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方法論記事

マウス骨格筋へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション

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DOI:

10.3791/63916

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2022年4月6日

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

この記事について

サマリー

プラスミドDNAの骨格筋へのエレクトロポレーションは、マウスの筋収縮性を損なうことなく遺伝子発現を調節する実行可能な方法である。

要約

プラスミドエレクトロポレーションによるマウス骨格筋における一過性遺伝子発現調節は、正常および病理学的生理学を評価するための有用なツールである。標的遺伝子の過剰発現またはノックダウンにより、研究者は個々の分子事象を操作できるため、筋肉量、筋肉代謝、および収縮性に影響を与えるメカニズムをよりよく理解することができます。さらに、蛍光タグをコードするDNAプラスミドのエレクトロポレーションにより、研究者は in vivoで骨格筋におけるタンパク質の細胞内局在の変化を測定することができます。骨格筋の主要な機能評価には、筋肉収縮性の測定が含まれる。このプロトコールでは、プラスミドDNA注入、エレクトロポレーション、および遺伝子発現調節の後も筋肉全体の収縮性研究が依然として可能であることを実証する。この指導手順の目的は、マウス骨格筋へのDNAプラスミドエレクトロポレーションの段階的な方法を実証して、脛骨前筋および伸筋桁長筋の筋線維における取り込みおよび発現を促進し、ならびに骨格筋収縮性が注射およびエレクトロポレーションによって損なわれないことを実証することである。

概要

in vivoでの骨格筋へのプラスミドDNAエレクトロポレーションは、様々な生理学的および病態生理学的条件下で遺伝子発現を調節することによって骨格筋生理学および分子シグナル伝達の変化を評価するための重要なツールである1,2,3,4,5,6,7,8,9 .骨格筋への実験的な遺伝子導入は、Wolffらによって1990年に早くも実証され、そこではRNAとDNAの両方がエレクトロポレーションなしで首尾よく転写され、ルシフェラーゼ発現は少なくとも2ヶ月間維持された10。注射のみではトランスフェクション効率が比較的低いことが問題であり、相原と宮崎は1998年にpCAGGS-IL-5構築物を前脛骨(TA)筋にエレクトロポレーションし、血清IL-5発現を測定することによって、エレクトロポレーションによる遺伝子導入の増加を実証した11。それ以来、多くの研究が、遺伝子導入効率を最大化するために、さまざまなDNA濃度、体積、およびエレクトロポレーションパラメータの有効性を調査してきました。Mirらは、電圧、パルス数、パルス持続時間、周波数、DNA濃度を含むさまざまなエレクトロポレーションパラメータを試験し、電圧、パルス数、DNA濃度のすべてがエレクトロポレーション効率の向上に寄与すると判断しました12。高いエレクトロポレーション電圧に対する主な注意点は、筋線維へのDNA取り込みの増加を促進する一方で、筋肉の損傷も引き起こし、結果を混乱させる可能性があることです。Schertzerらは、200Vでのエレクトロポレーションがエレクトロポレーションの3日後にミオファイバーの約50%に損傷を引き起こしたのに対し、50Vで損傷を受けたのはミオファイバーの10%のみであることを示した13。我々は、効率的なDNA移植と筋肉損傷に影響を及ぼす変数を考慮し、ノギス幅1センチメートルあたり125Vの電圧が効果的な遺伝子導入を達成するのに十分であることを見出した。

エレクトロポレーション後の筋線維断面積および筋全体の収縮性の解析は、遺伝子調節による筋の大きさおよび機能の変化を測定するための方法の重要な側面である。我々および他の人々は、制御ベクターのエレクトロポレーションだけではミオファイバー面積の減少を引き起こさないことを以前に実証した。緑色蛍光タンパク質(EGFP)構築物は、これらの研究においてDNAトランスフェクションの有用な蛍光指標であった13、14。多くの研究がエレクトロポレーション後のTAのin situ収縮性を調査し、様々な結果を見出した。ある研究では、75V/cmエレクトロポレーションはエレクトロポレーションの3日後に破傷風力の約30%の減少を引き起こし、エレクトロポレーションの7日後には破傷風力は制御レベルに戻ったが、50V/cmのエレクトロポレーションは力を損なわなかった13,15。別の研究では、180V/cmエレクトロポレーションの3時間後に破傷風力が30%減少し、7日後に偽の力レベルに回復したことを示しました16。

以下の詳細な手順では、我々は、マウスのTAおよび伸筋デジトーラムロンガス(EDL)筋肉におけるpcDNA3-EGFPプラスミドの注入およびエレクトロポレーションを実証する。我々はまた、この方法がEDL全筋収縮性に影響を及ぼさないことを実証する。その目的は、機能喪失を引き起こすことなく筋線維への効率的なプラスミド取り込みを実証することです。

