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方法論記事

ネッタイシマカ蚊の幼虫とCarpesium abrotanoides Lの防除

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DOI:

10.3791/63976

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2022年8月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qiannan Medical College for Nationalities, 2Key Laboratory of Human Parasitic Diseases in Qiannan Prefecture, 3Guizhou Medical University

この記事について

サマリー

Carpesium abrotanoides L.植物を蚊の幼虫の防除に使用すると、ネッタイシマカの蚊の個体数を効果的に減らすことができ、植物由来の殺虫剤を設計するための基盤を提供できます。

要約

デング熱、黄熱病、その他の蚊が媒介する病気の重要な媒介者として、 ネッタイシマカ (双翅目: Culicidae)は世界中に広く分布し、公衆衛生に深刻な脅威を引き起こす可能性があります。今日まで、蚊の殺虫剤耐性が急速に出現していることを考えると、 Ae. albopictus を制御および減少させるための新しい植物性殺虫剤の開発が緊急かつ重要です。そこで、蚊の幼虫の死滅に対するC . abrotanoides L.植物の煎じ薬効果を調べるために、一連の時点(12時間、24時間、36時間、48時間)における異なる濃度(60 mg/mL、120 mg/mL、180 mg/mL)の煎じ薬で処理した後の幼虫の死亡率を検出しました。180 mg / mLの C.abrotanoides L.煎じ薬処理を24時間行った場合、対照処理と比較して蚊の92.35%が死滅したことがわかりました。一方、120 mg / mLで36時間も蚊の90%以上を殺すことができます。さらに、 Carassius auratus 集団は120 mg / mL C.abrotanoides L.煎じ薬に36時間曝露され、死亡しませんでした。死亡率評価は、この濃度が有害なレベルの生態環境汚染ではないことを示した。本研究は、植物由来殺虫剤の設計に利用できる可能性のある植物候補を提供します。さらに、これらの方法は変更して他の蚊種に適用することができます。

概要

「アジアの虎蚊」としても知られるネッタイシマカは、人間や動物の血液を吸うことで、デング熱、チクングニア熱、ジカウイルス病などのさまざまな病気を広めることができます1。近年、Ae. albopictusが広く分布していることから、デング熱をはじめとする蚊媒介性疾患の流行状況は深刻化しており、世界中の人々の生命と健康に深刻な脅威をもたらしています2。現在、ほとんどの蚊が媒介する病気には、有効なワクチンや特定の治療薬はありません。化学殺虫剤で蚊を殺すことは、依然として蚊が媒介する病気を制御する主要な手段です3。化学殺虫剤を用いた化学防除法は、蚊を迅速かつ効率的に殺すことができ、蚊媒介生物防除の主要な手段となっている4。しかし、殺虫剤の長期的かつ大規模な使用により、Ae. albopictusの殺虫剤に対する感受性や殺虫剤耐性が低下し、これが蚊媒介性疾患の抑制における最大の障害となっています。したがって、高効率、安全性、および環境保護を備えた新しいタイプの蚊殺虫剤を開発することは、実用上非常に重要です。

自然界では、植物が主要な生産者です。昆虫や多くの動物が植物を食べます。植物は、さまざまな「自然災害や人為的災害」に見舞われると、生存のために二次代謝産物を作り出します。これらの物質は、多くの場合、他の生物の摂食、病気、および昆虫抵抗性に抵抗する能力を持っています。それらはさまざまな害虫に影響を与えるだけでなく、環境毒性のリスクも低い5。 Carpesium abrotanoides L.は、キク科のCarpesium abrotanoides属の多年生草本で、「ヒキガエルブルー」、「鹿の生きた草」、「野生のタバコ」などとしても知られています。中国と東アジアに広く分布しています。その茎と葉は、これらの地域で擦り傷や発熱を治療するための殺虫剤として使用できます6。その果実は、中国では地元では「Bei-He-Shi」として知られており、民間療法でサナダムシや回虫の治療に使用されています7,8。この植物はモノテルペン、セスキテルペン、フェノール、およびその他の特徴的な成分が豊富であり、抗炎症作用、抗真菌作用、抗寄生虫作用、抗腫瘍作用、および抗ウイルス作用などの効果的な薬理学的効果を有することが報告されています7。近年の研究では、Spodoptera exigua9に対する抗摂食効果、Sitophilus zeamais10への接触毒性、Taenia asiatica8のCysticercus cellulosaeに対する殺傷能力、抗摂食活性、およびアーミーワームおよびPlutella xylostella11に対する接触毒性があることがわかっています。Aedes albopictusの幼虫を制御するために使用できる一部の寄生虫、農業害虫、および衛生害虫に対するC.abrotanoides L.の毒性影響の研究において予備的な進歩が見られました。

