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方法論記事

無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング

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DOI:

10.3791/63919

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2022年6月23日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

この記事について

サマリー

本プロトコルは、無傷で除去された臓器および組織における増殖および休眠中の トリパノソーマクルジ 寄生虫およびT細胞を視覚化および正確に定量するためのライトシート蛍光顕微鏡法および自動化されたソフトウェア支援方法について説明しています。これらの手法は、治療結果を評価するための信頼できる方法を提供し、寄生虫と宿主の相互作用に関する新しい洞察を提供します。

要約

シャーガス病は、ラテンアメリカを中心に世界中の何百万人もの人々に影響を与える無視された病理です。シャーガス病剤である トリパノソーマ クルジ(T.クルジ)は、ヒトを含むいくつかの哺乳類種に感染し、心臓および消化器系の病状を引き起こす多様な生物学を持つ絶対性細胞内寄生虫です。 T. cruziのin vivo 感染の信頼性の高い検出は、シャーガス病の複雑な生物学を理解し、治療レジメンの結果を正確に評価するために長い間必要とされてきました。現在のプロトコルは、3D再構築されたクリアされた臓器における T.cruzi感染細胞の自動定量のための統合パイプラインを示しています。ライトシート蛍光顕微鏡法は、臓器または組織全体において活発に増殖および休眠している T. cruzi 寄生虫および免疫エフェクター細胞を正確に視覚化および定量することを可能にする。また、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るためのCUBIC-HistoVisionパイプラインも採用されました。組織クリアリングと3D免疫染色を組み合わせることで、薬物治療プロトコルを包括的に評価し、 T. cruzi感染組織の細胞組織の理解を深めるための公平なアプローチを提供し、シャーガス病における抗T.クルジ 免疫応答、組織損傷、および修復に関連する発見を進めることが期待されます。

概要

原虫寄生虫T. cruziによって引き起こされるシャーガス病は、世界で最も無視されている熱帯病の1つであり、年間約13,000人が死亡しています。感染症はしばしば急性期から慢性期に進行し、不整脈、心不全、突然死などの患者の30%に心臓病を引き起こします1,2。急性期に寄生虫に対して強い宿主免疫応答が誘発されるにもかかわらず、少数の寄生虫は、心臓や骨格筋などの組織で宿主の生涯を通じて慢性的に存続します。適応免疫応答の開始遅延および寄生虫の非複製型の存在を含むいくつかの要因は、免疫系による完全な排除を回避するT. cruziの能力に寄与する可能性がある3,4,5,6。さらに、寄生虫の非複製休眠型は、トリパノシド薬に対する低い感受性を示し、多くの場合に観察される治療の失敗に部分的に関与している可能性があります7,8。

新しいイメージング技術の開発は、感染した組織における寄生虫の空間分布と、それらの制御に関与する免疫細胞との関係についての洞察を得る機会を提供します。これらの特性は、免疫系による寄生虫制御のプロセスをよりよく理解し、慢性組織に存在するまれな休眠中の寄生虫を追跡するために重要です。

ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、薄切片なしで大きな組織や臓器を3Dイメージングするための最も包括的で偏りのない方法の1つです。ライトシート顕微鏡は、薄い光シートを利用して、焦点面内の蛍光色素のみを励起し、サンプルの光退色と光毒性を低減し、超高速カメラを使用して数千の組織層の画像を記録します。組織へのレーザー光の適切な浸透に必要な高レベルの組織透明性は、組織の脱脂質化および脱色に続く屈折率(RI)を均質化することによって得られ、光の散乱を低減し、高品質の画像をレンダリングする9,10,11。

組織クリアリングアプローチは、マウス全体12、13、14、オルガノイド15、16、17、レポーター蛍光マーカー18、19、20、21、22、23、および最近では限られた数のヒト組織のイメージングのために開発されています24.現在の組織透明化の方法は、(1)DISCOプロトコル25,26などの有機溶媒ベースの方法、(2)CLARITY27などのヒドロゲルベースの方法、およびCUBICなどの水性方法(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)18,19,28,29の3つのファミリーに分類されます。.CUBICプロトコルは、臓器の形状と組織の完全性を維持し、内因的に発現したレポータータンパク質の蛍光を維持します。この技術の最新のアップデートであるCUBIC-HistoVision(CUBIC-HV)では、蛍光タグ付き抗体とDNA標識を使用したエピトープの検出も可能です28。

