組織の収集

サマリー

眼表面の炎症は眼の表面組織に害を及ぼし、眼の重要な機能を損ないます。本プロトコルは、マイボーム腺機能不全(MGD)のマウスモデルにおいて眼の炎症を誘発し、損なわれた組織を収集する方法を記載する。

要約

眼表面疾患には、角膜、結膜、および関連する眼表面腺ネットワークの機能と構造を乱すさまざまな障害が含まれます。マイボーム腺(MG)は、涙液膜の水性部分の蒸発を防ぐ被覆層を作成する脂質を分泌します。好中球と細胞外DNAトラップは、アレルギー性眼疾患のマウスモデルでMGと眼の表面に生息しています。凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)は、MG出口を閉塞し、MG機能障害を条件付ける細胞外クロマチンで構成されるメッシュ状のマトリックスを定式化します。ここでは、眼表面炎症およびMG機能障害を誘発する方法が提示される。角膜、結膜、まぶたなど、眼の表面に関連する臓器を採取する手順が詳細に説明されています。各臓器を処理するための確立された技術を使用して、MG機能障害の主要な形態学的および組織病理学的特徴も示されます。眼の滲出液は、眼の表面の炎症状態を評価する機会を提供します。これらの手順により、前臨床レベルでの局所および全身の抗炎症介入の調査が可能になります。

概要

瞬きするたびに、角膜上に分散した滑らかな涙液膜が補充されます。眼表面上皮は、眼表面上の涙液膜の分布および正しい配向を促進する。ムチンは角膜と結膜の上皮細胞によって提供され、涙腺から来る涙液膜の水性部分を目の表面に配置するのに役立ちます。最後に、MGは、涙液膜^1、2、3の水性部分の蒸発を防ぐ被覆層を作成する脂質を分泌する。このように、すべての眼器官の協調機能は、侵入する病原体や怪我から眼の表面を保護し、痛みや不快感なしに透き通った視力をサポートします。

健康な眼の表面では、眼を流れる分泌物または眼のリウマチがほこり、死んだ上皮細胞、細菌、粘液、および免疫細胞を一掃します。凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)は、細胞外クロマチンで構成されるメッシュ状のマトリックスを定式化し、これらの成分を眼のリウマチに取り込みます。AggNETは、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインのタンパク質分解によって炎症を解消します⁴。しかし、それらが機能不全になると、これらの異常なアグネットは、COVID-19⁵、胆石⁶、および唾液分泌症⁷の血管閉塞などの疾患の病因を引き起こします。同様に、眼表面のアグネットは保護的な役割を果たし、露出度の高い表面の炎症の解消に貢献します⁸。眼の表面に誇張された形成またはアグネットの欠如のいずれかが、涙液膜の安定性を損なうか、角膜創傷、瘢痕性結膜炎、およびドライアイ疾患を引き起こす可能性があります。例えば、MGの閉塞はドライアイ疾患の主な原因である⁹。AggNETは、MGの管からの脂質分泌の流れを塞ぎ、マイボーム腺機能障害(MGD)を引き起こすことも知られています。aggNETによるMG開口部の鬱血は、眼の表面を包む脂肪液と逆行性の瓶詰め液の不足を引き起こし、腺機能の機能不全と腺房損傷を引き起こします。この機能不全は、涙液膜の蒸発、まぶたの縁の線維化、眼の炎症、および^MG10,11への有害な損傷を引き起こす可能性があります。

ヒトにおけるMGDの病理学的過程を模倣するために、いくつかの動物モデルが長年にわたって開発されてきた。例えば、1歳のC57BL/6マウスは、50歳以上の患者の眼疾患の病理を反映して、ドライアイ疾患(DED)およびMGDに対する加齢に伴う影響の研究に役立っています^12,13,14。さらに、ウサギは薬理学的介入の効果を調査するための適切なモデルである。したがって、ウサギにおけるMGDの誘導は、エピネフリンの局所投与または13-シス-レチノイン酸(イソトレチノイン)の全身導入のいずれかによって報告されています15,16,17,18,19。.

これらの動物モデルは、MGDの病態生理に寄与するさまざまな要因を決定するのに十分でしたが、その利用には制限がありました。例えば、加齢性MGDのマウスモデルは、高齢者のみの要素を解読するのに理想的であり、したがって、ウサギは複数の病態生理学的メカニズムの調査を可能にするため、眼の表面疾患を研究するのに最も適した動物モデルであると考えられました。しかし、眼の表面でタンパク質を検出するための包括的な分析ツールがなく、ウサギゲノムの多くの部分が注釈されていないため、調査には制限されています^20,21。