この研究では、 Ae. albopictus の幼虫を C. abrotanoides L. で防除するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、 C. abrotanoides L. 煎じ薬を使用して Ae. albopictus の 4 齢幼虫に作用し、 C. abrotanoides L. 煎じ薬で一連の時点 (12 時間、24 時間、36 時間) で異なる濃度 (60 mg/mL、120 mg/mL、および 180 mg/mL) で処理した後、幼虫の死亡を検出しました。 および48時間)。 C. abrotanoides L. decoction が Ae. albopictus の幼虫に及ぼす殺傷効果を決定することで、高効率、低毒性、および環境に優しい植物性殺虫剤の使用による蚊のさらなる駆除に関する新たなアイデアが得られます。

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プロトコル

雌の蚊の餌として使用されるヤギの血液は、中国貴州省杜雲市の地元の食肉処理場から採取され、中国貴州省杜雲市銭南県にあるヒト寄生虫症の主要研究所の倫理ガイドラインと規制に従って使用されました。

1. 試薬の調製

注意: このプロトコルで使用される機器、試薬、およびその他の消耗品のリストについては、 材料の表 を参照してください。

  1. C. abrotanoides L. の抽出と同定
    1. C. abrotanoides L.の草全体を集めます。本研究におけるC. abrotanoides L.の全草は、2021年4月に貴州省三都水自治県(N:25.95、E:107.87)から採集されたものです。
      注: C. abrotanoides L.の資源分布、薬効成分、組織構造、および物理的および化学的同定特性によると、 C. abrotanoides L. 植物全体の高さは30〜100 cmで、直立した茎、上部に多くの枝、茎の下部に交互の葉、わずかに葉柄、楕円形の葉、長さ10〜15 cm、幅5〜8 cm、完全または不規則な鋸歯状、茎の上部の葉はほぼ固着し、長い楕円形です。 上に向かって徐々に小さくなり、頭は腋窩で、ほぼ固着しており、垂れ下がった花、特殊なガス、軽い味、刺激的です。この植物は、私たちの所属で伝統的な中国医学を専門とする教師によって C.abrotanoides L. と特定されました。
  2. C.アブロタノイデスL。 洗浄、乾燥、破砕
    1. 採取した C.abrotanoides L. から枯れ葉や土などの不純物を取り除き、清掃します。換気された条件下で10〜15日間風乾するか、95°Cの乾燥オーブンで6時間乾燥させます。
      注: C. abrotanoides L.の乾燥過程では、均一に乾燥できるように裏返す必要があります。 C. abrotanoides L. 組織が破砕プロセス中に容易に破砕されない場合は、再度乾燥させてから破砕することができます。
  3. C.abrotanoides L.エッセンス煎じ薬の調製
    1. C. abrotanoides L. refined powderを360 gの重量に量り、蒸留水1000 mLを加え、低速火(電力800 W)で2時間煎じます。
    2. 通常の濾紙で煎じ薬をろ過し、次にロータリーエバポレーターで濃縮して抽出物を作ります。抽出物を蒸留水で1000mLに希釈し、 C.abrotanoides Lを調製します。元の薬用材料を360 mg / mL含む精製水煎じ薬。.
    3. C. abrotanoides L. 精製水煎じ薬50 mL、100 mL、150 mLを希釈して、120 mg/mL、240 mg/mL、360 mg/mLのオリジナル薬用材料を各150 mLずつ含んだ水煎じ薬を調製します。
      注:沸騰プロセス中は、熱を十分に制御する必要があります。沸騰後、熱を弱め、液体を100°Cに保ち、わずかに沸騰させました。