本プロトコルでは、清澄化された無傷のマウス組織において蛍光タンパク質を発現 するT. cruzi を検出するためのCUBICパイプラインを使用した。光学的に透明な組織をLSFM画像化し、3D再構成し、 臓器あたりのT. cruzi 感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の正確な総数を自動的に定量化しました。また、このプロトコルは、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るために首尾よく採用された。これらのアプローチは、感染した宿主における T. cruzi の増殖と制御を理解するために不可欠であり、シャーガス病の化学療法および免疫治療薬を完全に評価するのに役立ちます。

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プロトコル

この研究は、実験動物の人道的ケアと使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび実験動物ケア認定ガイドラインの評価と認定のための協会に厳密に従って実施されました。動物使用プロトコル(マウスにおける T.クルジ 感染の制御-A2021 04-011-Y1-A0)は、ジョージア大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdトマト)Hze/J、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdトマト)Hze/JおよびC57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/Jマウス(雌、生後1-2ヶ月)を本試験に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1.感染、灌流、解剖

  1. コロンビアーナ(DTU TcI)またはブラジル(DTU TcV) T.cruzi 株の組織培養由来トリポマスティゴテスをそれぞれtdTomatoまたはGFP蛍光タンパク質を発現するマウスを腹腔内感染させる。感染量は、100 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈された50,000〜200,000のトリポマスティゴテの範囲である可能性があります。
    注:レポーター寄生虫の生成と感染のマウスモデルに関する具体的な詳細は、Canavaciらで入手できます。29 およびブスタマンテら30。
  2. 3〜7 L / minの流速で二酸化炭素吸入によってマウスを安楽死させます。動物がペダル反射を示さなくなったらすぐに、腹部から胸骨に向かって皮膚を通して縦方向の切開を行います。次に、腹部から体壁を切り取り、胸骨が持ち上げられて心臓が露出するまで、胸郭の両側の肋骨を通り続けます。
  3. 図1に示すように、心臓の右耳介を2.5 mm切開し、 1 mLのマイクロピペットチップを使用して排血血液を採取します。
  4. 蝶の針(灌流システムの一端に接続)を上行大動脈に達するまで左心室の頂点に挿入します。ゲルベースの接着剤( 材料表を参照)を使用して、針の周りの入口穴を密閉し、灌流中に針を所定の位置に維持します。
  5. マウス30に50 mLの冷たいヘパリン-PBS(pH 7.4、10 U / mLのヘパリン)を灌流するか、マウスから収集トレイに向かって出てくる液体が血液がなくなるまで灌流します。
  6. PBS中の50 mLの冷4%(w / v)パラホルムアルデヒド(PFA)(pH 7.4)で灌流します。
    注:PFA組織固定は、特にエピトープ構造の維持とその後の免疫検出にとって、プロトコルの重要なステップの1つである可能性があります。PFAは時間の経過とともに劣化するため、新たに準備する必要があります。溶液のpHは、組織の透明化不良につながる可能性のある過剰固定を避けるためにも重要です。
    注意: PFAは皮膚接触によって中程度の毒性があります。急性曝露はまた、鼻、目、喉を非常に刺激します。空気や皮膚の低レベルに長期間さらされると、皮膚炎やかゆみなどの皮膚の炎症、および喘息のような呼吸器系の問題を引き起こす可能性があります。顔と目の保護具を着用し、ほこり、ガス、ミスト、煙、または蒸気を吸い込まないでください。
    1. PFA灌流後、マウスに100 mLのCUBIC-Pバッファーを灌流し、ステップ1.5で述べた清澄化レベルに到達します。
    2. CUBIC-Pバッファーを調製するには、10%N-ブチルジエタノールアミン、5%Triton X-100、および5%1-N-メチルイミダゾールを二重蒸留水に溶解するか、市販のカクテルを使用します(材料表を参照)。
      メモ: ステップ 1.6.1.-1.6.2.心臓や腎臓などの高度に色素沈着した臓器は、透明度を高めるために事前のクリアステップが必要なため、のみ推奨されます。CUBIC-Pを使用した後、臓器を解剖し、ステップ2:組織の透明化に直接進みます。
  7. 画像化する組織サンプル/臓器30 を解剖し、50 mLコニカルチューブで穏やかに振とう(5 x g以下)しながら、PBS(~10 mL /臓器全体)中の4%(w / v)PFAに4°Cで一晩(ON)後固定します。
    注:それ以降のすべてのインキュベーションは、光から保護された20〜30°Cで水平に置かれたチューブで実行する必要があります。
  8. サンプルを10 mLのPBS(0.05%アジ化ナトリウム(NaN 3)を添加した)で、室温(RT)で穏やかに振とう(5 x g)しながら3時間(3回)洗浄します。
    注:組織は、50 mLコニカルチューブで4°Cで穏やかに振とう(5 x g)しながら、PBS中の10 mLの30%スクロースでインキュベートすることにより凍結できます。組織がチューブの底に沈んだ後、それらをOCTコンパウンドに埋め込み、-80°Cに保ちます。 OCTコンパウンドが完全に溶けるまでRTで解凍し、50 mLコニカルチューブで穏やかに振とう(5 x g)しながら、4°CでPBS(~10 mL/臓器全体)で洗浄します。手順 2 に進みます。

