このプロトコルは、ゼラチンベースの顆粒支持体にリン酸カルシウムインクを堆積させることによって骨様構造を作製する3D印刷技術を説明する。印刷された骨類似体は自由形態で寄託され、多相構築物用の生細胞マトリックス内で印刷物を直接採取したり架橋したりするための柔軟性を備えています。
このプロトコルは、ゼラチンベースの顆粒支持体にリン酸カルシウムインクを堆積させることによって骨様構造を作製する3D印刷技術を説明する。印刷された骨類似体は自由形態で寄託され、多相構築物用の生細胞マトリックス内で印刷物を直接採取したり架橋したりするための柔軟性を備えています。
構造的には、骨組織は、階層的で高度に石灰化されたマトリックス内に埋め込まれた代謝活性細胞を含む無機-有機複合体です。この組織は、骨の不均一な環境のために複製することは困難です。細胞懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング(COBICS)は、骨のミネラルおよび細胞構造を独自に複製するミクロゲルベースのバイオプリンティング技術である。COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトを印刷します。この技術は、ゼラチンベースのミクロゲル懸濁液内の新規リン酸カルシウムベースのインクの自由形状押出によって可能になります。懸濁液の降伏応力特性は、沈着を可能にし、印刷された骨構造を支持する。UV架橋とナノ沈殿は、それを所定の位置に「ロック」します。細胞を含んだ生体材料内にナノ構造の骨模倣セラミックを印刷する機能は、マクロおよびミクロアーキテクチャの時空間制御を提供し、臨床現場での複雑な骨構造のリアルタイム製造を容易にします。
骨は、内因性の治癒能力が損なわれる重大な欠陥サイズまで、正常な細胞組成、配向、および機械的強度を再現することによって治癒できる体内で数少ない構造の1つとして、顕著な再生能力を持っています1。骨は、軟骨や靭帯とともに、体の動きをサポートおよび促進すると同時に、ミネラルや脂肪を貯蔵し、血球を生成します。硬くて緻密な結合組織として、骨は主に無機相、水、およびコラーゲン線維を主成分とする有機材料で構成されています2。細胞は、コラーゲンI繊維とハイドロキシアパタイト(HA)結晶のこの高度にミネラル化されたマトリックス内に埋め込まれ、階層構造を形成します3。
この組織の複雑な構成は、不均一な骨のマイクロおよびナノ環境を再現するための合成代替物の製造を非常に困難にします3。この目的のために、バイオセラミックス、細胞を含んだヒドロゲル、合成材料など、さまざまな材料が骨マトリックスを作成するためのソリューションとして提案されています。足場製造技術の中で、3D印刷ベースの技術が最近登場し、患者固有の治療の大きな可能性を備えた高度に洗練された精密な構造の製造を可能にする優れた能力により、組織工学コミュニティから多くの注目を集めています4,5,6
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1. 骨墨加工
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COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトをプリントします。複雑な骨構造のCOBICS形成とミクロゲル懸濁液中の細胞のコプリンティングを実証するために、骨インクで作られた骨様複合材料の代表的な画像を撮影し、COBICにおけるADSC生存率を最大7日間半定量的に分析しました。 図4 は、非ニュートン流体として振る舞い、高せん断応力下で粘性流体のように流れ始める固体として応答するゼラチンミクロゲルからなる支持浴に骨インクを堆積させることによって、複雑な骨様構造を作製する能力を示しています。次いで、印刷された構築物を粘性浴から単離することができる(図4A、B)。
図4の骨模倣構造を実現するために使用されるプリンタは、カスタマイズさ.......