2.蚊のサンプル調製

  1. 蚊の発生源
    1. Ae. albopictusの幼虫のコレクション。本研究では、2020年8月に貴州省杜雲市(N:26.25、E:107.52)の住宅地でAe. albopictusの幼虫を採集しました。
    2. Ae. albopictusの分布、幼虫および成虫の形態学的特徴によると、ネッタイシマカの同定は次の通りでした:ネッタイシマカの幼虫のCtenophoraの基部は細かいドローを持っています。不完全なテールサドル。呼吸管は黒く、短く、太いです。ネッタイシマカの成虫は小型から中型の蚊です。メスの蚊は中型で黒です。中胸部胚盤には白い縦縞があり、通常は後部で徐々に先細りになり、小さな胚盤の前部で分岐します。足の関節にはベースに白いリングがあり、関節5のすべてまたはほとんどが白です。蚊は、私たちの所属機関の寄生虫学と蚊専門の教師によってAe.albopictusと特定されました。
    3. 従来の給餌温度を25±1°C、相対湿度70%±10%に維持し、光源として80Wの蛍光灯を使用します(明暗=14時間:10時間)。
    4. 幼虫に鶏レバーパウダーを与え、成虫の蚊に10%の砂糖水を与えます。
  2. 蚊の卵コレクション
    1. Ae. albopictusの幼虫が蛹に成長したら、使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを使用して蛹を吸い出し、成虫の蚊かごに移します。
    2. 成虫の蚊が出現してから3〜5日後、雌と雄の蚊は交尾します。このとき、雌の蚊に4〜8時間血液を与えます。
      注:抗凝固剤を添加した血液を培養皿に入れ、37°Cの温水で加熱し、雌の蚊が血を吸うためのガーゼ布の層で覆いました。
    3. 採卵カップ(自家製:蒸留水250mLを入れた300mLのストレート面不透明プラスチックカップに、カップの内側の縁の半分に濾紙を浸した)で ネッタイシマカ の卵を採取します。
      注: Ae. albopictus の卵は3〜6か月間保存できます。
  3. 蚊の孵化と摂食
    1. 実験中、 Ae. albopictus は通常1週間前に孵化しました。 ネッタイシマカ の卵をエナメル皿に置き、水道水1000mLを加えて24時間以上放置します。卵は1〜2日で幼虫に孵化します。
    2. 幼虫は1〜2日に1回脱皮しました、つまり、1インスター増加しました。3番目の幼虫の終わりまたは4番目の幼虫の開始時に、実験室で化学殺虫剤に接触せずに2〜3世代繁殖した後、1000匹の幼虫を選択します。
      注意: 幼虫の密度が高すぎる場合は、幼虫が正常に成長できるように、幼虫をプレートに分割します。

3. 浸漬法による C. abrotanoides L. decocionの Ae. albopictus 幼虫に対する毒性影響の検出

  1. グループ化を設定する
    1. 実験グループを設定します: C. abrotanoides L. 煎じ薬 (50 mL) を 3 つの薬物濃度 (120 mg/mL、240 mg/mL、360 mg/mL) で調製します。
    2. ブランクコントロールグループ:薬物と同じ量の脱塩素水(自家製:水道水を24時間以上放置)を使用します。
    3. ポジティブコントロールグループ:一般的な化学殺虫剤であるデルタメトリンを最終濃度0.05 mg / mLで調製します。.
  2. 薬液の添加
    1. 容量が200 mLを超える使い捨てプラスチックカップをいくつか使用し、3番目の幼虫の終わりまたは4番目の幼虫の始まりに50 mLの脱塩素水を加えます。.
    2. 実験群では、各濃度の C.abrotanoides L. 精製水煎じ薬50mLを加え、穏やかに振って均等に混合し、総容量100mLにします。 C. abrotanoides L. 精製水煎じ薬の最終濃度は、60 mg/mL、120 mg/mL、および 180 mg/mL です。
    3. ブランクコントロールグループでは、50 mLの脱塩素水を総容量100 mLに追加し、ブランクコントロールとしてマークします。.
    4. ポジティブコントロール群では、0.1 mg / mLの濃度のデルタメトリン溶液50 mLを加え、穏やかに振って、総容量100 mLを最終濃度0.05 mg / mLまで均一に混合し、ポジティブコントロールとしてマークします。.
  3. 観測
    1. マークされたプラスチックカップを同じ給餌環境の観察室にそっと移し、各実験群と対照群の Ae.albopictus 幼虫の死亡をそれぞれ12時間、24時間、36時間、および48時間で記録します。顕微鏡で死んだ個体を観察し、通常の Ae.albopictus の幼虫と比較します。
    2. 上記の観察時点において、幼虫が鋭利な細い針で攪拌され、逃げられなかったり、反応がなかったりした場合は、死んだと考えてください。テストを 3 回繰り返します。
      注:対照群の幼虫の死亡率が20%を超えた場合、テスト結果は無効であり、繰り返す必要がありました。全体的なアプローチを 図 2 にまとめます。

