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方法論記事

結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

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DOI：

10.3791/63895

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2022年5月19日

 ,  , 
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

この記事について

サマリー

このプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、培養上清から 結核菌 群細胞外小胞を富化するための容易で再現性のある技術を記載する。

要約

細菌感染の文脈における細胞外小胞(EV)の役割は、微生物生理学を理解するための新しい道として浮上している。具体的には、 結核菌 (Mtb)EVは、宿主と病原体の相互作用と環境ストレスに対する応答において役割を果たしている。Mtb EVも抗原性が高く、ワクチン成分としての可能性を示しています。Mtb EVを精製する最も一般的な方法は、密度勾配超遠心分離です。このプロセスには、低スループット、低収率、高価な機器への依存、技術的課題など、いくつかの制限があり、結果として得られる調製物に悪影響を及ぼす可能性があります。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、超遠心分離の限界の多くに対抗する、より穏やかな代替方法です。このプロトコルは、SECがMtb EV濃縮に効果的であり、迅速かつスケーラブルな方法で収量を増加させる高品質のMtb EV調製物を製造することを実証しています。さらに、定量および適格性認定手順による密度勾配超遠心分離との比較は、SECの利点を実証しています。EV量(ナノ粒子追跡解析)、表現型(透過型電子顕微鏡)、含有量(ウェスタンブロッティング)の評価はMtb EVに合わせて調整されていますが、提供されるワークフローは他の抗酸菌にも適用できます。

概要

病原体による細胞外小胞(EV)放出は、感染症を制御するための新しい技術を解き放つ鍵となる可能性がある1。 結核菌(Mtb)は、世界人口の約3分の1に感染し、毎年何百万人もの人々の命を奪っている、重大な結果をもたらす病原体です2。MtbによるEV生産は、感染の文脈におけるこれらのEVの生合成および様々な役割(すなわち、免疫刺激性、免疫抑制性、鉄および栄養素の獲得)において十分に文書化されているが、とらえどころがない3,4,5。Mtb EVsの組成を理解するための努力は、免疫学的に重要な脂質およびタンパク質を含む原形質膜に由来する50〜150nmの脂質膜封入スフェアを明らかにした3,6。細菌生理学におけるMtb EVの役割の調査により、生存のための環境ストレスに対する細菌EV調節の重要性が明らかになった5。宿主-病原体相互作用研究は解釈がより複雑であったが、Mtb EVが宿主の免疫応答に影響を与え、効果的なワクチン接種成分として潜在的に役立つ可能性があることを示す証拠がある3,4,7。

これまでのところ、Mtb EVのほとんどの研究では、小胞濃縮のために密度勾配超遠心分離に依存してきました8。これは小規模な研究に効果的です。ただし、この手法にはいくつかの技術的および物流上の課題があります。代替ワークフローは、全細胞と大きな破片を除去するための多段階遠心分離と、EVをペレット化する最終的な超遠心分離ステップを組み合わせます。この方法論は、効率が異なり得、そしてしばしば、可溶性非小胞関連生体分子の低収率および共精製をもたらし、小胞の完全性にも影響を及ぼす9。さらに、このプロセスは時間がかかり、手作業に時間がかかり、機器の制約によりスループットが非常に制限されています。

本プロトコルは、密度勾配超遠心分離に代わる技術であるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)について記載する。この方法は環境マイコバクテリアについて実証されており、現在の研究ではMtb10に外挿されている。市販のカラムおよび自動分画コレクターは、小胞調製における一貫性を改善し、特定の高価な装置の必要性を低減することができます。密度勾配超遠心分離と比較して数分の一の時間でこのプロトコルを完了し、スループットを増加させることもできる。この技術は技術的に難しくなく、習得が容易になり、実験室間/実験室内の再現性を高めることができます。最後に、SECは分離効率が高く、穏やかで、小胞の完全性を維持します。

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プロトコル

コロラド州立大学機関バイオセーフティ委員会は、本研究を承認した(19-046B)。 結核菌 の培養とEVに富む培養上清の採取は、高封じ込め研究所の訓練を受けた職員によって行われました。材料は、有効な不活性化方法が実施され、確認され、および機関のバイオセーフティポリシーによって承認された後、高封じ込め領域から移動された。プロトコルを複製している間に、検証された不活性化または滅菌ろ過方法が実現不可能な場合は、以下の手順を高封じ込めラボで実行する必要があります。

1. 粗Mtb EV濃縮物の調製

注:Mtbの培養および培養濾液タンパク質(CFP)の調製に関する詳細な手順については、参考文献11、12を参照されたい。細菌培養培地には、オレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ(OADC)などのEV含有またはタンパク質性成分を含む増殖サプリメント、およびTweenなどの洗剤を含まないことが推奨されます。また、細菌培養物の品質および採取されたCFPをスクリーニングして、限られた細胞死および溶解を確実にすることが推奨される13,14。

