動的細胞培養のための出口分画と統合されたマルチストリーム灌流バイオリアクター

サマリー

本稿では、細胞プロセスにおける溶質の分泌・吸収速度のダイナミクスを測定するための低コストのマルチチャネル灌流細胞培養システムを構築・運用する方法を提示する。システムはまた、細胞を動的刺激プロファイルにさらすこともできる。

要約

特定の細胞および組織機能は、従来の培養システムでは不十分に分解される数分から数時間の動的時間スケール内で動作します。この研究は、培養培地を細胞培養モジュールに連続的に灌流し、下流のモジュールで分画してこのスケールでダイナミクスを測定することを可能にする低コストの灌流バイオリアクターシステムを開発しました。このシステムは、ほぼ完全に市販の部品から構築されており、従来のマルチウェル細胞培養プレートで独立した実験を同時に行うために並列化することができます。このビデオ記事では、1つのマルチチャンネルシリンジポンプと修正フラクションコレクターだけで最大6つの培養物を並行して灌流するベースセットアップを組み立てる方法を示します。モジュラー設計上の有用な変形も提示され、溶質パルスまたは薬物動態様プロファイルなどの制御された刺激ダイナミクスを可能にする。重要なことに、溶質信号がシステムを通過すると、溶質分散のために歪む。さらに、MATLABを用いたトレーサーによる灌流セットアップの成分の滞留時間分布(RTD)を測定する方法が記載されている。RTDは、マルチコンパートメントシステム内の流れによって溶質信号がどのように歪むかを計算するのに役立ちます。このシステムは堅牢で再現性が高いため、基礎研究者は特殊な製造設備を必要とせずに簡単に採用できます。

概要

多くの重要な生物学的プロセスは、細胞および組織培養において、分から時間^1,2,3の時間スケールで起こる。これらの現象のいくつかは、タイムラプス顕微鏡⁴、生物発光¹、または他の方法を用いて自動化された方法で観察および記録され得るが、化学分析のための培養上清サンプルの収集を含む実験は、静置細胞培養においてしばしば手動で行われる。手動サンプリングは、頻繁または時間外のサンプリングタイムポイントの不便さのために、特定の研究の実現可能性を制限します。静置培養法のさらなる欠点には、化学的刺激への制御された一過性の曝露を含む実験が含まれる。静置培養では、刺激を手動で添加および除去する必要があり、刺激プロファイルは経時的な段階的変化に限定される一方、培地交換は他の培地成分も追加および除去し、制御不能な方法で細胞に影響を与える可能性がある⁵。流体システムはこれらの課題を克服することができますが、既存のデバイスは他の課題を提起します。マイクロ流体デバイスには、製造および使用のための特殊な機器とトレーニングの法外なコストがかかり、サンプルを処理するために微量分析方法が必要であり、灌流後に細胞をデバイスから回収することは困難です⁶。^{ここで説明した}タイプの実験7,8,9,10用に作成されたマクロ流体システムはほとんどなく、社内で製造された複数のカスタム部品で構築されており、複数のポンプまたはフラクションコレクタが必要です。さらに、著者らは、浮遊培養用の攪拌槽バイオリアクター以外の市販のマクロ流体灌流細胞培養システム(バイオマニュファクチャリングに有用であるが、生理学のモデリングおよび研究用に設計されていない)を認識していない。

著者らは以前、ほぼ完全に市販の部品¹¹で構成された低コストの灌流バイオリアクターシステムの設計について報告した。このシステムのベースバージョンでは、ウェルプレート内の複数の培養物を_CO2 インキュベーターに保持し、シリンジポンプからの培地を連続的に灌流することができ、培養物からの流出培地ストリームは、カスタム修正を施したフラクションコレクターを使用して、時間の経過とともに自動的にサンプルに分画されます。したがって、このシステムは、培養培地上清の自動サンプリングおよび経時的な培養物への連続溶質入力を可能にする。このシステムはマクロ流体でモジュール式で、新しい実験計画のニーズを満たすように簡単に変更できます。

