このプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、培養上清から 結核菌 群細胞外小胞を富化するための容易で再現性のある技術を記載する。
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この記事について
サマリー
要約
細菌感染の文脈における細胞外小胞(EV)の役割は、微生物生理学を理解するための新しい道として浮上している。具体的には、 結核菌 (Mtb)EVは、宿主と病原体の相互作用と環境ストレスに対する応答において役割を果たしている。Mtb EVも抗原性が高く、ワクチン成分としての可能性を示しています。Mtb EVを精製する最も一般的な方法は、密度勾配超遠心分離です。このプロセスには、低スループット、低収率、高価な機器への依存、技術的課題など、いくつかの制限があり、結果として得られる調製物に悪影響を及ぼす可能性があります。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、超遠心分離の限界の多くに対抗する、より穏やかな代替方法です。このプロトコルは、SECがMtb EV濃縮に効果的であり、迅速かつスケーラブルな方法で収量を増加させる高品質のMtb EV調製物を製造することを実証しています。さらに、定量および適格性認定手順による密度勾配超遠心分離との比較は、SECの利点を実証しています。EV量(ナノ粒子追跡解析)、表現型(透過型電子顕微鏡)、含有量(ウェスタンブロッティング)の評価はMtb EVに合わせて調整されていますが、提供されるワークフローは他の抗酸菌にも適用できます。
概要
病原体による細胞外小胞(EV)放出は、感染症を制御するための新しい技術を解き放つ鍵となる可能性がある1。 結核菌(Mtb)は、世界人口の約3分の1に感染し、毎年何百万人もの人々の命を奪っている、重大な結果をもたらす病原体です2。MtbによるEV生産は、感染の文脈におけるこれらのEVの生合成および様々な役割(すなわち、免疫刺激性、免疫抑制性、鉄および栄養素の獲得)において十分に文書化されているが、とらえどころがない3,4,5。Mtb EVsの組成を理解するための努力は、免疫学的に重要な脂質およびタンパク質を含む原形質膜に由来する50〜150nmの脂質膜封入スフェアを明らかにした3,6。細菌生理学におけるMtb EVの役割の調査により、生存のための環境ストレスに対する細菌EV調節の重要性が明らかになった5。宿主-病原体相互作用研究は解釈がより複雑であったが、Mtb EVが宿主の免疫応答に影響を与え、効果的なワクチン接種成分として潜在的に役立つ可能性があることを示す証拠
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プロトコル
コロラド州立大学機関バイオセーフティ委員会は、本研究を承認した(19-046B)。 結核菌 の培養とEVに富む培養上清の採取は、高封じ込め研究所の訓練を受けた職員によって行われました。材料は、有効な不活性化方法が実施され、確認され、および機関のバイオセーフティポリシーによって承認された後、高封じ込め領域から移動された。プロトコルを複製している間に、検証された不活性化または滅菌ろ過方法が実現不可能な場合は、以下の手順を高封じ込めラボで実行する必要があります。
1. 粗Mtb EV濃縮物の調製
注:Mtbの培養および培養濾液タンパク質(CFP)の調製に関する詳細な手順については、参考文献11、12を参照されたい。細菌培養培地には、オレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ(OADC)などのEV含有またはタンパク質性成分を含む増殖サプリメント、およびTweenなどの洗剤を含まないことが推奨されます。また、細菌培養物の品質および採取されたCFPをスクリーニングして、限られた細胞死および溶解を確実にすることが推奨される13,14。
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結果
結 核菌 (Mtb)由来の培養濾液タンパク質(CFP)を濃縮、定量し、次いで3mgの物質をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムにアプライした。タンパク質および粒子濃度を、それぞれBCAおよびNTAによって列挙した。タンパク質および粒子回収の期待される範囲と、これらの結果について得られた正確な値を 表1に報告する。これらの範囲よりはるかに高い値は、汚染またはカラムの完全性の問題を示している可能性があります。値が著しく低いと限外ろ過ステップの問題が指摘されるため、フロースルーを開始CFPおよび100Rと比較して、濃縮が成功したかどうかを判断する必要があります。非特異的タンパク質銀染色は、後の画分がより多くのタンパク質を含み、100R材料に似ていることを示しています(図1)。
画分のウェスタンブロットは、リポアラビノマンナン(LAM)が画分全体に存在し、後の画分はより低い強度のバンディングを示すことを実証している(図2A
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ディスカッション
結核菌の細胞外小胞は抗原性の高い貯留層であり、診断ツールや将来のワクチンを開発するための魅力的な道として提示されています4,19,20。歴史的に、密度勾配超遠心分離は、Mtb EVを他の可溶性、分泌物質8から分離するために使用されてきた。このプロセスは効果的ですが、時間がかかり、技術的に困難であり、結果として得られるEV準備の完全性に影響を与える可能性があります9,10。提示されたプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるMtb EV調製物の代替方法を提供する。
この方法を成功させるには、いくつかの重要なポイントがあります。最初のMtb CFP調製は、SEC後の小胞の品質および収量に影響を及ぼす。CF.......
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開示事項
著者らには開示するものは何もありません。
謝辞
獣医学部・生物医学科学部体験賞と大学研究評議会共有研究プログラムからNKGへの支援と、ATCC(賞#2016-0550-0002)によるKMDへの資金提供に感謝します。我々はまた、技術サポートについてアン・シンプソン、NIAID、NIHの以下の試薬について、以下の試薬について感謝したいと思います:モノクローナル抗結核菌LpqH(ジーンRv3763)、IT-54(インビトロで生産)、NR-13792、モノクローナル抗結核菌GroES(遺伝子Rv3418c)、クローンIT-3(SA-12)(インビトロで生産)、NR-49223、およびモノクローナル抗結核菌LAM、クローンCS-35(インビトロで生産)、NR-13811。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS ランニングバッファー | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 ウェルプレート | Corning | 15705-066 | |
| 自動フラクションコレクター | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark 染色済みタンパク質ラダー | Invitrogen | 10748010 | |
| 卓上遠心分離機 | ベックマン・コールター | アレグラ 6R | |
| Centricon Plus - 70 遠心フィルター、100 kDaカットオフ | ミリポアシグマ | UFC710008 ステップ1.1で使用する限外ろ過 | |
| 装置 エレクトロブロッティングシステム | サーモフィッシャーサイエンティフィック 09-528-135 | ||
| EMグレード パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡 科学 | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 メッシュ Cu グリッド | 電子顕微鏡科学 | FCF200H-Cu-TA | |
| ヤギ抗マウスIgGハンド&L (アルカリホスファターゼ)、全分子、1 mL | AbCam | ab6790 | 二次抗体 |
| JEM-1400 透過型電子顕微鏡 | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| マイクロプレートリーダー | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-結核菌 GroES (遺伝子 Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | 一次抗体 |
| モノクローナル抗結核菌 LpqH (遺伝子 Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | 一次抗体 |
| モノコロン 抗結核菌 LAM, クローン CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | 一次抗体 |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | TEMグリッドのプラズマ洗浄用 | |
| Nanosightは、シリンジポンプとNanoSight NTAソフトウェアを搭載したコンピュータ | Malvern Panalytical | NS300 | |
| ニトロセルロース膜、ロール、0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムおよびマグネシウムを含まない | 1X Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV オリジナル 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC カラム |
| SDS サンプルバッファー | Boster | AR1112 | この手順で使用した社内レシピですが、この製品は同等の |
| SDS-PAGE ゲルチャンバー | です ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | この手順で使用される社内プロトコルですが、このキットは同等の |
| 酢酸ウラニル | 顕微鏡科学 | 22400 |
参考文献
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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