2.組織のクリアリング

注:この作業で行われたすべての組織クリアリングは、CUBICプロトコルI22を使用して行われました。3種類のカクテルを使用しました:灌流中の脱脂と急速な脱色のためのCUBIC-P、脱脂と脱色のためのCUBIC-L、RIマッチングのためのCUBIC-R。DNA染色および免疫染色は、それぞれCUBIC-HV 1 3D核染色キットおよびCUBIC-HV 1 3D免疫染色キットを用いて行った( 材料表参照)。

  1. 個々の臓器を10 mLの50%水で希釈したCUBIC-L( 材料の表を参照)に浸し、50 mLのコニカルチューブのRT(ON)で穏やかに振とう(5 x g)します。.チューブを振とうプレート上で平らに保ちます。
    注:組織の損傷を避けるために、臓器は同じチューブ内に維持され、溶液は真空システムを使用して収集されます。CUBIC-Lを調製するには、市販のカクテルを使用して、10%N-ブチルジエタノールアミンと10%Triton X-100を二重蒸留水に溶解します( 材料の表を参照)。
    注意: CUBIC-Lは深刻な眼の損傷を引き起こします。目と顔の保護具を着用してください。承認された廃棄物処理プラントに廃棄してください。
  2. サンプルを100%CUBIC-Lの10mLに6日間浸します(3日目に溶液をリフレッシュします)。
    注:この潜伏期間の終わりには、組織はほぼ完全に透明でなければなりません。
  3. 透明な臓器をPBS(0.05%NaN 3を添加したもの)で、穏やかに振とうしながら37°Cで2時間(3回)洗浄します(5 x g)。洗浄するたびに組織を新しい50 mLコニカルチューブに移し、Triton X-100を除去します。
    注:図2Bに記載されているように、実験の目的がトランスジェニックT. cruzi寄生虫またはマウスからの内因性発現レポータータンパク質を視覚化することである場合(図2C-F)、手順3、4、および5をスキップして、手順6に直接進みます。

3. DNA染色

  1. 市販の核酸色素( 材料表参照)を5 mLの染色バッファー(キットに含まれています)で1/2,500希釈で希釈します。
  2. 組織を核色素溶液に浸し、静置姿勢で15 mLのコニカルチューブを使用して、37°Cで穏やかに回転させて5日間インキュベートします。
  3. 15 mLの3D核染色洗浄バッファー(キットに含まれています)で、穏やかに振とうしながらRTで2時間(3回)洗浄します(5 x g)。
    注:他のDNA色素は、これらの濃度とインキュベーション時間で使用できます:DAPI(キットに含まれています):1/200、5日間のインキュベーション。BOBO-1:1/400、5日間のインキュベーション;ヨウ化プロピジウム(PI)(キットに含まれています):1/100、3日間のインキュベーション;RedDot2:1/250、3日間のインキュベーション。実験の具体的な目的が内因性発現レポータータンパク質の両方を視覚化し、核染色を使用することである場合は、手順4と5をスキップして、手順6に直接進んでください。