さらに、ドライアイ疾患の病因を調査するために使用されたこれらの動物モデルは、眼表面の炎症を引き起こす障害の免疫学的アームを分析するための適切な詳細を提供しなかった。したがって、Ryesらによって開発されたMGDのマウスモデルは、マウスのアレルギー性眼疾患とヒトのMGDとの関連を示し、閉塞性^MGD21の原因となる免疫病因を強調しました。このモデルは、アレルギー性眼疾患を、結膜とまぶたに好中球を動員し、MGDと慢性眼の炎症を引き起こすTH17応答に関連付けます²¹。このマウスモデルにおけるMGDおよび眼の炎症の誘導は、進行中の免疫応答によって引き起こされる局所炎症の発生中の上流のイベントを調査するための貴重なツールです²¹。現在のプロトコルは、閉塞性MGDを伴う眼表面の炎症について説明しています。この方法では、マウスを免疫し、2週間後、免疫原を用いて眼の表面に7日間挑戦する。さらに、急性炎症および角膜、結膜、および眼瞼の解剖中に眼の滲出液および関連する眼器官を単離する手順が記載されている。

プロトコル

動物を含むすべての手順は、動物福祉に関する制度的ガイドラインに従って実施され、フリードリヒアレクサンダー大学エアランゲンニュルンベルク(FAU)の動物福祉委員会によって承認されました(許可番号:55.2.2-2532-2-1217)。本研究では、7〜9週齢の雌C57Bl / 6マウスを使用しました。マウスは市販の供給源( 材料表を参照)から入手し、12時間の昼/夜サイクルで特定の病原体のない状態に保たれました。

1.マウス眼表面炎症の誘発

1. 免疫のための免疫原調製を行う。
   1. 免疫原を新たに調製し、生理食塩水にオボアルブミン(OVA、50 mg / mL)と百日咳毒素(100 μg / mL)とアジュバント水酸化アルミニウム(40 mg / mL)( 材料表を参照)を1:1の割合で混合します。
      注意: 層流安全キャビネットで百日咳毒素の開封、再構成、および免疫原の準備を実行します。防護服を着用し、皮膚との接触を避けてください。
   2. 免疫原とアジュバントの混合物を室温で30分間インキュベートし、100 μLを1 mLシリンジにロードします。
   3. 免疫原溶液の腹腔内注射を無麻酔マウスに行う。
      1. ケージグリッドをつかみながら、マウスの尾をそっと持ちます。親指と人差し指の間の背中の皮膚と首の部分をしっかりと持ち、薬指と小指の間の尾と下肢を手のひらに固定します。
      2. 固定マウスの頭を下に向けてください。
      3. 調製した免疫原溶液100μLを下腹腔の左右象限に注入します。
2. 予防接種の2週間後に眼の表面チャレンジを行います。
   1. マウスをイソフルラン(2.5%)で麻酔する。
   2. 片目のOVA(50 mg / mL)または生理食塩水(0.9%NaCl)を両眼に5 μL塗布し、滴が目に吸収されるまで待ちます。これには~5分かかります。
   3. この手順を1日1回7日間繰り返します。
      注:薬の局所投与も同じ方法で行うことができます。

2.眼の滲出液の収集

1. チャレンジの直後に50 μLの滅菌生理食塩水を眼に塗布することにより、チャレンジ段階で形成された眼の滲出液を回収します。
2. シングルセル懸濁液を得るには、収集した眼の分泌物を補因子カルシウム(5 mM)を含む組換えMNase(2 x 10⁶ gel U/mL、 材料の表を参照)で37°Cで20分間処理します。
3. 室温で400 x g で7分間遠心分離します。
4. 上清を単離し、製造元の指示に従ってマルチプレックスELISAを使用してサイトカインとケモカインを測定します( 材料表を参照)。
   注:得られた上清はタンパク質分析に使用でき、ペレットはイムノフェノタイピング、食作用、脱顆粒、遺伝子発現などの機能アッセイに使用できます。

3.眼表面組織の切除

1. 以下の手順に従って、まぶたとアイグローブを解剖します。
   1. CO2窒息および頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
   2. マウスを平らな面に置きます。
   3. 70%エタノールを染み込ませた綿棒で目の周りの眼窩領域を消毒します。
   4. 耳と眼窩後洞の間、および扁平上皮骨の上の表面に沿って垂直に切開を行い、上顎骨に沿って下まぶたの下、前頭骨に沿って上まぶたの上を水平に切開します。これにより、目の周りに切開が形成されます(図1)。
   5. 湾曲した鉗子を使用して、解剖した組織を目の周りで慎重に保持し、組織と眼球を引き出します。
   6. 切除した臓器を滅菌PBSに入れます。
   7. 切除した上まぶたの周りの余分な顔の筋肉組織をメスと実体顕微鏡でトリミングします。
2. 以下の手順に従って結膜を収集します。
   1. 実体顕微鏡下で乾いたペトリ皿の上に上まぶたを置きます。
   2. 細いピンセットとメスを使用して、まぶたの内面から白っぽい粘液層を非常に穏やかに剥がします。
3. 次に、以下の手順で角膜を解剖します。
   1. ドライアイスの上にある新しいドライペトリ皿にアイグローブを3分間置きます。
   2. ペトリ皿を安定した位置でベンチの表面に持っていきます。
   3. 細かい鋭いハサミを使用して、辺縁の隣の角膜の境界に小さな切開を行います。
   4. 眼球の周りのメスで切開を延長し、強膜を角膜から分離します。
   5. 生理食塩水でたっぷりと洗い流すことによって角膜の裏側から虹彩と水晶体の残りを取り除きます。

