方法論記事

細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

DOI：

10.3791/63962

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2023年3月17日

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1Inflammation Core Facility, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

この記事について

サマリー

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AlPcS2aを介した発色団支援レーザー不活性化(CALI)は、生細胞の細胞内小胞(IV)の時空間的損傷を研究するための強力なツールです。

要約

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細胞内小胞(IV)は、小胞の細胞質へのエンドサイトーシスによって形成されます。IV形成は、IV膜の透過処理やエンドソームやリソソームの形成を通じて、さまざまなシグナル経路の活性化に関与しています。発色団支援レーザー不活性化(CALI)と呼ばれる方法は、IVの形成とIV制御の制御における材料の研究に適用されます。CALIは、膜透過処理によって誘導されるシグナル伝達経路を研究するためのイメージングベースの光力学方法論です。この方法は、選択された細胞小器官の時空間操作を細胞内で透過処理することを可能にする。CALI法は、エンドソームやリソソームの透過処理を通じて特定の分子を観察・モニタリングするために応用されています。IVの膜破裂は、ガレクチン-3などの糖鎖結合タンパク質を選択的に動員することが知られています。ここでは、AlPcS2a によるIV破裂の誘導と、障害のあるリソソームを標識するためのマーカーとしてのガレクチン-3の使用について説明しており、さまざまな状況下でのIV膜破裂の下流効果とその下流効果の研究に役立ちます。

概要

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細胞内小胞(IV)の一種であるエンドソームは、エンドサイトーシスによって形成され、その後リソソームに成熟します。さまざまな細胞内シグナル経路がIVの形成に関与しています。さらに、異なる内因性および外因性刺激がIVを損傷する可能性があります(たとえば、病原体は感染中に境界膜から逃げ出し、細胞質1に入る可能性があります)。これは通常、エンドサイトーシス小胞2の破裂を伴う。したがって、IVを標的にして損傷を与えるための技術は、関連する研究3で使用できます。

光線力学療法(PDT)は、腫瘍や病原体を殺すことによって病気と戦うための光依存療法です4。PDTでは、標的細胞は、光増感剤と呼ばれる非毒性発色団で標識され、光照射によって局所的に活性化され得る5,6。光増感剤は光からエネルギーを吸収して励起一重項状態に変化し、長寿命の励起三重項状態になります。三重項状態の光増感剤は、電子またはエネルギー移動を受け、酸素の存在下で活性酸素種(ROS)を形成することができ、照明領域7内の標識細胞を空間的に破壊することができる。結果は光の力によって異なります8.光増感剤の濃度と光照射の強度を制御することにより、発色団支援光不活性化(CALI)9と呼ばれる、細胞溶解なしで標的生体分子を選択的に不活性化することができます。さまざまな細胞内標的を選択的に標識できる光増感剤の大幅な開発により、CALIは、ヌクレオチドやタンパク質などの低分子生体分子、およびミトコンドリアやエンドリソソームなどの細胞小器官の生体分子の光を介した不活性化を制御するための貴重なツールになりました3,10,11,12,13。

CALIと比較して、細菌毒素14,15やリソソーム損傷に対するLeu-Leu-OMe16治療などの膜を損なうために化学的または物理的方法も使用されます。ただし、これらの方法では、細胞内のIVの大量の障害が表示されます。堅牢な光増感剤(すなわち、Al(III)フタロシアニンクロリドジスルホン酸(AlPcS2a))がCALIで使用されます。AlPcS2aは、エンドサイトーシスを介してリソソームを標的とし、制御領域17においてエンドソームまたはリソソームを破裂させるために使用される。AlPcS2aは、細胞膜不透過性のフタロシアニンベースの発色団であり、原形質膜上の脂質に結合し、エンドサイトーシスを介してインターナライズされ、最終的にはエンドサイトーシス経路18を介してリソソーム内に蓄積する。近赤外スペクトル領域内の光を吸収し、励起されたAlPcS2a18によって生成される主要なROSである一重項酸素を生成します。一重項酸素の崩壊は、細胞内の小さな領域(約10-20 nm)内での拡散と反応の距離を急速に制限します19。AlPcS2aインキュベーションと光照明の持続時間を調整することにより、細胞内領域内のIVの損傷の時空間制御が可能になります。したがって、CALIは、IV損傷の結果、およびIVの形成と調節を調べるための強力なツールになります。