4.細胞外マトリックス(ECM)消化

注:ECMのヒアルロニダーゼ消化は、組織の深部領域への抗体の適切な浸透を促進するために行わなければならない28。

  1. 個々の臓器を15 mLのヒアルロニダーゼ反応バッファーに37°Cで2時間浸し、光から保護された平らな位置にある50 mLコニカルチューブに入れます。
    注:ヒアルロニダーゼ反応バッファーを調製するには、10 mMのCAPSOを溶解します。150 mMの塩化ナトリウム(NaCl)、および0.05%のNaN3 ( 材料の表を参照)を二重蒸留水中に入れ、pHを10に調整します。
  2. 75 μLの20 mg/mLのヒアルロニダーゼストックを425 μLのヒアルロニダーゼ反応バッファーに混合して酵素溶液を調製します。20 mg/mLのヒアルロニダーゼストックを調製するには、ヒアルロニダーゼを50 mMの炭酸塩バッファー、150 mMのNaCl、0.01%のBSA、および0.05%のNaN3 に溶解します( 材料の表を参照)。pHを10に調整し、-30°Cで77 μLの容量で分注します。
  3. ピペットを使用してヒアルロニダーゼ反応バッファーを捨て、酵素溶液(15 mLコニカルチューブに500 μL)に臓器を浸し、光から保護された静置姿勢で37°Cで24時間穏やかに振とうします(5 x g)。
  4. 50 mLコニカルチューブ内の15 mLのヒアルロニダーゼ洗浄バッファーでサンプルを、光から保護された水平位置で37°Cで穏やかに振とう(5 x g)しながら2時間(3回)洗浄します。
    1. ヒアルロニダーゼ洗浄バッファーを調製するには、50 mMの炭酸塩バッファー、150 mMのNaCl、0.1%(v / v)のトリトンX-100、5%(v / v)のメタノール、および0.05%NaN3を溶解します。pHを10に調整します。10x炭酸塩バッファー-NaClストックを調製するには、2.96 gの炭酸ナトリウム、1.86 gの炭酸水素ナトリウム、および8.77 gのNaClを0.05%NaN3 を含む100 mLの二重蒸留水に溶解し( 材料の表を参照)、pHを10に調整します。