  1. リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)の全容量を加えて、100kDaの分子量カットオフ(MWCO)遠心フィルター( 材料表を参照)を準備します。4°Cで2,800 x g で5分間遠心分離する。
    メモ:デッドストップボリュームのないフィルタを使用する場合は、サンプル量がフィルタレベル以下に減少し、遠心分離中にフィルタが完全に乾燥しないように注意する必要があります。
  2. フロースルーと残りのPBSを廃棄してから、サンプルチャンバにMtb CFPを最大容量まで充填します。容積が限外ろ過装置の最小容積まで減少するまで、4°Cで2,800 x g で遠心分離する。必要に応じて繰り返し、サンプル全体が十分に減少するまで、ユニットにCFPをさらに添加します。
    メモ: 必要に応じて、100 kDaフロースルー(100F)材料の一部を下流の認定のために保持してください。4°Cで保存する。
  3. 濃縮物を含むフィルターユニットに1x PBSをデバイス総容量まで追加します。1.2 で説明されているように音量を下げます。この手順を 5 回繰り返して、洗浄とバッファー交換を確実に完了させます。
  4. 限外ろ過装置の仕様に従って100kDa濃縮CFP保持液(100R)を回収する( 材料表を参照)。100Rが回収されたら、最小容量の1x PBSでフィルターを少なくとも3回洗浄し、回収率を最大化するために100Rで洗浄をプールします。
  5. 製造業者の指示に従ってビシンコニニックアッセイ(BCA)で100R材料を定量する( 材料表を参照)。アッセイを実行するには、PBS 中のサンプル 1:2、1:5、および 1:10 のいくつかの希釈を使用します。サンプルを 3 連でテストします。
    メモ: 必要に応じて、100R 材料の一部をダウンストリーム認定用に保持します。4°Cで保存する。

2. CFPからのMtb EVの濃縮のためのサイズ排除クロマトグラフィー

メモ: 次の手順は、3 mg の 100R Mtb CFP を SEC カラムおよび自動フラクションコレクター (AFC、 材料表を参照) とともに使用する場合に固有のものです。これは、メーカーの仕様に従うことで、他の開始濃度やカラムタイプに適合させることができます。さらに、ユーザーは自動分数コレクターのユーザーマニュアルを読んで理解することをお勧めします。

  1. SECカラムを室温に平衡化させます。
  2. タワーユニットの背面にある電源スイッチを使用してAFCをオンにし、必要に応じてメインメニューのタッチスクリーンで SETUP を押してロードセルの設定を調整します。ロードセルは、最初の使用時、ソフトウェアの更新後、およびフラクション収集量の不整合が認められた場合にのみ較正する必要があります。
  3. セットアップ画面で、「カルーセル」または「キャリブレーション」を選択してカルーセル>合わせます。13個の小さな穴が上を向いたカルーセルをAFCタワーに挿入し、-ボタンまたは+ボタンを押して流体ノズルがフラッシュ位置の真上になるようにカルーセルを調整します。
  4. 平衡化されたSECカラムからキャップを取り外します。SECコラムを適切なコラムマウントにスライドさせ、AFCタワーに慎重に取り付けます。カラムの無線周波数識別(RFID)タグがAFCに向いていることを確認し、カラムとバルブ間の接続が安全であることを確認します。廃棄物排出口チューブを収集容器に入れます。
  5. SETUP 画面から [収集スケジュール] を選択し、- ボタンや + ボタンを押してカウントを 13 に、サイズを 0.5 mL に設定します。「バッファー容量」設定をデフォルトの 2.7 mL のままにしておき、X キーを押して「収集スケジュール」ウィンドウを閉じます。
  6. ホーム画面から「収集の開始」を選択し、「はい」を選択して収集パラメーターを確認します。負荷 13 ラベルの付いた 1.7 mL マイクロ遠心チューブに蓋を開け、カルーセルの中心を向けます。
  7. OKを選択してAFCを進め、カラムリザーバを取り付け、 OKを押して再度前進 します。 YESを押してカラムをフラッシュするオプションを選択し、0.2μmの濾過PBSのカラム容量を1つ追加して、ストレージバッファを除去します。フラッシュが完了したら、 OKを押してAFCを進めます。
  8. カルーセルカバーをAFCの上に置き、 OKを押します。0.2 μm濾過PBSの1カラム容量を用意する。ピペットを使用して、カラムから余分なバッファーを除去します。
  9. ステップ1.5で定量した100Rサンプル3mgを1x PBSで500μLに持ってきます。3 mg サンプルをカラムの上部に追加します。AFCを進め、サンプルをフリットにぶつけます。サンプルがカラムに完全に入ったら、ステップ2.6で調製したPBSをリザーバに追加します。
  10. AFCの実行を監視しながら、AFCが最初にボイドボリュームを収集し、次に指定された分数を収集します。実行が完了し、カルーセルが廃棄物の位置に戻ったら、カバーを取り外し、カルーセルからフラクションチューブを取り外します。定量(ステップ3)および資格認定(ステップ4)の前に画分を4°Cで保存する。
  11. 列を再利用する場合は、 YES を押して列をクリーンアップするオプションを選択します。それ以外の場合は、 NO を押します。AFCの指示に従ってください。
    メモ: カラムを洗浄し、ストレージバッファーが通過したら、カラムを取り出し、キャップを掛けて、4 °C で保存できます。