4. 屋外シミュレーション実験

  1. C. abrotanoides L. decoction の 3 つの濃度を屋外条件下で Ae. albopictus の幼虫に適用し、幼虫の死を観察します。毒性効果と実験室での毒性効果との間に違いがあるかどうかを比較します。
  2. C. abrotanoides L. refined water decotionの3つの濃度を屋外条件下で野生のフナに適用して、フナの成長に影響を与えたかどうかを観察します。これは、C. abrotanoides L.精製水煎じ薬は、生態環境に損害を与えます。
    注:濃度は、ステップ3.2.2で説明した濃度と同様でした。使用されるタイム ポイントは、それぞれ 12 時間、24 時間、36 時間、48 時間です。フィールドシミュレーション実験の効果は、実験室の給餌条件と屋外の自然条件下でC.abrotanoides L.煎じ薬で処理されたAe.albopictusの死亡率を比較することにより判断されました。

5. 統計分析

  1. 定量的データを Mean ± SD で表し、カウント データをパーセンテージ (%) で表します。
    注:ここで使用した統計的推論方法はp<0.05であり、その差は統計的に有意でした。
  2. データの統計解析に適切なソフトウェアを使用し、 C. abrotanoides L. decoction to Ae. albopictus larvae の 3 つの異なる濃度の毒性を使用して、どの濃度の煎じ薬が Ae. albopictus 幼虫に対して最も毒性が高いかを事前に決定しました。

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結果

ここでは、本研究でC. abrotanoides L.の草を野生から全草採取しました(図1)。C. abrotanoides L.の同定後、C. abrotanoides L.の煎じ薬を煎じ薬法(図2)で取得し、異なる濃度(60 mg/mL、120 mg/mL、および180 mg/mL)で調製しました。これは、幼虫浸漬法によりAe.albopictusの幼虫に適用されました。120 mg/mL C. abrotanoides L. 煎じ薬治療を 24 時間行うと、死んだ幼虫が黒くなる可能性があり、形態学的評価を通じて硬さが観察されました (図 3)。次に、一連の時点(12時間、24時間、36時間、および48時間)内の異なる濃度(60 mg / mL、120 mg / mL、および180 mg / mL...

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ディスカッション

現在、Ae. albopictusは世界で最も侵略的な100種の1つになっています。世界保健機関(WHO)の統計によると、2020年には、アジアでAe. albopictusの影響を最も受ける地域が、世界の疾病負担の約70%を占めるとされています12。デング熱、黄熱病、その他の蚊が媒介する病気の重要な媒介者として、Ae. albopictusは世界中に広く分布し、公衆衛生に深刻な脅威を引き起こす可能性があります。ここでは、Ae. albopictusを防除および削減するための新しい植物性殺虫剤の開発により、より安全で環境に優しい選択肢を提供できます。そこで、C. abrotanoides L.の中毒効果を調べるための植物性殺虫剤を生成する新しい方法が開発されました。 Ae. albopictusの幼虫に、植物由来の殺虫剤の設計に使用できる可能性のある植物候補を提供します。

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

ミネソタ大学のXin-Ru Wang博士には、洞察に満ちた提案と指導をいただき、感謝いたします。この研究は、銭南医科大学(Qiannan Medical College for Nationalities)(Qnyz202112、QNYZ202205)の科学研究基金、および貴州省衛生委員会の科学技術基金(qwjh [2022] No. 101、project gzwkj2023-251)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトン(分析純度)上海神波化学有限公司
フナ州雲豊水産養殖有限公司
レバーパウダー自己製造
塩素水自己製造水道水24時間以上立っている水道水
メトリン技術南京Leshengバイオテクノロジー株式会社。、株式会社純度:94.62%
使い捨てプラスチックカップ貴州省福強技術包装有限公司220ML-A1
卵収集カップ自作
電気ブラスト乾燥オーブン杭州アイプ楽器機器有限公司WGLL-230BE
電気水蒸留器北京Xinrun河野楽器有限公司TT-98-II
GraphPad プリズムGraphPad ソフトウェアデータ処理およびグラフィックスソフトウェア
統合デジタル顕微鏡重慶青沖光学機器有限公司SMARTe-500
蚊の餌やりケージ南京 Lesheng Biotechnology Co., Ltdカスタムメイド
多機能電磁調理器広東省美的生活器具製造有限公司C21-WK2102カスタムメイド
定性濾紙杭州阜陽Beimuパルプ紙15cm-102
ロータリーエバポレーター河南省Jingbang楽器機器有限公司R-1010
小型破砕機金華Mofei家庭用電化製品有限公司CHY-6001
SPSSバージョン25.0IBM統計ソフトウェア
標準サンプルふるい河北Hengshui Anping lvruo金網製品有限公司100-30カスタムメイド
砂糖水、10%自己製造
広鶏脱デルタ有限公司

参考文献

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