5.免疫染色

  1. 以下の手順に従って抗α-SMA(α-小筋アクチン、 材料の表を参照)抗体を使用して血管系を標識します。
    1. 一次プラスコンジュゲートFabフラグメント二次抗体複合体を生成する。染色手順の1.5時間前にこの反応を開始します。
      1. 一次抗体と二次抗体の必要量を計算します(重量比で1:0.5で混合します)。
        注:一次抗体抗α-SMAの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋の断片を標識するには3.5μgが必要です。2.5 mg/mL 製品の場合、3.5/2.5 = 1.4 μL の抗体溶液が必要です。二次抗体AlexaFluor 647抗マウスFabフラグメントの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋フラグメントを標識するために1.75 μgが必要です。1.7 mg/mL 製品の場合、1.75/1.7 = 1 μL の抗体溶液が必要です。
      2. 一次抗体と二次抗体をアンバー色の 2 mL チューブで混合し、37 °C で 1.5 時間インキュベートします。
    2. バッファー交換のために、7.5 mLの2x HV1 3D免疫染色バッファー(キットに含まれています、 材料表を参照)を7.5 mLの二重蒸留水と混合し、組織サンプルを15 mLのコニカルチューブに水平位置で穏やかに振とう(5 x g)しながら32°Cで1.5時間浸します。抗体複合体の生成と同時にこの反応を開始します(免疫染色手順の1.5時間前)。
  2. 以下の手順に従って3D免疫染色を行います。
    1. 15 mLコニカルチューブで、 以下の補足ファイル1の抗体染色液を調製します。
    2. バッファー交換培地から組織サンプルを採取し(ステップ5.1.2)、抗体染色液に浸します。組織を個別に32°Cで1週間インキュベートし、チューブを軽く振とう(5 x g)し、光から保護された静置位置でインキュベートします。蒸発を避けるために、チューブをパラフィンフィルムで密封します。
    3. 4°Cに移動し、静置姿勢でONをインキュベートします。
    4. 1x HV1 3D免疫染色洗浄バッファー(キットに含まれています、 材料表を参照)を4°Cに冷却し、サンプルを15 mLバッファー(2回)で4°Cで30分間、穏やかに振とう(5 x g)します。ステップ5.2.7まで、15mLのコニカルチューブを水平位置に保ちます。
    5. ホルマリンを1x HV1 3D免疫染色洗浄バッファーで1%に希釈し、サンプルを8 mLの溶液に穏やかに振とうしながら4°Cで24時間浸漬します(5 x g)。
    6. 新鮮な1%ホルマリン溶液中で、穏やかに振とうしながら37°Cで1時間インキュベートします(5 x g)。
    7. 15 mLのPBSで25°Cで2時間、穏やかに振とう(5 x g)洗浄します。
  3. 以下の手順に従って、抗赤色蛍光タンパク質(RFP)抗体を使用してtdTomatoシグナルをブーストします。
    1. ステップ5.2.2と同じインキュベーション時間と温度に従ってください。一次抗体と二次抗体の量を計算し( 材料表を参照)、重量比で1:0.5で混合します。
      注:一次抗体抗RFPの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋の断片を標識するために5μgが必要です。1.25 mg/mL の製品の場合、5/1.25 = 4 μL の溶液が必要です。二次抗体Alexa Fluor 647抗ウサギFabフラグメントの場合、心臓全体または同様の寸法の骨格筋フラグメントを標識するには2.5 μgが必要です。1.5 mg/mL 製品の場合、2.5/1.5 = 1.7 μL の溶液が必要です。
    2. 補足ファイル1に記載されているように抗体染色液を調製します。
  4. 以下の手順に従って、抗GFPナノボディを使用してGFPシグナルをブーストします。
    1. ステップ5.2.2で説明したのと同じインキュベーション時間と温度に従ってください。
      注:抗GFPナノボディ( 材料の表を参照)はAlexa Fluor 647と結合しているため、抗体複合体の生成は不要です。
    2. 補足ファイル1に記載されているように抗体染色液を調製します。

6. RIマッチング

  1. 透明な臓器を5 mLの50%水で希釈したCUBIC-R +溶液( 材料の表を参照)にRT(ON)に浸し、50 mLのコニカルチューブに軽く振とう(5 x g)します。RIマッチングステップ全体を通して、チューブを立位に保ちます。
    注:以前の実験からのリサイクルCUBIC R +溶液は、このステップで再利用できます(最大4回)。CUBIC-R+溶液を調製するには、45%の2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン(アンチピリン)、30%のニコチンアミドまたはN-メチルニコチンアミド、および0.5%のN-ブチルジエタノールアミンを二重蒸留水に溶解するか、市販のCUBIC-R+バッファーを使用します( 材料の表を参照)。
    注意: CUBIC-R +は、皮膚の炎症、深刻な目の炎症、および臓器の損傷を引き起こします。保護手袋を着用し、目と顔の保護を確保してください。ほこり、煙、ガス、ミスト、または蒸気を吸い込まないでください。承認された廃棄物処理プラントに処分してください。
  2. 50%キュービックR+を5 mLの100%キュービックR+に置き換え、RTで2日間穏やかに振とう(5 x g)しながらインキュベートします。次に、組織を糸くずの出ないワイプのスタックに移し、組織を注意深く回転させて、臓器表面からCUBIC-R +溶液を5分間除去します。

7.取り付け

  1. 組織を乾燥させた後、6ウェル細胞培養プレート中の5 mLのマウント溶液(RI = 1.520)( 材料の表を参照)に移し、RTでインキュベートします(ON)。 特に臓器の表面の気泡を除去するために、組織を頻繁に回転させます。
    注意: 臓器は、マウントソリューションまたはCUBIC-R +で6か月以上保存できます。
  2. シアノアクリレートベースのゲル接着剤を使用して、組織を顕微鏡サンプルホルダーに接着します。
  3. 120 mLのマウント溶液で満たされた顕微鏡石英キュベットにサンプルを浸し、縦軸に対して横方向に画像化します。頂点と大動脈を水平に揃えて心臓を接着します。
    注:透明化およびマウントされた臓器は、ビブラトームで切片化し、共焦点顕微鏡によって高倍率で画像化することができます。臓器を2%アガロースに埋め込み、100〜500μmの切片を切断します。臓器は、鋭利な刃で手動で切片化して、厚い組織切片(>1000μm)を作成することもできます。切片化後、スライスをガラス底の35 mmペトリ皿に入れ、同じ取り付け液を使用してマウントし、マニキュアで密封し、共焦点顕微鏡で画像化します。