3. Mtb EVの定量化

  1. BCAおよびマイクロBCA12を用いて各画分のタンパク質濃度を測定する。
    1. 3mgの100R Mtb CFPから採取した0.5mL画分については、各サンプルの1~7番の画分を3連で1:3希釈したマイクロBCAを使用します。
    2. 番号が5~13の0.5 mL画分の場合、各サンプルを3連で希釈せずにBCAを使用します。
      注:フラクション5~7のアッセイを重ねると、すべてのフラクションの出力が読み取り可能になります。
  2. ナノ粒子追跡分析(NTA)を用いて各画分の粒子濃度を定量する。
    1. 以下の推奨開始比を用いて、サンプルを1mLの1x PBSで希釈する。フラクション 1 ~ 3 の場合は 1:100 を使用し、残りのフラクションの場合は 1:10 希釈を使用します。
    2. 希釈溶液をボルテックスし、サンプルを1mLの使い捨てシリンジに引き込む。シリンジがある場合は、自動シリンジポンプにシリンジをセットします。
    3. シリンジポンプを30 μL/minに設定し、スクリーンゲイン10-12、カメラレベル10-12のビデオキャプチャ設定を使用します。各サンプルのフォーカスを調整します。
    4. 一定の流れを使用して、それぞれ30秒で少なくとも3つのビデオを収集します。
    5. ソフトウェア検出しきい値を 5 に設定して分析を実行します。
      注:かなりのサンプル量を犠牲にすることなく、最新のフラクション(>7)のNTAデータを取得することができない場合があります。

4. Mtb EVの認定

  1. 銀染色タンパク質ゲルを使用して、各画分の一般的なタンパク質プロファイルを視覚化します。
    メモ: SDS-PAGE および銀色の汚れの詳細な手順については、リファレンス15 を参照してください。
    1. SDS サンプルバッファーを各フラクションの 10 μL、および 5 μg の CFP、100R、および 100F に加えます。100°Cで5分間沸騰させた後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の分子量ラダー(PAGE)を備えた4%-12%ビストリスゲルに負荷をかけます( 材料表を参照)。
    2. 1x 2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)ランニングバッファー( 材料表を参照)と200Vの電流を35分間使用してゲルを実行します。
    3. ゲルをカセットから取り出し、銀染色15を続行する。
  2. 各フラクションにおけるEVマーカーの有無をウェスタンブロットにより評価する。
    メモ: ウェスタンブロッティングの詳細な手順については、リファレンス15 を参照してください。
    1. ステップ 4.1.1-4.1.2 の説明に従って SDS-PAGE ゲルを実行します。
    2. カセットからゲルを取り出し、50Vの電流を最低1時間印加することによって、分解されたタンパク質を0.2μmのニトロセルロース膜( 材料表を参照)に移します。
    3. ウェスタンブロット分析を実行して、目的のタンパク質を評価します。LpqH、リポアラビノマンナン(LAM)、およびGroES( 材料表を参照)に対する一次抗体が推奨されます。
    4. 下流アプリケーションに適用可能なマーカーの有無に基づくプール分数。
  3. 無傷の小胞の存在を透過型電子顕微鏡(TEM)により確認する。
    1. 4% EMグレードのパラホルムアルデヒドを15 μL加えて15 μLの小胞サンプルを固定し、4°Cで一晩保存します。
    2. 表面を洗浄し、親水性基板を作製することにより、200メッシュのホルムバーカーボン被覆銅TEMグリッドを作製する。
      メモ:95%のアルゴン、5%の酸素、および30%のプラズマパワーで1分間のプラズマ洗浄をお勧めします。
    3. 固定したサンプルを10 μLグリッド上に落とし、サンプルを10分間付着させた後、余分な液体をろ紙で拭き取ります。
    4. グリッドを超純水滴に30秒間浮かべてから、余分な液体を拭き取ります。
    5. d%EMグレードの酢酸ウラニル滴にグリッドを2分間浮かべ、余分な液体を拭き取ります。
    6. グリッドが完全に空気乾燥するのを待ちます。
    7. 画像は100kVまたは類似のTEM( 材料表を参照)を用いた。
      メモ:他のEV定量および特性評価方法は、ダウンストリームアプリケーションに基づいて使用する必要があります。細胞外小胞の研究のための最小情報18 は、すべてのEV研究の厳密さと再現性を確保するためのガイドラインについて相談されるべきである。

