腸由来の微生物代謝物は、動物の複雑な行動につながる多面的な影響を及ぼします。私たちは、ガイドカニューレを介した脳室内送達を介して脳内の腸由来微生物代謝物の影響を描写するための段階的な方法を提供することを目指しています。
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方法論記事
自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
腸内細菌叢とその代謝産物が宿主の生理学と行動に与える影響は、この10年間で広範囲に調査されてきました。多くの研究により、腸内細菌叢由来の代謝物が宿主の複雑な腸脳経路を介して脳を介した生理学的機能を調節することが明らかになっています。短鎖脂肪酸(SCFA)は、腸内細菌叢による食物繊維発酵中に生成される主要な細菌由来の代謝物です。腸から分泌されたSCFAは、末梢の複数の部位で作用し、SCFA受容体の膨大な分布により、免疫、内分泌、および神経応答に影響を与える可能性があります。したがって、SCFAの経口および腹腔内投与を通じてSCFAの中枢および末梢効果を区別することは困難です。この論文は、自由に動くマウスのガイドカニューレ を介して 脳内のSCFAの機能的役割を調べるビデオベースの方法を提示します。脳内のSCFAの量と種類は、注入量と速度を制御することによって調整できます。この方法は、脳内の腸由来代謝物の役割を理解する方法を科学者に提供することができます。
概要
ヒトの胃腸管には、宿主に影響を与える多様な微生物が宿主を宿している1,2,3。これらの腸内細菌は、宿主によって消費される食事成分の利用中に腸由来の代謝産物を分泌することができる4,5。興味深いことに、末梢で代謝されていない腸代謝産物は、循環を介して他の臓器に輸送することができます6。注目すべきことに、これらの分泌された代謝産物は、中枢神経系と腸の間の双方向通信として定義される腸脳軸のメディエーターとして機能することができます7。以前の研究では、腸由来の代謝物が動物の複雑な行動や感情を調節できることが示されています8,9,10,11。
短鎖脂肪酸(SCFA)は、食物繊維と難消化性炭水化物の発酵中に腸内細菌叢によっ....
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プロトコル
すべての実験プロトコルと動物の世話は、国立成功大学(NCKU)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 実験動物の準備
- ベンダーから6〜8週齢の野生型C57BL / 6JNarlオスマウスを入手します。
- 標準的なマウス飼料と滅菌水を 自由に入れた標準的なマウスケージにマウスを収容します。
注意: NCKUの実験動物センターの収容条件は、温度22±1°C、湿度55%±10%、および13時間/ 11時間の明暗サイクルです。
2.定位固定手術
- 定位固定装置、手術器具、および関連アイテムを準備および滅菌します。
注:手術部位に直接接触するすべてのアイテムは、感染を避けるために滅菌する必要があります。 - マウスを酸素中の1%〜5%イソフルランを含むプレキシグラスケージに入れて麻酔します。
注意: マウスを注意深く観察して、呼吸数が毎秒約1回の呼吸に維持されていることを確認します。 - マウスを麻酔室から取り出します。ペットトリマーで手術部位(マウスの頭)を剃ります。マウス切歯を定位固定装置用切歯ホルダーの切歯バーに固定することにより、マウスを定位固定装置フレームに置きます。ノーズコーンマスク....
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結果
ガイドカニューレ移植からの回復から1週間後にマウスにSCFAを注入し、新規ケージ内の自発運動を評価した。マウスを新しいケージに入れ、最初の5分間で2,100 nLのSCFAまたはACSFを注入しました(送達速度7 nL / s)脳の側脳室に埋め込まれた市販のガイドカニューレを介して脳に注入します。新規ケージ内の自発運動は、注入後さらに30分間記録されました。.SCFAsとACSFの注入では、新規ケージ内の自発運動活動に差は認められなかった(図6)(n = 2匹/群;データはs.e.m.±平均値として示し、双方向ANOVAで分析した)。
脳領域へのガイドカニューレの移植の精度を検証するために、蛍光ニューラルトレーサーをガイドカニューレ を介して SCFAと同じ体積と送達速度でマウスに注入しました(5分で2,100 nL; 7 nL / s)。脳は30分後に組織学のために集められました。蛍光色素は、マウス脳の側脳室および周辺領域で検出された(図7A).......