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プロトコル

動物を用いたすべての実験は、ペンシルベニア州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されたペンシルベニア州立医科大学で行われ、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の修正で定められた倫理基準に従って実施された。この処置には、12週齢の雌性C57BL/6マウスを使用した。すべての手術器具は、実験前に無菌性のためにオートクレーブ処理された。

1. TAおよびEDL注射/エレクトロポレーション調製

メモ:これらの手順は、TAおよびEDL注射/エレクトロポレーション調製の場合と同じです。

  1. 実験前に発現プラスミド構築物を滅菌PBSで希釈した1 μg/μLの濃度に精製する。この手順のために、市販のエンドトキシンフリー精製キットを使用して、pcDNA3−EGFP(GFP)またはpcDNA3空ベクター(コントロール)を精製した。
  2. プラスミド濃度を計算して、適切な注入量を確保します(50μLの滅菌PBS中のDNAのTA 50μg;EDL 10 μg の DNA を 10 μL の滅菌 PBS) およびアリコートサンプルに含めます。
  3. エレクトロポレーターの設定をプログラムするには、セレクトホイールを使用し、ホイールを押し下げて、モード - LV、電圧 - 12.5 V/mm(注入時に調整)、パルス長 - 20 ms、パルス数 - 5、間隔 - 200 ms、極性 - ユニポーラ。
  4. イソフルランガスを用いてマウスを麻酔する。マウスを5%イソフルランを含む誘導箱に入れる。鉗子を使用してつま先ピンチ反射がないことによって麻酔の手術面を確認し、イソフルランを2%の維持用量に減らす。マウスを、残りの手順のために37°Cの循環水プレートに載せた適切な鼻錐に移す。
  5. 小さなバリカンを使用して両方の後肢から髪を取り除きます。注射領域を消毒するために交互に70%エタノール/ベタジンで下肢をこする。

2. TAインジェクション/エレクトロポレーション

  1. マウスを仰臥位に置いた状態で、下肢の側方の皮膚を通して見えるTA腱の位置を突き止める。取り外し可能な30G針を備えた50μLマイクロシリンジを使用して、針が筋肉の上端に達するまで、筋腱接合部よりも1〜2mm優れた針を浅い5°の角度で挿入する。
    注:筋肉の中央への注射が目標です。
  2. 注射経路に沿って針をゆっくりと引き込みながらプランジャーをゆっくりと押し下げて、50 μLのプラスミド溶液を送達します。筋肉は腫れるはずです。
  3. タイマーを1分間設定し、TAで脚の太さを測定します。マウスのサイズに応じて、これは5〜10mmの範囲であり得る。ノギス電極を測定された厚さに設定し、エレクトロポレーター電圧を12.5 V/mmに設定します。
  4. 1分後、キャリパー電極を下肢の周囲に置きます。電極はぴったりとくっついている必要がありますが、過度にきつくてはなりません。20ミリ秒の持続時間と200ミリ秒の間隔で5つの方形波パルスを送達する(筋肉は各パルスで痙攣するべきである)。
  5. コントロールベクトルを使用して、代替肢で繰り返します。
  6. マウスを麻酔から外し、37°Cに設定した加熱パッドで回復させます。 回復したら、マウスをケージに戻します。

3. EDL注入/エレクトロポレーション

  1. マウスを仰臥位に置いた状態で、視覚的および穏やかな触診を通して脛骨前紋を見つける。
    1. メスを用いて、膝より5mm下方の脛骨前堤の外側の皮膚からTA筋腱接合部より2mm優れた浅い切開を行う。
    2. 小さなはさみを使用して、筋膜を鈍く解剖し、TA筋肉を露出させる。
    3. ここでも、はさみによる鈍い解剖を用いて、筋肉を横方向に引っ張ってTA筋を脛骨から優しく分離し、EDLを露出させる。小さく湾曲した鉗子を使用して、手順中にTAをEDLから明確に保つことができます。
  2. 取り外し可能な30G針を備えた50μLマイクロシリンジを使用して、針が筋肉の上端に達するまで針を縦方向にEDLに挿入する。
  3. 注射経路に沿って針をゆっくりと引っ込めながらプランジャーをゆっくりと押し下げ、10μLのプラスミド溶液を注入します(筋肉は腫れます)。
  4. タイマーを1分間設定し、EDLで脚の太さを測定します。マウスのサイズに応じて、これは5〜10mmの範囲であり得る。ノギス電極を測定された厚さに設定し、エレクトロポレーター電圧を12.5 V/mmに設定します。
  5. 1分後、キャリパー電極を下肢の周囲に置きます。電極はぴったりとくっついている必要がありますが、過度にきつくてはなりません。20ミリ秒の持続時間と200ミリ秒の間隔で5つの方形波パルスを送達する(筋肉は各パルスで痙攣するべきである)。
  6. 使い捨ての4/0非吸収性ナイロン縫合糸を使用して切開部を閉じます。
  7. 代替肢で繰り返すか、絶対的な制御として手足を手つかずのままにしておきます。
  8. マウスを麻酔から外し、37°Cに設定した加熱パッドで回復させます。 手術直後および手術後12〜24時間に適切な皮下鎮痛剤を投与する。回復したら、マウスをケージに戻します。
    注:以前の研究では、エレクトロポレーション直後のTAの筋肉収縮性欠損および収縮性回復が3日間にわたって起こることが示されている13,15。このため、組織学、タンパク質発現、または筋収縮性に関するTAおよびEDL筋の両方の解析は、エレクトロポレーションの3〜10日後に行われる。EGFPの長期発現は、手順13に続いて3週間まで観察された。