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結果

結 核菌 (Mtb)由来の培養濾液タンパク質(CFP)を濃縮、定量し、次いで3mgの物質をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムにアプライした。タンパク質および粒子濃度を、それぞれBCAおよびNTAによって列挙した。タンパク質および粒子回収の期待される範囲と、これらの結果について得られた正確な値を 表1に報告する。これらの範囲よりはるかに高い値は、汚染またはカラムの完全性の問題を示している可能性があります。値が著しく低いと限外ろ過ステップの問題が指摘されるため、フロースルーを開始CFPおよび100Rと比較して、濃縮が成功したかどうかを判断する必要があります。非特異的タンパク質銀染色は、後の画分がより多くのタンパク質を含み、100R材料に似ていることを示しています(図1)。

画分のウェスタンブロットは、リポアラビノマンナン(LAM)が画分全体に存在し、後の画分はより低い強度のバンディングを示すことを実証している(図2A

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ディスカッション

結核菌の細胞外小胞は抗原性の高い貯留層であり、診断ツールや将来のワクチンを開発するための魅力的な道として提示されています4,19,20。歴史的に、密度勾配超遠心分離は、Mtb EVを他の可溶性、分泌物質8から分離するために使用されてきた。このプロセスは効果的ですが、時間がかかり、技術的に困難であり、結果として得られるEV準備の完全性に影響を与える可能性があります9,10。提示されたプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるMtb EV調製物の代替方法を提供する。

この方法を成功させるには、いくつかの重要なポイントがあります。最初のMtb CFP調製は、SEC後の小胞の品質および収量に影響を及ぼす。CF...

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開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

獣医学部・生物医学科学部体験賞と大学研究評議会共有研究プログラムからNKGへの支援と、ATCC(賞#2016-0550-0002)によるKMDへの資金提供に感謝します。我々はまた、技術サポートについてアン・シンプソン、NIAID、NIHの以下の試薬について、以下の試薬について感謝したいと思います:モノクローナル抗結核菌LpqH(ジーンRv3763)、IT-54(インビトロで生産)、NR-13792、モノクローナル抗結核菌GroES(遺伝子Rv3418c)、クローンIT-3(SA-12)(インビトロで生産)、NR-49223、およびモノクローナル抗結核菌LAM、クローンCS-35(インビトロで生産)、NR-13811。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20x MES SDS ランニングバッファーThermoFisher ScientificNP0002
96 ウェルプレートCorning15705-066
自動フラクションコレクターIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark 染色済みタンパク質ラダーInvitrogen10748010
卓上遠心分離機ベックマン・コールターアレグラ 6R
Centricon Plus - 70 遠心フィルター、100 kDaカットオフミリポアシグマUFC710008 ステップ1.1で使用する限外ろ過
装置 エレクトロブロッティングシステムサーモフィッシャーサイエンティフィック 09-528-135
EMグレード パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 科学15714-S
Formvar/Carbon 200 メッシュ Cu グリッド電子顕微鏡科学FCF200H-Cu-TA
ヤギ抗マウスIgGハンド&L (アルカリホスファターゼ)、全分子、1 mLAbCamab6790二次抗体
JEM-1400 透過型電子顕微鏡JOEL
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23235
マイクロプレートリーダーBIOTEKEpoch
Monoclonal Anti-結核菌 GroES (遺伝子 Rv3814c)BEI ResourcesNR-49223一次抗体
モノクローナル抗結核菌 LpqH (遺伝子 Rv3763)BEI ResourcesNR-13792一次抗体
モノコロン 抗結核菌 LAM, クローン CS-35BEI ResourcesNR-13811一次抗体
NanoClean 1070Fischione InstrumentsTEMグリッドのプラズマ洗浄用
Nanosightは、シリンジポンプとNanoSight NTAソフトウェアを搭載したコンピュータMalvern PanalyticalNS300
ニトロセルロース膜、ロール、0.2 μmBioRad1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsThermoFisher ScientificNP0323BOX
リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムおよびマグネシウムを含まない1X Corning21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
qEV オリジナル 35 nm 5/pkIZON ScienceSP5-USDSEC カラム
SDS サンプルバッファーBosterAR1112この手順で使用した社内レシピですが、この製品は同等の
SDS-PAGE ゲルチャンバーです ThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
Silver Stain Plus KitBioRad1610449この手順で使用される社内プロトコルですが、このキットは同等の
酢酸ウラニル顕微鏡科学22400
を装備 電子です

参考文献

  1. Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
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