ここで紹介する方法の全体的な目標は、細胞による物質の分泌速度または吸収速度を経時的に測定し、および/または細胞が正確で一過性の溶質シグナルに曝露される実験を可能にする灌流細胞培養システムを構築、特徴付け、および使用することである。このビデオ記事では、単一のシリンジポンプと修正フラクションコレクターを使用して最大6つの細胞培養物を同時に灌流できるベースセットアップを組み立てる方法について説明します。簡単なパルスおよび薬物動態様プロファイル¹²を含む、細胞を一過性の溶質濃度シグナルに曝露する実験を可能にするために追加のポンプおよび部品を利用する基本システム上の2つの有用なバリアントも提示される( 図1に示されている)。

図1:灌流システム設計の3つのバリエーション(上)基本的な灌流システム。(中央)複数の媒体源のための活栓を備えた灌流システム。(下)よく混合された分配量を模倣する攪拌タンクを備えた灌流システム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

流れ内の分散と拡散により、溶質信号は流れシステムを通過するときに歪んだり「塗りつぶされたり」します。この歪みは、滞留時間分布(RTD)¹³を使用することで定量化できます。この記事では、灌流システムのコンポーネントに対してトレーサー実験を実行する方法(図2)を説明し、測定データからRTDを生成するためのMATLABスクリプトを提供します。この分析の詳細な説明は、著者の以前の論文¹¹に記載されています。追加のMATLABスクリプトは、適切な機能をRTDに適合させ、物理パラメータを抽出し、RTDを使用して信号畳み込みを実行して、ユーザによって入力された溶質信号が灌流システム¹⁴を介してどのように伝播および歪むかを予測する。

図2:滞留時間分布 このチューブの長さなどのフローシステムコンポーネントのRTDは、トレーサーのパルスをシステムに入力し、収集されたフラクションに出るまでにどのように「スミア」するかを測定することによって測定されます。この図はEricksonら¹¹から修正されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1.ウェルプレート灌流用の部品を準備する

1. チューブの準備
   1. 灌流する細胞培養物ごとに2つの長さのシリコーンチューブ(内径1.6mm)を切断します。上流チューブとして使用されるピースが、シリンジポンプからインキュベーター内の細胞培養物まで到達するのに十分な長さであること、および下流のピースが細胞培養物からフラクションコレクターの最も遠い拡張位置まで到達できることを確認します。
   2. チューブの各部分に、ラベル付きテープで両端に固有のラベルを付けます。
2. ウェルプレートのストッパーを準備する
   1. 灌流するウェルプレートの各ウェルに1つのシリコーンストッパーを、気密シールでウェルにぴったりと収まるように適切な直径で入手します。
   2. ストッパーの底から余分な材料を切り取り、井戸に収まるようにし、内部に空気を入れるスペースを意図した液体レベルより上に残します。
   3. 2本の鈍い18G針を各ストッパーを通して、上部に押し込み、下部から出して、ウェルを通る流れの入口と出口として機能し、互いに正反対に、ウェル内の先端間の距離を最大にします。
   4. 出口の針の高さが灌流中の井戸内の液体レベルの安定した高さを決定するので、差し込まれた井戸内の針の高さを調整してください。
      注:出口針を液体レベルより上にして灌流を開始すると、レベルが針に達するまで液体がウェルに蓄積します。出口ニードルを液面より下にして灌流を開始すると、気泡がウェルに流れ込まない限り液面は安定したままになり、出口針と同じ高さになるまで液高が下がります。
3. 追加パーツの収集
   1. 灌流する細胞培養物ごとに、灌流全体に十分な培地を含むのに十分な大きさの滅菌シリンジを1本、さらにチューブを最初に充填するための追加量の培地を入手します。
   2. 灌流する培養物ごとに、1 つの女性ととげとげへの 2 つのルアー コネクタ、および 2 つの女性と 2 つの男性の Luer キャップを取得します。
4. 部品の洗浄と滅菌
   1. 部品を以前に使用したことがある場合は、0.1 N NaOHで灌流してから脱イオン水ですすぎ洗いをしてください。
   2. オートクレーブまたはその他の方法で、上記のすべての部品の無菌性を確保します。

2.マルチヘッドディスペンサーをレーザーカットし、フラクションコレクターに取り付けます

1. 図 3 のマルチヘッド ディスペンサー モデルをコンピューター支援設計プログラムで再作成するか、提供されているモデル DXF ファイル (補足ファイル 1) をダウンロードします。
2. レーザーカッターを使用して、アクリルシートの1/8からデザインをカットします。
3. ディスペンシングヘッドをフラクションコレクターの移動ベースに取り付けている3本のネジを外します。
4. マルチヘッドディスペンサーの 3 つの最小の穴を移動ベースのネジ穴に合わせ、ネジを穴からねじ込み直して取り付けます。
5. 3本のネジの気密性を調整して、ディスペンシング穴の列がその下の収集チューブに揃うまで、マルチヘッドディスペンサーを上下に傾けます。
6. 300 μLのピペットチップを目的の穴に慎重に通し、ディスペンスチップとして使用します。
   注:フラクションコレクターは、単一細胞培養物を灌流するためにマルチヘッドディスペンサーなしで使用できます。

3. コンポーネントRTDを測定し、信号畳み込みを実行する

1. 図2に示すように、トレーサーパルス用のポンプとシリンジを設定します。
   1. シングルチャンネルまたはマルチチャンネルシリンジポンプを2つ入手してください。
   2. 細胞培養実験中にフローシステムで使用される培地を表すバックグラウンド溶液を選択します。バックグラウンド溶液が培地に対して同様の物質移動特性を有することを確認する。多くの場合、脱イオン水が適切な選択です。
   3. 細胞培養実験中に関心のある溶質を表すトレーサー物質を選択します。トレーサーが目的の溶質と同様の物質移動特性を持ち、その濃度を測定できる必要があります。多くの場合、食用染料は適切な選択です。
   4. トレーサー物質をバックグラウンド溶液に溶解させてトレーサー溶液とする。
   5. 1つのシリンジにバックグラウンド溶液を充填し、1つのシリンジポンプにロードします。別のシリンジにトレーサー溶液を充填し、2番目のシリンジポンプにロードします。
   6. Luerコネクタを使用して、両方のシリンジを4方向活栓の3つのポートのうちの2つに接続します。
   7. 活栓をバックグラウンド溶液に閉じ、開いているポートから滴り落ち始めるまで、トレーサー溶液を活栓にポンプで送り込みます。ポンプを停止し、シリンジをさらに調整しないでください。
      注:実験の時間制限部分を開始する前に、シリンジポンプの可動バーをシリンジプランジャーに押し付けることが重要です。これにより、ポンプが始動したときにすぐに流れを開始することができます。さもなければ、ポンプは始動するかもしれないが、移動バーがプランジャー位置に追いつくまで流れは実際には始まらない。
   8. トレーサー溶液への活栓を閉じ、残りのトレーサー溶液がすべて開いたポートから洗い流されるまで、バックグラウンド溶液を活栓にポンプで送り込みます。ポンプを停止し、シリンジをさらに調整しないでください。
2. 対象のフローシステムコンポーネントとフラクションコレクターの設定
   1. RTD 解析に必要なフローシステムコンポーネントを設定します。測定対象のコンポーネントが、適切な長さと柔軟性の下流チューブで終了し、動作中にフラクションコレクタに到達するようにします。
   2. 下流チューブの端部を、マルチヘッドディスペンサーのピペットチップディスペンサーに、ぴったりと接続されるように挿入します。
   3. 四方活栓の開いたポートを、測定するコンポーネントの入口に取り付けます。バックグラウンド溶液を、細胞培養実験中と同じように完全に満たされるまで成分を通してポンプで送り、フラクションコレクター分注チップから滴り落ち始めます。ポンプを停止します。
3. トレーサーパルスの注入、フラクションの収集、トレーサーの測定
   1. トレーサー溶液のポンプを所望の流量に設定します。バックグラウンド溶液への活栓を閉じ、トレーサー溶液の流れを開始します。同時に、分数コレクターを起動します。
   2. トレーサー溶液の流れを短時間継続して、トレーサーのインパルス入力を近似します。10分のパルス持続時間は、1mL/hの流速でRTDに良好に作用することが見出された。
      メモ:トレーサパルスが短すぎると、測定可能な流量に十分なトレーサが流れに入りません。パルスが長すぎると、インパルスに近似しなくなり、RTDの形状が変わります。
   3. トレーサー溶液パルス期間の終わりに、トレーサー溶液ポンプを停止する。活栓をトレーサー溶液にすばやく閉じ、同じ流量でバックグラウンド溶液の流れを開始します。
   4. すべてのトレーサーがシステムを通過して収集された画分に入るまで、バックグラウンド溶液が流れ、フラクションが収集されるようにします。
   5. システムを停止し、フラクション中のトレーサー濃度を測定します。完全に分配された画分のみを含む。分数のコレクションの途中で収集が停止した場合は、その分数を含めないでください。
4. MATLABで測定されたデータから滞留時間分布(RTD)を計算する
   注:このMATLABスクリプトによって実行された分析の書面による説明は、著者の以前の出版物¹¹に記載されており、理論の議論は文献¹³で広く入手可能です。
   1. 濃度データを含む.xlsxファイルを 、補足ファイル 2 で提供されているexample_tracer_data.xlsxスプレッドシートの形式で作成します。トレーサーの濃度値を、行 2 の左から右に時系列で分数 (任意の単位) に入力します。パルスの開始からセルA5の最後のフラクションの終了までの経過時間を入力し、セルA8にトレーサーパルスの長さを分単位で入力します。
   2. .xlsxファイルを MATLAB ディレクトリに保存します。
   3. 補足 ファイル 3 の RTD_From_Data.m スクリプトを MATLAB エディターで開きます。
   4. スクリプトの「 データのロード」 セクションの最初の行の括弧内の.xlsxファイルの名前を、スクリプト・ファイル内に記述された指示に従って、新しい.xlsxデータ・ファイルの名前に置き換えます。スクリプトを実行します。
   5. スクリプトがRTD解析¹³を正常に実行し、RTDのプロットを生成し、RTD上の数値積分の値を1に等しいように返すことを確認します。スクリプトによって MATLAB ディレクトリに保存された時間ベクトル (t) および関連する RTD 値ベクトル (Et) を見つけます。
5. モデル関数を MATLAB の RTD に当てはめる
   1. 補足ファイル 4 から MATLAB エディターで Fit_RTD_Function.m スクリプトを開きます。
   2. RTDに適合するようにコメントアウトされた3つのモデル関数の1つを選択してください:円筒管内の層流のためにRTDに適合する軸分散モデル¹³。よく攪拌されたタンクに適合するCSTRモデル¹³。n−CSTRモデル¹⁵は、より大きなウェルプレートにほぼ適合する。ここに含まれていない別のモデルに合わせるには、同じ形式でスクリプトに追加します。
   3. フィッティング用に選択したモデルを含むスクリプトのセクションのコメントを削除します。
   4. パラメーターの初期推測値を、RTD に適した値に変更します。
   5. スクリプトを実行して、RTD データにオーバーレイされた適合関数のプロットを生成し、関数の適合パラメータ値を出力します。適合度が非常に悪い場合、またはエラーが発生した場合は、パラメータの初期推測を変更して、スクリプトを再実行します。
6. MATLABでの信号畳み込みの実行
   1. 1つの信号と1つのRTDまたは2つのRTDのいずれかを選択して、畳み込みます。
   2. 補足 ファイル 5 の Signal_Convolution.m スクリプトを MATLAB エディターで開きます。
   3. 畳み込む2つの信号(すなわち、1つの信号と1つのRTD、または2つのRTD)のそれぞれについて、所望の単位で等間隔に間隔をあけた時点の1つのベクトルと、その時点での信号値の対応するベクトルを定義する。
      メモ: 2 つの信号のベクトルは、同じ数の要素と同じサイズの時間ステップを持つ必要があります。このため、RTDを、任意の時間間隔で任意の数のポイントについてサンプリングできる連続関数として持つと便利です。
   4. MATLABに2つの信号を入力し、スクリプトを実行して出力信号の時間ベクトルと信号ベクトルを取得します。

4. ウェルプレート内の細胞による基本的な灌流システムのセットアップ

1. ウェルプレートを準備する
   1. ウェルプレート培養物が灌流実験に適切な培地深さを有することを確認する。灌流を開始する前に、必要に応じて最終的な培地交換、刺激、またはその他のステップを実行します。浮遊細胞が灌流されている場合は、プレートを遠心分離して底部にあることを確認します。
   2. 無菌条件下で、針を引き上げた状態で、針でストッパーをウェルプレート培養物に挿入します。ストッパーが所定の位置に収まったら、出口針の高さが安定した液体レベルを決定するように、針を灌流のための所望の高さまで下げる。
   3. 針をオスのLuerキャップでキャップし、使用するまでウェルプレート全体をインキュベーターに入れたままにします。
2. シリンジと上流チューブを準備する
   1. 無菌条件下では、灌流の所望の持続時間のために十分な培地で灌流される培養物ごとに1つのシリンジを充填し、さらに上流のチューブを充填するのに十分な追加の培地を加えた。
   2. 上流チューブをシリンジに取り付けるには、メスとバーブのLuerコネクタを使用します。チューブのもう一方の端に、オスとバーブのルアーコネクタを挿入します。
   3. 上流のチューブが完全に培地で満たされるまで、シリンジから培地を分配します。
   4. チューブの開放端をメスのルアーキャップでキャップします。
      メモ:すべてのレプリケートシリンジは、この時点でまったく同じ体積を持つ必要があります。それらの体積が等しくない場合、プランジャーは異なる位置にあり、それらはすべて単一のマルチチャネルシリンジポンプにうまく収まるわけではありません。
3. 無菌条件下では、オス-バーブLuerコネクタを下流チューブの一端に挿入し、メスLuerキャップでキャップします。
4. 準備されたすべてのチューブ、シリンジ、およびウェルプレートを、灌流に使用するインキュベーターに慎重に持参してください。
5. シリンジポンプとフラクションコレクターをインキュベーターの近くの所望の場所に置きます。シリンジポンプをインキュベーターの上または近くに置き、フラクションコレクターをインキュベーターの隣、ポートの近くに置きます。
6. すべての上流および下流のチューブのキャップされた端を束ね、インキュベーターの外側からポートを介して内側に押し込みます。
7. シリンジをシリンジポンプにロードし、下流チューブの開放端をフラクションコレクタのマルチヘッドディスペンサーのディスペンシングピペットチップに挿入します。
8. インキュベーター内では、上流のチューブの弛みをできるだけインキュベーターに引き込み、流れる媒体がインキュベーターの空気から熱とCO2を受け取ることができるチューブの長さを最大にします。これらを所定の位置に保持しながら、下流のチューブをインキュベーターから引き出し、フラクションコレクターの最も遠い拡張ポイントに到達できるようにしながら、キャップされた端部をインキュベーター内に保持します。
9. 差し込まれた各井戸について、針と、その井戸の上流および下流のチューブのキャップをすばやく外し、Luerコネクタと一緒に取り付けます。
10. すべての部品が接続されたら、シリンジポンプを比較的高速で短時間稼働させ、すべての流れが正しく流れていることを確認します。
11. この時点で、培地でいっぱいの下流チューブで実験を開始したい場合には、全てが満たされるまでポンプを稼働させ続ける。それ以外の場合は、ポンプを停止します。
12. シリンジポンプの流量とフラクション収集の頻度を設定し、両方のマシンを同時に起動して実験を開始します。目的の実験期間分の分画を収集します。

5.複数の媒体源用の活栓で灌流システムを設定する

1. 上記のステップ 4.1 のすべてのサブステップを実行します。
2. 灌流に使用する2つの培地を用意し、最初に分注する培地を1として、もう一方を培地2として標識する。
3. 灌流する各培養物について、1つのシリンジに、その分配期間中に十分な培地1と、灌流システムを最初に充填するのに十分な容量を加えたものを充填する。2番目の注射器に,その神権時代の間,十分な媒体2を充填する。
4. 両方のシリンジを4方向活栓の3つのポートのうちの2つに接続します。
   メモ:シリンジを活栓に接続するためのチューブの長さが必要な場合があります。
5. 活栓とシリンジを上記のステップ3.1.7-3.1.8と同様の方法で準備し、活栓を媒体1に閉じ、媒体2を活栓に分配して、開いたポートから滴り落ち始めます。
6. 活栓を媒体2に閉じ、すべての残留媒体2が開放ポートから洗い流されるまで媒体1を活栓に分配する。
7. 上流のチューブを、メスとバーブのLuerコネクタを使用して、開いた活栓ポートに取り付けます。チューブのもう一方の端に、オスとバーブのルアーコネクタを挿入します。
8. 上流のチューブが完全に培地で満たされるまで、シリンジから培地1を分注する。
9. 上記のステップ4.3-4.11に進み、両方のシリンジを別々のシリンジポンプに装填し、分注媒体1のみを装填します。
10. 培地1のシリンジポンプ流量とフラクション収集の頻度を設定し、両方のマシンを同時に起動して実験を開始します。
11. 培地源を変更しようとするときは、培地1用シリンジポンプを速やかに停止し、活栓を培地1に閉め、培地2用シリンジポンプを起動する。後で必要に応じて、同様の方法でソースを培地1に戻します。
12. 目的の実験期間分の分画を収集します。

6.薬物動態を模倣するために攪拌タンクで灌流システムを設定する

1. 目的の薬物の薬物動態データを取得し、それが濃度ピークとそれに続く指数関数的崩壊からなることを確認する。
2. ピークを時刻 0 に設定し、ピークより前のデータ ポイントを削除した後、Stirred_Tank_Fit.m スクリプト (補足ファイル 6) を使用して、攪拌槽の RTD 式をデータに合わせます。v(所望の灌流流量)と、ベクトルのペアとしてスクリプトに直接適合するデータを、時間値と濃度値のtとCとともに、それぞれ入力します。スクリプトを実行して、必要な攪拌タンク容積であるパラメータVを出力します。
3. 灌流システムのレイアウトを計画して、2 つのシリンジポンプとインキュベーターの上流にあるプレートシェーカーを含めます。
4. 活栓を超えた灌流システムコンポーネントのRTDを測定し、さまざまな薬物パルス持続時間と濃度でRTDの信号畳み込みを実行して、適切な薬物動態プロファイルを見つけます。この計算では、攪拌槽RTD方程式を適合させます。
5. 上記の手順 5.1 ~ 5.8 に進みます。
6. セットアップ用の攪拌タンクとして適切なサイズの追加のウェルプレートを使用してください。各ウェルは、1つの灌流培養のための撹拌槽として機能し得る。必要な量の媒体Vで井戸を満たし、最初に引き上げた針で井戸を塞ぎ、次に井戸の底に押し込み、針にキャップを付けます。
7. シリンジをシリンジポンプに積み込み、シリンジからチューブを攪拌タンクのキャップ付き入口針にすばやく接続します。次いで、細胞培養上流管入口を撹拌槽の出口針に接続する。
8. 手順 5.9 ~ 5.10 に進みます。
9. 所望の時間に、ステップ5.11で説明されるように、薬物を含む分注媒体2に切り替える。薬物注入が完了したら、培地1に戻します。
10. ステップ 5.12 に進みます。

図3:マルチヘッドディスペンサー レーザーカットマルチヘッドディスペンサーの設計。この図はEricksonら¹¹から修正されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

プロトコルのセクション5からの複数の培地源を用いた灌流システムを用いて、腫瘍壊死因子α(TNF−α)の1.5時間パルスに応答してヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞における活性化B細胞(NF−κB)転写因子の核因子カッパ軽鎖増強剤によって駆動されるレポーター遺伝子の発現動態を測定した。HEK293細胞を、NF-κB応答エレメントを含むNFKBと呼ばれるプロモーターによって駆動されるガウシアルシフェラーゼ(GLuc)を含む遺伝子構築物を有するレンチウイルスベクターを用いて安定に形質導入してNFKB-GLuc HEK293細胞を作成し、これを蛍光活性化細胞選別(FACS) を介して 選別して形質導入細胞を単離した。選別した細胞は、使用時まで凍結保存した。

灌流培養ごとに、灌流セットアップには、細胞を含むプラグ付き48ウェルプレートにつながるチューブの1 mの上流セクション、続いて0.5 mL/h(0.0083 mL/min)の流速でマルチヘッドフラクションコレクターにつながる1 mの下流チューブが含まれていました。1 m チューブ単独およびフルセットアップ (1 m...

ディスカッション

本研究は、TNF-αの一過性パルスに応答したNF-κB駆動遺伝子発現の動態を測定した具体例を用いて実証された複数の培地源を用いた灌流細胞培養システムの組み立てと操作を説明する。灌流システム構成要素のRTDを測定し、モデル化し、シグナル畳み込みを使用して、TNF-αパルスへの細胞の曝露と、収集された流出培地画分中のTNF-α分布の両方を予測した。細胞をパルスに曝露し、画分を40時間収集した後、画分中のGLucを測定し、予測されたTNF-αシグナルとともにプロットして刺激応答ダイナミクスを明らかにした。

この灌流法には欠点がないわけではない。特に、このシステムは、インキュベーター内にセットアップした後にチューブをウェルプレートに接続する重要な短いステップのために、無菌性の危険性を伴います。著者の経験では、汚染は非常にまれです。それにもかかわらず、汚染リスクは以下の方法で軽減することができる。1つ目は、すべてのセルハンドリング手順と滅菌接続をバイオセーフティキャビネットで実行することです。無菌性を改善するために考慮することができる追加の予防措置は、細胞培養物の入口にインラインで0.22μ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
18ゲージ1 1/2-シリンジおよびディスペンシングマシンで使用するための使い捨てプローブ針	グレイン	ジャー5FVK2
293T細胞	ATCC	CRL-3216	HEK 293T細胞は、代表的な結果実験で使用されました。
96ウェルクリアボトムプレート、Corning	VWR	89091-010	RTD実験での色素濃度の測定用プレート、代表的な結果実験でのGLuc用プレートです。
BD 使い捨てシリンジ、ルアーロックチップ付き、5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac フラクションコレクター	Bio-Rad	7410002	フラクションコレクターは、単一のストリームに使用することも、複数のストリームからの収集を可能にするために当社の方法を使用して変更することもできます。
透明高強度UV耐性アクリル 12インチ x 12インチ x 1/8インチ	McMaster-Carr	4615T93	このシートは、BioFracフラクションコレクターに取り付けることができるマルチヘッドディスペンサーを製造するために、補足材料のDXFファイルに従ってレーザーカッターを使用してカットされます。
結果でGaussiaルシフェラーゼ生物発光アッセイで使用される	セレンテラジンネイティブ	NanoLight	テクノロジー303
Corning Costar TC処理マルチウェルプレート、サイズ48 ウェル、ポリスチレンプレート、平底ウェル	ミリポアシグマ	CLS3548	代表的な結果で293T細胞を増殖させ、灌流するために使用されます。
コーニング Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	フィッシャー・サイエンティフィック	720081サイ	プラグを差し込んで攪拌タンクとして使用し、灌流中の薬物動態プロファイルを生成することができます。灌流用の細胞を含めることもできます。
DMEM、高グル	コース サーモフィッシャー サイエンティフィック	11965126
エピローグ Zing 24 レーザー	カッティング エッジ システム	エピローグ Zing 24	レーザー カッターは、アクリル シートからマルチヘッド ディスペンサーを製造するために使用されます。他のレーザーカッターを使用することもできます。
Fisherbrand 滅菌シリンジ シングルユース、ルアーロック、20 mL	フィッシャーサイエンティフィック	14-955-460
フィッシャーブランド滅菌シリンジ、シングルユース、ルアーロック、60 mL	フィッシャーブランド
プレミアムマイクロ遠心チューブ:1.5mL	フィッシャーサイエンティフィ	05-408-129	フラクション収集用マイクロ遠心チューブ。
フィッシャーブランド プレーンエンドフィ	ッシャーサイエンティフィック	14-961-26	フラクションを収集するためのガラス管。
フィッシャーブランド SureOne マイクロポイント ピペット チップ、ユニバーサル フィット、フィルターなし	ッシャー サイエンティフィ	2707410	マルチヘッド ディスペンサーとチューブに最適で、ディスペンス チップとして機能します。
ギブコ DPBS、粉末、カルシウム、マグネシウムなし、	フィッシャーサイエンティフィック	21600010	リン酸塩緩衝生理食塩水。
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	オービタルシェーカーは、攪拌タンクを混合しておくために使用されます。
Masterflex フィッティング、ポリカーボネート、4ウェイストップコック、オス型ルアーロック、非滅菌; 10/PK	コールパーマー	EW-30600-04	RTD実験および細胞培養実験用の複数のインレットストリームを結合するために使用されます。
Masterflex フィッティング、ポリカーボネート製、ストレート、メス型ルアー x キャップ、25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex フィッティング、ポリプロピレン製、ストレート、メス型ルアー - ホースバーブアダプター、1/16"	コールパーマー	EW-45508-00
Masterflex フィッティング、ポリプロピレン製、ストレート、オス型ルアーロック - ホースバーブアダプター、内径 1/16"	コールパーマー	EW-45518-00
Masterflexフィッティング、ポリプロピレン、ストレート、オスルアーロック-プラグアダプター;25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S 精密ポンプチューブ、プラチナ硬化シリコーン、L/S 14; 25 フィート	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. 新しいバージョンも使用できます。一部の古いバージョンは動作する場合があります。
NE-1600 6チャンネルプログラマブルシリンジポンプ	新時代のポンプシステム	NE-1600
ラックセット F1	・ラッド	フラ	コレクターに収集チューブを保持するための7410010ラック。
組換えヒトTNF-α(HEK293発現)タンパク質、CF	Bio-Techne	10291-TA-020	代表的な結果で293T細胞を刺激するために使用されるサイトカイン。
サンゴバンソリッドストッパー、バーシリックシリコン、サイズ:00、底部10.5mm	サンゴバン	DX263015-50	48ウェルプレートに適合します。
サンゴバンソリッドストッパー、バーシリックシリコン、サイズ:4 底部21mm	サンゴバン	DX263027-10	12ウェルプレートに適合します。
水酸化ナトリウム、10.0 N 水溶液 APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	ヘッド ディスペンサー DXF ファイルの作成に使用した SolidWorks CAD ソフトウェア。
Varioskan LUXマルチモードマイクロプレートリーダー	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plateリーダー。
ウィルトンカラーライトパフォーマンスカラーシステムベースリフィル、ブルー	マイケルズ	10404779	ブリリアントブルーFCFを配合したブルー食用色素で、RTD実験のトレーサーとして使用されます。吸光度スペクトルは628nmでピークに達します。