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結果

骨格筋における遺伝子導入を促進するエレクトロポレーションは、筋肉生理学の変化を評価するために使用される有用な技術である。我々は、TAおよびEDL筋肉の両方で効率的な遺伝子導入を達成するための詳細なステップバイステップの手順を実証した。トランスフェクション効率の違いは、多数の変数のために発生します。これらの変数には、エレクトロポレーションパラメータ(パルス、電圧、パルス持続時間など)、遺伝子構築物のサイズ、および注入されたDNAの濃度/体積が含まれます。我々は以前、125V/cmで5パルスのエレクトロポレーションパラメータを200ms間隔で区切った20msの持続時間で、TA14における効率的な遺伝子導入を達成するのに十分であることを示した。我々はまた、現在の研究において、DNAの注入/エレクトロポレーションが実験後3日間のEDLにおいて筋肉収縮性の喪失を引き起こさないことを実証する。

遺伝子導入を可視化するために、pcDNA3−EGFPまたはpcDNA3(対照)構築物をマウスTAまたはEDL筋肉にエレクトロポレーションした。手順の3日後...

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ディスカッション

エレクトロポレーションによって増強された骨格筋におけるインビボ遺伝子導入は、筋肉におけるタンパク質発現を調節するための有用で比較的単純なツールである。我々は、EDLおよびTA筋肉における効率的な遺伝子導入を達成するために必要なステップを示し、EDLの収縮性測定が手順に従って実行可能であることを実証した。この技術は、より複雑なウイルスベクターを必要とせず、単一の筋肉におけるトランスフェクトおよび非トランスフェクト筋線維断面積の比較を可能にする。この手順の限界は、コンストラクトの取り込み効率が完全ではなく、一部の筋線維がトランスフェクトされていないままであったことです。

議論される手順は、発現ベクターのエレクトロポレーションに限定されない。我々は以前、タンパク質ノックダウンが同じ手順に従うことによって達成できることを示したが、in vivoでsiRNAまたはshRNA構築物のいずれかを使用する14。さらに、レポーター構築物は、標的遺伝子2、4、<...

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開示事項

B.A.H.およびD.L.W.は、利益相反を主張しません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4-0ナイロン縫合糸(非吸収性)皮膚切開50Ethicon662G
;l ハミルトンシリンジハミルトン80501マイクロシリンジ
C57BLl/6NHsdマウスEnvigo044実験に使用する12週齢の雌マウス
キャリパー電極BTX45-01021.0cm x 1.0cmステンレス鋼
ダイナミックマッスルコントロール データ収集/分析オーロラサイエンティフィック605A筋収縮性の測定と分析に使用するソフトウェア
ECM 830 エレクトロポレーションシステムBTX45-0662エレクトロポレーター
EndoFree プラスミド マキシキットQiagen12362プラスミド精製キット
エクストラナローハサミファインサイエンスツール14088-10鈍器解剖用ハサミ
フォーストランスデューサオーロラサイエンティフィック407A
マイクロマスキート止血剤から力を測定するにはファインサイエンスツール13010-12サーターリング用止血剤
pcDNA3.1 哺乳類発現ベクターフィッシャーサイエンティフィックV79020コントロールベクター
pcDNA3-EGFP発現プラスミドAddgene13031GFP発現プラスミド
セムケン湾曲鉗子ファインサイエンスツール11009-13手術用鉗子
外科用刃 ステンレス鋼 No. 10Becton Dickinson37 1210メスの刃
Tissue-Tek O.C.T. メディアVWR25608-930組織学用凍結培地
小麦胚芽凝集素-テキサスレッドサーモフィッシャーサイエンティフィックW21405筋肉断面の膜染色
µを閉じるための縫合糸ー EDL

参考文献

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