この研究では、光増感剤としてAlPcS2aを使用するCALIの特定のプロトコルに対処します。このプロトコルは、エンドソームやリソソームを含むさまざまなタイプのIVに適用でき、膜破裂後のフォローアップ応答を調べるために使用できます。リソソーム破裂後に明らかにされた蛍光色素結合ガレクチン-316,20を発現するHeLa細胞を使用して、このプロトコルを実証します。

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プロトコル

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1. AlPcS2a ストック調製

  1. 10 mgのAlPcS2a を400 μLの0.1 M NaOHに溶解します。溶解性を向上させるには、溶液を50°Cで加熱し、渦巻きます。
  2. 溶液を4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と混合します。次に、溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、不溶性沈殿物を除去します。
  3. UV-Vis分光光度計で溶液の濃度を測定します。672 nmにおけるAlPcS2aの吸光係数は4 x 104 cm-1 M-1である。AlPcS2a溶液をPBSで希釈して、1 mM溶液を作ります。1 mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。

2. トランスフェクション

注:Gal3-GFPは、リソソーム破裂の生細胞イメージングの指標として適用されます。



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結果

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エンドソームおよびリソソームを含むIVのAlPcS2a誘発損傷を表す模式図が示されている(図1)。

市販のマーカーを使用して、AlPcS2a 染色条件を決定することができる。例えば、AlPcS2a 点状点および緑色蛍光色素22 共局在(図2)。

蛍光色素標識ガレクチン-3は、IV損傷をモニタリングするための指標として適用できます(図3)。さらに、Gal3 punctaの位置は、リソソーム修復およびリソファジー3,23を含む下流シグナル伝達経路をアッセイするために追跡することもできます。細胞質ゾルから損傷したIVへのGal3...

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ディスカッション

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AlPcS2aは原形質膜に結合し、次いでエンドサイトーシスによって内在化され、最終的にリソソームに蓄積する。AlPcS2aは、したがって、インキュベーション期間を調整することによって細胞内区画に局在化することができる。この方法論の限界は、ERやゴルジ装置など、IVの膜源が他にもたくさんあるため、エンドサイトーシスを介してAlPcS2aによって標識できるのはIVの亜集団のみであることです。さらに、初期または後期エンドソームへのAlPcS2aの選択的標識は困難ですが、蛍光マーカーを使用して、細胞内イメージング中に初期形成エンドソームと後期形成エンドソームを区別することができます。CALI誘発IV損傷は、種々の色素3、24を用いて誘発され得る。

損傷の強さは、光のパワーと照明時間によって制御できます。損傷の強度が高いと、細胞の収縮または壊死を引き起こす可能性があります。ここでは、IV損...

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開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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著者らは、研究支援を提供してくれた中央研究院炎症コア施設、IBMSに感謝したいと思います。コア施設は、中央研究院コア施設および革新的機器プロジェクト(AS-CFII-111-213)によって資金提供されています。著者らは、画像取得を支援してくれた中央研究院(AS)の生物医科学研究所(IBMS)の共通機器コア施設に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
Al(III) 塩化フタロシアニンジスルホン酸 (AlPcS2a)Frontier ScientificP40632
培養皿同上812128-200
培養培地DMEM 10% FBS と 100 U/mL ペニシリン G と 100 mg/mL ストレプトマイシン
DMEM を補充Gibco11965092
FBSサーモフィッシャーサイエンティフィックA4736301
Gal3-GFP プラスミドaddgene
リポフェクタミン 3000 キットサーモフィッシャーサイエンティフィックL3000008
LysoTracker グリーン DND-26サーモフィッシャーサイエンティフィックL7526緑色蛍光色素
マルチウォールプレートパーキネルマーPK-6005550
NaOHサーモフィッシャーサイエンティフィックQ15895
OptiMEMサーモフィッシャーサイエンティフィック31985070
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140163
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco21600-069137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
細胞株
HeLa細胞株ATCCCCL-2この方法は、付着したほとんどの細胞株に適用できます。条件は個別に決定する必要があります。
Equipments
0.22 µmフィルター メルクSLGV013SL
コリメートLEDライト (660nm)ThorlabsM660L3-C1およびDC2100近赤外線は、AlPcS2aの励起スペクトルに理想的なベースです。
共焦点顕微鏡Carl ZeissLSM 780長期イメージングにはインキュベーションシステムが必要です。
NanoDrop 2000/2000c 分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィック
赤色LEDライトTholabsM660L4-C1

参考文献

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3 HeLa AlPcS2a

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