8. 画像取得

  1. マウントされたサンプルをライトシート顕微鏡で画像化します( 材料表を参照)。個々のスライス間の倍率とステップサイズを3μmに設定し、厚さ5μm、幅100%の左右のライトシートレーザーを使用します。露光時間を50〜100ミリ秒に設定し、蛍光信号強度に応じてレーザー出力を10%から80%に調整します。
    1. tdトマト発現寄生虫とDiR染色休眠アマスティゴテス(図2C)の共検出には、それぞれ赤(Ex/Em 561/620-660 nm)と赤外線(Ex/Em 785/845-55 nm)チャネルを使用します。CD8レポーターマウスにおけるT細胞とtdTomato発現寄生虫の共検出には(図2D)、それぞれ緑(Ex/Em 488/525-50 nm)と赤チャネルを使用します。
    2. 重感染アッセイ(図2E)、および核レポーターマウスにおけるGFPを発現する寄生虫の共検出(図2F)には、それぞれ緑と赤のチャネルを使用します。tdトマト発現寄生虫、核色素、および心臓血管系の検出(図3B、C)には、それぞれ赤、緑、遠赤(Ex/Em 640/680-730 nm)チャネルを使用します。
    3. 遠赤色チャネルで抗RFP抗体を検出し、緑チャネルを使用して抗GFPナノボディを検出します(図3D)。
  2. 取得したTIFF画像スタックを変換し、Imaris v9.7.2ソフトウェアを使用して臓器を3D再構築します( 材料表を参照)。

9. Imarisソフトウェアによる表面再構成と定量化

  1. 表面検出アルゴリズムツールを選択し、画像解析ソフトウェアでウィザードを開始します。
  2. 3D関心領域(ランダムに選択)で初期分析を実行し、それを3D臓器再建全体に適用します。 関心領域(ROI)を選択したら、分析する チャネル を選択し、 スムーズボタンのチェックを外して、 バックグラウンド減算を選択します。
    注: バックグラウンド サブトラクションは、ボクセルごとに一意のローカル バックグラウンド値を計算し、元のピクセル値からこれを減算します。対象物に収まる最大の球体の直径は、 T. cruzi感染細胞では最大200μm、T細胞では10μm、個々の寄生虫では5μmまででなければなりません。
  3. ヒストグラムを使用して分類を調整し、フィルター ドロップダウン リストを使用して分類する測定値を選択します。
    注:ヒストグラムを使用して分類を調整します:楕円率(扁平)と真球度の測定をお勧めします。
  4. ウィザードを終了し、 統計 ボタンを押して、寄生虫感染細胞またはT細胞の総数を、時点ごとの切断されたコンポーネントの数として取得します。

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結果

CUBIC固定組織をPBSで洗浄して固定液を除去した後、組織から色素と脂質を抽出するアミノアルコールの基本的な緩衝溶液であるCUBIC-Lカクテルと一緒にインキュベートし、組織構造を維持しながら組織の脱色を行いました。紙のグリッド線は、臓器の適切な透明化を示す組織を通して見ることができます(図2A)。脱脂質化後、組織を洗浄し、それぞれCUBIC-R+およびRIホモジナイゼーションおよびイメージング用のマウント溶液に浸漬した(図2B)。

野生型マウスに、DiR近赤外シアニン色素で予め染色したtdTomato発現トリポマスティゴテスを感染させた。マウスは感染の15日後に安楽死させ、無傷の心臓を解剖し、固定し、クリアしました。LSFMイメージングと3D再構成により、tdトマトを発現する増殖するT. cruzi寄生虫(赤)を可視化することができました。赤チャンネルの自己蛍光レベルは、心臓...