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3D印刷技術COBICSは、生細胞を含む架橋可能なミクロゲル懸濁液への押し出しによる石灰化骨様構造の製造を可能にするために開発されました。この技術は、分解性ミクロゲル懸濁液に適用されており、細胞は、系11内で良好な生存率、拡散性、および骨形成分化能を示す。この手法を使用して作成されたコンストラクトの成功の重要な決定要因は、α-TCPベースのボーンインクの適切な合成です。第一に、α-TCPの形成は、適切な温度制御に大きく依存しています。リン酸三カルシウムの正しい相を形成するためには、反応が相境界を越えてβ-TCP相場14に入る前に、1,400〜1,200°Cの範囲内で反応をクエンチすることが重要です。X線回折分析は、単相α-TCP組成を確認するために使用することができる。その後、すべてのボーンインク前駆体を正しい比率で混合することは、押出印刷、硬化時間、およびナノ微細構造形成に最適な流動特性を備えたボーンインクの形成に不可欠です。GelMAミクロゲル懸濁液は、光架橋を介して印刷された構造の「ロック」を可能にするため、前駆体材料の比率を調整して、.......
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著者は、開示する利益相反がないことを宣言します。
著者らは、国立保健医療研究評議会(助成金番号GNT1111694およびGNT1141602)およびオーストラリア研究評議会(助成金番号FT180100417、FL150100060、およびCE14100036)に感謝したいと思います。著者らは、ニューサウスウェールズ大学の生物医学画像施設に感謝したいと思います。図は Biorender.com、Adobe Photoshop、Adobe Illustratorで作成され、有料サブスクリプションでエクスポートされています。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3Dプリンター押出機 | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL遠心分離管 | ファルコン | BDAA352070 | |
| 無水エタノール 100%変性 | 化学供給 | ||
| アセトン | 化学供給 | 154871 | |
| アルミナるつぼ | クアー | ||
| リン酸二塩基性アンモニウム (NaHPO4) | シグマ | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | オートデスク | ||
| バイオセーフティキャビネット レベル 2 | |||
| 炭酸カルシウム | グマ | 239216 | |
| リン酸水素カルシウム (CaHPO4) | シグマ | C7263 | |
| 細胞培養フラスコ | コーニング | さまざまな使用容量 | |
| セルロース透析チューブ、14 kDaカットオフ | シグマ | D9777遠心 | |
| 分離機 | エッペンドルフ | 5430R | |
| 遠心分離 | 機シグマ | 3-16KL | |
| 分注チップ、23 G | ノードソン | 7018302 | |
| DMEM、低グルコース、ピルビン酸 | サーモフィッシャー | 11885084 | |
| DPBS、カルシウム、マグネシウムサー | モフィッシャーなし | ||
| エレベーター炉 | Labec | ||
| エンジン HR マルチヘッドプリンター | Hyrel3D | ||
| ウシ胎児血清 | ボボゲン | ||
| ゼラチンA型、豚皮から | シグマ | G2500 | |
| 汎用ステンレス鋼 ヒント | ノードソンEF | ||
| グリセロール | シグマ | G9012 | |
| ヒト脂肪由来幹細胞 | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 共焦点顕微鏡 | ZEISS | ||
| 凍結乾燥機 (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| 磁気ホットプレートと攪拌機 | |||
| 無水メタクリ | Sigma 276685 | ||
| Mini 2 デスクトップ 3D プリンター | LulzBot | ||
| パラフィルムシーリングフィルム | フィルム | PM996 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャー | 15140122 | |
| 遊星ボールミル | |||
| 遊星ボールミルジャー | |||
| ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween-80 | シグマ | P6224 | |
| スキャン電子顕微鏡 | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| 科学 Kimwipes デリケートなタスクワイパー | Kimtech | 18813156 | |
| ステンレス鋼 標準試験ふるい | |||
| ひまわり油 | コミュニティ Co | ||
| トリプシン-EDTA 0.25% フェノールレッド | サーモフィッシャー | 25200056 | |
| ZEN顕微鏡ソフトウェア | ZEISS | ||
| 哺乳類細胞用生死生存率/細胞毒性キット | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM、低グルコース、フェノール不 | Thermo Fisher | 11054020 |
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