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ディスカッション
腸由来の代謝産物は、体内での複数の結合部位のために、あまり正確なメカニズムなしに脳介在性疾患と関連しています6,12,24。以前の報告では、SCFAがGタンパク質共役型受容体、エピジェネティック調節因子、および体内の複数の部位でのエネルギー生産の源のリガンドとして機能する可能性があることが示されました6,12。末梢由来の交絡因子(免疫細胞、ホルモン、自律神経系など)を回避するため、自由に動くマウスにガイドカニューレを介してSCFAを脳内に脳内注射する方法を開発しました。さらに、カニューレ挿入部位と注入部位を検証して、SCFAの影響を受ける可能性のある脳領域を探索しました。全体として、この論文は、腸脳軸研究のために腸由来の代謝物を脳に送達するための正確で綿密で検証された方法を提示します。
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開示事項
著者には、この作業に関連する利益相反はありません。
謝辞
国立成功大学(NCKU)の実験動物センターのスタッフに、動物の世話をしてくれたことに感謝します。この作業は、チェンシン医療財団のクンイェンファン教育基金からC.-W.L.への奨学金によってサポートされました。台湾の科学技術部(MOST)からの資金:(学部研究MOST 109-2813-C-006-095-B)からT.-H.Y.;(ほとんどの107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3)からW.-L.W.;高等教育スプラウトプロジェクト、教育省からNCKUの大学進学本部からW.-L.W.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Advil Liqui-Gels 可溶化イブプロフェン A2:D41 | ファイザー | n/a | |
| Alexa Fluor 488 ロバ 抗ウサギ | サーモフィッシャー サイエンティフィック | A-21206 | |
| 抗蛍光金 (ウサギ ポリクローナル) | ミリポア | AB153-I | |
| ボトル トップ真空フィルター、500 mL、0.22 μm、PES、滅菌 | ネスト | 121921LA01 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | ACSF: 0.14 g/L |
| クロルヘキシジン スクラブ 2% | Phoenix | NDC 57319-611-09 | |
| クロルヘキシジン溶液 | Phoenix | NDC 57319-599-09 | |
| 市販ダミー | RWD Life Science | 62004 | Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm |
| 市販ガイドカニューレ | RWD Life Science | 62104 | Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5んん |
| 市販のインジェクター | RWD Life Science | 62204 | Single_OD 0.21 mm-33G/ M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | ACSF: 0.61 g/L |
| 歯科用アクリル | HYGENIC | n/a | |
| 固定ネジ | RWD Life Science | 62521 | |
| Abcam | AB104139 | Fluoroshield 封入剤 | |
| 馬の血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 16050130 | |
| インスリン注射器 | BBraun | XG-LBB-9151133S-1BX | 1 mL |
| イソフルラン | パニオン&BFバイオテック | DG-4900-250D | |
| KCl | シグマ・アルドリッチ | P3911 | ACSF: 0.19 g/L |
| ケトプロフェン | スイスファーマシューティカル | n/a | |
| リドカイン | アストラゼネカ | n/a | |
| 低融点アガロース | Invitrogen | 16520 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | ACSF: 0.19 g/L |
| 顕微鏡カバー スリップ | MARIENFELD | 101242 | |
| 顕微鏡スライド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 4951PLUS-001E | |
| 鉱物油ライト、白色 NF | マクロン ファインケミカルズ | MA-6358-04 | |
| NaCl | シグマ・アルドリッチ | S9888 | ACSF: 7.46 g/L |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | ACSF: 0.18 g/L |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | ACSF: 1.76 g/L |
| n-ブチルシアノアクリレート接着剤 (組織接着接着剤) | 3M | 1469SB | 3M Vetbond |
| ニューラルトレーサー | サンタクルス | SC-358883 | フルオロゴールド |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| ポリエチレン チューブ | RWD ライフサイエンス | 62329 | OD 1.50、I.D 0.50 mm および OD 1.09、I.D 0.38 mm |
| Puralube 獣医 (目) 軟膏 | Dechra | ||
| 酢酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S2889 | SCFA: 13.5 mM |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 酪酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | B5887 | SCFA: 8 mM |
| プロピオン酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | P1880 | SCFA: 5.18 mM |
| ステンレスガイドカニューレ | Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. | なし | 外径 0.63 mm;地元のベンダー |
| ステンレスインジェ | クターChun Taステンレス鋼企業CO.、LTD。 | n/a | OD 0.3 mm; ダミーはインジェクターから作られています; 地元のベンダー |
| Superglue | Krazy Glue | KG94548R | |
| Triton X-100 | Merck | 1.08603.1000 | |
| Equipment | |||
| Cannula holder | RWD Life Science | B485-68217 | |
| シーリング カメラ | FOSCAM | R2 | |
| デジタル定位固定装置 | Stoelting | 51730D | |
| 解剖顕微鏡 | INNOVIEW | SEM-HT/TW | |
| ガラスビーズ滅菌器 | RWD ライフサイエンス | RS1501 | |
| 加熱パッド | Stoelting | 53800M | |
| ライカ顕微鏡 | ライカ | DM2500 | |
| マイクロ解剖鉗子 | ROBOZ | RS-5136 | 鋸歯状、わずかなカーブ。非常に繊細です。0.5mmの先端幅;4インチの長さ |
| マイクロ解剖はさみ | ROBOZ | RS-5918 | 4.5インチ角度シャープ |
| マイクロインジェクションコントローラー | ワールドプレシジョンインスツルメンツ(WPI) | MICRO2T | スマートコントローラー |
| インジェクションシリンジポンプ | ワールドプレシジョンズ(WPI) | UMP3T-1 | UltraMicroPump3 |
| マイクロリットルシリンジ | Hamilton | 80014 | 10 µL |
| 光ファイバー コールド ライト ダブル ファイバー | ステップ | LGY-150 | ローカル ベンダー |
| ペット トリマー | WAHL | 09962-2018 | |
| イソフルラン | ステップ | AS-01 | ローカル ベンダー |
| ビブラート | ライカ | VT1000S | |
| ソフトウェア | |||
| 動物の行動ビデオ追跡ソフトウェア | Noldus | EthoVision | バージョン:15.0.1416 |
| カアプリケーションスイートXソフトウェア | ライカ | LASX | バージョン:3.7.2.22383 |
参考文献
- Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).....
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