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ディスカッション

寄生虫と免疫応答の広範な全臓器イメージングの欠如は、宿主と寄生虫の相互作用の複雑さの理解を制限し、シャーガス病の治療法の評価を妨げます。本研究では、 C. cruzi感染マウスの無傷の臓器および組織を清澄化および染色するためにCUBICパイプラインを採用しました。

この研究では、複数の組織クリアリングプロトコルがテストされました(PACT32、ECi 33、FLASH34、iDISCO11、26、およびfDISCO13)。しかし、CUBICのみが高レベルのtdTomatoまたはGFP寄生虫蛍光を維持しました。同様に、以前の報告では、他の組織透明化アプローチと比較して、内因的に発現されたマーカーのCUBIC保存が示されました3...

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開示事項

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

須崎悦夫博士の組織透明化および免疫染色プロトコルに関する貴重な支援と推奨事項に感謝します。また、LSFMと共焦点イメージングを使用した技術サポートを提供してくれたCTEGD生物医学顕微鏡コアのM.カンダサミーに感謝しています。また、この研究を通して有益な提案をしてくれたタールトン研究グループのすべてのメンバーに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-メチルイミダゾールミリポアシグマ616-47-7
2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン (アンチピリンTCID1876
6ウェル 細胞培養プレートサーモフィッシャーサイエンティフィック140675
AlexaFluor 647 抗マウス Fab フラグメントジャクソン免疫研究所315-607-003
AlexaFluor 647 抗ウサギFab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44G-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/Jマウスクソン研究所株 #007914一般名:Ai14、Ai14DまたはAi14(RCL-tdT)-D
B6。CG-GT(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/Jマウスクソン研究所株 #007914一般名:Ai14、Ai14DまたはAi14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 ヨウ化物サーモフィッシャーサイエンティフィックB3582
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/Jマウスジャクソン研究所株 #032080共通名称:CD8A-CRE (E8III-CRE)
CAPSOSigma#C2278
クリーニングワイプ キムワイプ Kimberly-ClarkT8788
共焦点レーザー走査型顕微鏡ZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D免疫染色キットTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D核染色キットTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R +TCIT3741
シアノアクリレートベースのゲル瞬間接着剤スコッチ571605
DiR (DiIC18(7); 1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニン ヨウ化物) 会社: BiotiumBiotium#60017
エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorning
Falcon 遠心分離チューブ 50  mLコーニングCLS430290
ホルマリンSigma-AldrichHT501128
ヘパリンサーモフィッシャー サイエンティフィックJ16920。BBR
ヒアルロニダーゼSigma#H3884 または #H4272
Imaris ファイル コンバーター x64BitPlanev9.2.0
Imaris ソフトウェアBitPlanev9.3
ImSpector ソフトウェアLaVision BioTec、Miltenyi Biotecv6.7
静脈注射針 23-GSartori、Minisart シリンジ フィルター16534
Kimwipes糸くずの出ないワイプ
ライトシート 蛍光顕微鏡Miltenyi BiotecULtramicroscope II イメージングシステム
メタノールThermoFisher Scientific041838.K2
マイクロピペットチップ、10 & マイクロ;L、200 µLと1,000 & マイクロ;LAxygenT-300、T-200-YおよびT-1000-B
電動ピペットディスペンサーFisher Scientific、Fisherbrand03-692-172
取付液TCI M3294
N-ブチルジエタノールアミンTCIB0725
ニコチンアミドTCIN0078
N-メチルニコチンアミドTCIM0374
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
血清学的ピペットCostar 滅菌4488
振盪インキュベーターTAITECBR-43FM MR
アジ化ナトリウム (NaN3)サーモフィッシャーサイエンティフィック447815000
炭酸ナトリウム (Na2CO3)サーモフィッシャーサイエンティフィックL13098.36
塩化ナトリウム (NaCl)サーモフィッシャーサイエンティフィック447302500
炭酸水素ナトリウム (NaHCO3)サーモフィッシャーサイエンティフィック014707.A9
SYTOX-G グリーン核酸染色サーモフィッシャーサイエンティフィックS7020
トリトン X-100シグマ-アルドリッチT8787
ジャ ジャCLS430791

参考文献

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