4.マイボーム腺(MG)閉塞の文書化

1. MGとその開口部を評価するには、切除したまぶたを実体顕微鏡下で直立させます(図2)。
2. カメラの露光時間とISO設定に従って、白色光落射照明で画像をキャプチャします。
   注:これらの画像の形態測定分析は、腺の出口でのプラグサイズの信頼性の高い定量化を提供します。定量化は、ワンドツールでアイプラグの輪郭を描き、Image Jソフトウェアの「粒子を解析」コマンドを実行することで実行できます( 材料表を参照)。

5.まぶたの透過照明(マイボーム腺形態)

1. MG領域を評価するには、切除したまぶたを水平に置き、赤外線カメラを備えた実体顕微鏡のバックライトをオンにします(図3)。
2. カメラのISOに従って露光時間を調整して画像をキャプチャします( 材料表を参照)。
   注:実体顕微鏡下でこれらの透過照明まぶたの赤外線イメージングは、各腺房の形状とサイズを測定するのに役立ちます。これらの画像の形態測定分析は、MGのサイズと数の信頼性の高い定量化を提供します。定量化は、ワンドツールでMGの輪郭を描き、Image Jソフトウェアの「粒子の解析」コマンドを実行することで実行できます。

結果

本プロトコルは、眼表面炎症のマウスモデルを確立するための逐次ステップを記載する。プロトコルは、治療法を局所的に適用し、眼の滲出液を取得し、健康なまぶたや炎症を起こしたまぶた(図2)、角膜、結膜などの関連する付属器官を切除する方法を示すことを目的としています。結膜の単離のために上まぶたを解剖するときは注意を払い、角膜の解剖中に1x PBSに保存する必要があります。これにより、結膜の乾燥が防止され、組織学的、薬物動態学的、および遺伝子発現の研究に使用できます。

OVAと生理食塩水は、上記のプロトコルに従って7日間連続して局所適用されました。.生理食塩水で局所的に挑戦されたマウスは、大きく開いた目と規則的なまばたきパターンを備えた健康な眼の表面を示しました。しかし、眼の炎症は、OVAに挑戦した免疫C57BL / 6Jマウスで扇動されました。眼の表面へのOVA溶液の点眼は、点眼後の最初の2時間、痛みではなくかゆみを引き起こした。滲出液とまぶたの湿疹は、チャレンジフェーズの最後の3日間にのみ観察されました。動物の行動を判断すると、痛...

ディスカッション

マイボーム腺の油性分泌は、健康な目にとって非常に重要です²²。しかしながら、両眼瞼の足根板上に位置する平行鎖として並ぶ凝集好中球細胞外トラップ(aggNET)によるこれらの皮脂腺の閉塞は、涙液膜²³を破壊する可能性がある。この破壊は、マイボーム腺機能障害(MGD)¹ と涙液の蒸発の加速をもたらし、^{眼の表面2}の損傷を条件付けます。このプロトコルは、MG閉塞につながる免疫介在性眼表面炎症の確立について説明しています。

マウスモデルからの研究は、眼の表面炎症に関連するMG閉塞を引き起こす根本的な免疫媒介メカニズムを確認しました。AEDのマウスモデルにおける好中球を動員する強力なTH17応答、およびMGD患者の涙液中の好中球および他の骨髄細胞の増加は、^MG21を妨害する好中球の役割を示しています。MG開口部を閉塞するaggNETの存在は、AEDを有するマ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x PBS	Gibco Aluminium Hydroxide
	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/ mL 最終濃度: in vivo: 1 mg/ 100 & micro;L
C57Bl/6マウス、7歳–9週間	チャールズリバーラボラトリーズ
カルシウム	カールロス	CN93.1	1 M 最終濃度: 5 mM
湾曲した鉗子	FST デュモン	スイス 5/45 11251-35
細かい鋭いはさみ	FST ステンレス鋼、ドイツ	15001-08
層流安全キャビネット	Herasafe
マクロ写真カメラ	キヤノン	EOS6D
マクロ写真カメラ(IRフィルターなし)	ニコン	D5300
Mnase	New England biolabs	M0247S	2 x 106ゲルU / mL
多検体フローアッセイキット(カスタムマウス13-プレックスパネル)	Biolegend	CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9%(生理食塩水)	B.ブラウン
オボアルブミン(OVA)	エンドフィット、Invivogen	9006-59-1	10 mg / 200 &生理食塩水
百日咳毒素中のL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHZ1174	50 & マイクロ;g / 500 µ生理食塩水中のL 最終濃度:in vivo:100 µg / 100 µL
Petridish	Greiner bio-one	628160
メス	フェザー使い捨てメス	No.21	<強い>最終濃度:in vivo:  300 ng/100 µL
実体顕微鏡	ツァイス	Stemi508
シリンジ (角膜/虹彩洗浄)	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
シリンジ (i.p 免疫)	BD Microlane	24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm