本稿では、細胞プロセスにおける溶質の分泌・吸収速度のダイナミクスを測定するための低コストのマルチチャネル灌流細胞培養システムを構築・運用する方法を提示する。システムはまた、細胞を動的刺激プロファイルにさらすこともできる。
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この記事について
サマリー
要約
特定の細胞および組織機能は、従来の培養システムでは不十分に分解される数分から数時間の動的時間スケール内で動作します。この研究は、培養培地を細胞培養モジュールに連続的に灌流し、下流のモジュールで分画してこのスケールでダイナミクスを測定することを可能にする低コストの灌流バイオリアクターシステムを開発しました。このシステムは、ほぼ完全に市販の部品から構築されており、従来のマルチウェル細胞培養プレートで独立した実験を同時に行うために並列化することができます。このビデオ記事では、1つのマルチチャンネルシリンジポンプと修正フラクションコレクターだけで最大6つの培養物を並行して灌流するベースセットアップを組み立てる方法を示します。モジュラー設計上の有用な変形も提示され、溶質パルスまたは薬物動態様プロファイルなどの制御された刺激ダイナミクスを可能にする。重要なことに、溶質信号がシステムを通過すると、溶質分散のために歪む。さらに、MATLABを用いたトレーサーによる灌流セットアップの成分の滞留時間分布(RTD)を測定する方法が記載されている。RTDは、マルチコンパートメントシステム内の流れによって溶質信号がどのように歪むかを計算するのに役立ちます。このシステムは堅牢で再現性が高いため、基礎研究者は特殊な製造設備を必要とせずに簡単に採用できます。
概要
多くの重要な生物学的プロセスは、細胞および組織培養において、分から時間1,2,3の時間スケールで起こる。これらの現象のいくつかは、タイムラプス顕微鏡4、生物発光1、または他の方法を用いて自動化された方法で観察および記録され得るが、化学分析のための培養上清サンプルの収集を含む実験は、静置細胞培養においてしばしば手動で行われる。手動サンプリングは、頻繁または時間外のサンプリングタイムポイントの不便さのために、特定の研究の実現可能性を制限します。静置培養法のさらなる欠点には、化学的刺激への制御された一過性の曝露を含む実験が含まれる。静置培養では、刺激を手動で添加および除去する必要があり、刺激プロファイルは経時的な段階的変化に限定される一方、培地交換は他の培地成分も追加および除去し、制御不能な方法で細胞に影響を与える可能性がある5。流体システムはこれらの課題を克服することができますが、既存のデバイスは他の課題を提起します。マイクロ流体デバイスには、製造および使用のための特殊な機器とトレーニングの法外なコストがかかり、サンプルを処理するために微量分析方法が必要であり、灌流後に細胞をデバイスから回収することは困難です....
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プロトコル
1.ウェルプレート灌流用の部品を準備する
- チューブの準備
- 灌流する細胞培養物ごとに2つの長さのシリコーンチューブ(内径1.6mm)を切断します。上流チューブとして使用されるピースが、シリンジポンプからインキュベーター内の細胞培養物まで到達するのに十分な長さであること、および下流のピースが細胞培養物からフラクションコレクターの最も遠い拡張位置まで到達できることを確認します。
- チューブの各部分に、ラベル付きテープで両端に固有のラベルを付けます。
- ウェルプレートのストッパーを準備する
- 灌流するウェルプレートの各ウェルに1つのシリコーンストッパーを、気密シールでウェルにぴったりと収まるように適切な直径で入手します。
- ストッパーの底から余分な材料を切り取り、井戸に収まるようにし、内部に空気を入れるスペースを意図した液体レベルより上に残します。
- 2本の鈍い18G針を各ストッパーを通して、上部に押し込み、下部から出して、ウェルを通る流れの入口と出口として機能し、互いに正反対に、ウェル内の先端間の距離を最大にします。
- 出口の針の高さが灌流中の井戸内の液体レベルの安定した高さを決定するので、差し込まれた井戸内の針の高さを調整してください。
注:出口針を液体レベルより上にして灌流を開始すると、レベルが針に達するまで液体がウェルに....
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結果
プロトコルのセクション5からの複数の培地源を用いた灌流システムを用いて、腫瘍壊死因子α(TNF−α)の1.5時間パルスに応答してヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞における活性化B細胞(NF−κB)転写因子の核因子カッパ軽鎖増強剤によって駆動されるレポーター遺伝子の発現動態を測定した。HEK293細胞を、NF-κB応答エレメントを含むNFKBと呼ばれるプロモーターによって駆動されるガウシアルシフェラーゼ(GLuc)を含む遺伝子構築物を有するレンチウイルスベクターを用いて安定に形質導入してNFKB-GLuc HEK293細胞を作成し、これを蛍光活性化細胞選別(FACS) を介して 選別して形質導入細胞を単離した。選別した細胞は、使用時まで凍結保存した。
灌流培養ごとに、灌流セットアップには、細胞を含むプラグ付き48ウェルプレートにつながるチューブの1 mの上流セクション、続いて0.5 mL/h(0.0083 mL/min)の流速でマルチヘッドフラクションコレクターにつながる1 mの下流チューブが含まれていました。1 m チューブ単独およびフルセットアップ (1 m.......
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ディスカッション
本研究は、TNF-αの一過性パルスに応答したNF-κB駆動遺伝子発現の動態を測定した具体例を用いて実証された複数の培地源を用いた灌流細胞培養システムの組み立てと操作を説明する。灌流システム構成要素のRTDを測定し、モデル化し、シグナル畳み込みを使用して、TNF-αパルスへの細胞の曝露と、収集された流出培地画分中のTNF-α分布の両方を予測した。細胞をパルスに曝露し、画分を40時間収集した後、画分中のGLucを測定し、予測されたTNF-αシグナルとともにプロットして刺激応答ダイナミクスを明らかにした。
この灌流法には欠点がないわけではない。特に、このシステムは、インキュベーター内にセットアップした後にチューブをウェルプレートに接続する重要な短いステップのために、無菌性の危険性を伴います。著者の経験では、汚染は非常にまれです。それにもかかわらず、汚染リスクは以下の方法で軽減することができる。1つ目は、すべてのセルハンドリング手順と滅菌接続をバイオセーフティキャビネットで実行することです。無菌性を改善するために考慮することができる追加の予防措置は、細胞培養物の入口にインラインで0.22μ.......
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開示事項
著者らは、競合する利益を宣言していない。
謝辞
この研究は、助成金番号の下で支援を受けて実施されました。国立衛生研究所のR01EB012521、R01EB028782、およびT32 GM008339。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 18ゲージ1 1/2-シリンジおよびディスペンシングマシンで使用するための使い捨てプローブ針 | グレイン | ジャー5FVK2 | |
| 293T細胞 | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T細胞は、代表的な結果実験で使用されました。 |
| 96ウェルクリアボトムプレート、Corning | VWR | 89091-010 | RTD実験での色素濃度の測定用プレート、代表的な結果実験でのGLuc用プレートです。 |
| BD 使い捨てシリンジ、ルアーロックチップ付き、5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac フラクションコレクター | Bio-Rad | 7410002 | フラクションコレクターは、単一のストリームに使用することも、複数のストリームからの収集を可能にするために当社の方法を使用して変更することもできます。 |
| 透明高強度UV耐性アクリル 12インチ x 12インチ x 1/8インチ | McMaster-Carr | 4615T93 | このシートは、BioFracフラクションコレクターに取り付けることができるマルチヘッドディスペンサーを製造するために、補足材料のDXFファイルに従ってレーザーカッターを使用してカットされます。 |
| 結果でGaussiaルシフェラーゼ生物発光アッセイで使用される | セレンテラジンネイティブ | NanoLight | テクノロジー303 |
| Corning Costar TC処理マルチウェルプレート、サイズ48 ウェル、ポリスチレンプレート、平底ウェル | ミリポアシグマ | CLS3548 | 代表的な結果で293T細胞を増殖させ、灌流するために使用されます。 |
| コーニング Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | フィッシャー・サイエンティフィック | 720081サイ | プラグを差し込んで攪拌タンクとして使用し、灌流中の薬物動態プロファイルを生成することができます。灌流用の細胞を含めることもできます。 |
| DMEM、高グル | コース サーモフィッシャー サイエンティフィック | 11965126 | |
| エピローグ Zing 24 レーザー | カッティング エッジ システム | エピローグ Zing 24 | レーザー カッターは、アクリル シートからマルチヘッド ディスペンサーを製造するために使用されます。他のレーザーカッターを使用することもできます。 |
| Fisherbrand 滅菌シリンジ シングルユース、ルアーロック、20 mL | フィッシャーサイエンティフィック | 14-955-460 | |
| フィッシャーブランド滅菌シリンジ、シングルユース、ルアーロック、60 mL | フィッシャーブランド | ||
| プレミアムマイクロ遠心チューブ:1.5mL | フィッシャーサイエンティフィ | 05-408-129 | フラクション収集用マイクロ遠心チューブ。 |
| フィッシャーブランド プレーンエンドフィ | ッシャーサイエンティフィック | 14-961-26 | フラクションを収集するためのガラス管。 |
| フィッシャーブランド SureOne マイクロポイント ピペット チップ、ユニバーサル フィット、フィルターなし | ッシャー サイエンティフィ | 2707410 | マルチヘッド ディスペンサーとチューブに最適で、ディスペンス チップとして機能します。 |
| ギブコ DPBS、粉末、カルシウム、マグネシウムなし、 | フィッシャーサイエンティフィック | 21600010 | リン酸塩緩衝生理食塩水。 |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | オービタルシェーカーは、攪拌タンクを混合しておくために使用されます。 |
| Masterflex フィッティング、ポリカーボネート、4ウェイストップコック、オス型ルアーロック、非滅菌; 10/PK | コールパーマー | EW-30600-04 | RTD実験および細胞培養実験用の複数のインレットストリームを結合するために使用されます。 |
| Masterflex フィッティング、ポリカーボネート製、ストレート、メス型ルアー x キャップ、25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex フィッティング、ポリプロピレン製、ストレート、メス型ルアー - ホースバーブアダプター、1/16" | コールパーマー | EW-45508-00 | |
| Masterflex フィッティング、ポリプロピレン製、ストレート、オス型ルアーロック - ホースバーブアダプター、内径 1/16" | コールパーマー | EW-45518-00 | |
| Masterflexフィッティング、ポリプロピレン、ストレート、オスルアーロック-プラグアダプター;25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S 精密ポンプチューブ、プラチナ硬化シリコーン、L/S 14; 25 フィート | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. 新しいバージョンも使用できます。一部の古いバージョンは動作する場合があります。 |
| NE-1600 6チャンネルプログラマブルシリンジポンプ | 新時代のポンプシステム | NE-1600 | |
| ラックセット F1 | ・ラッド | フラ | コレクターに収集チューブを保持するための7410010ラック。 |
| 組換えヒトTNF-α(HEK293発現)タンパク質、CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | 代表的な結果で293T細胞を刺激するために使用されるサイトカイン。 |
| サンゴバンソリッドストッパー、バーシリックシリコン、サイズ:00、底部10.5mm | サンゴバン | DX263015-50 | 48ウェルプレートに適合します。 |
| サンゴバンソリッドストッパー、バーシリックシリコン、サイズ:4 底部21mm | サンゴバン | DX263027-10 | 12ウェルプレートに適合します。 |
| 水酸化ナトリウム、10.0 N 水溶液 APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | ヘッド ディスペンサー DXF ファイルの作成に使用した SolidWorks CAD ソフトウェア。 |
| Varioskan LUXマルチモードマイクロプレートリーダー | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plateリーダー。 |
| ウィルトンカラーライトパフォーマンスカラーシステムベースリフィル、ブルー | マイケルズ | 10404779 | ブリリアントブルーFCFを配合したブルー食用色素で、RTD実験のトレーサーとして使用されます。吸光度スペクトルは628nmでピークに達します。 |
参考文献
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
- Talaei, K., et al.
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