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方法論記事

骨組織工学における潜在的な使用のためのグラフェン - ハイドロキシアパタイトナノコンポジットの合成

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DOI：

10.3791/63985

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2022年7月27日

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1Department of Physics, Faculty of Science, Kasetsart University, 2Department of Microbiology, School of Science, RK. University, 3Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 4Defence Institute of Advanced Technology Campus, Navyukti Innovations Pvt. Ltd., 5Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 6Department of Chemistry, Saveetha School of Engineering, Institute of Medical and Technical Science, Saveetha University, 7UFPI - Universidade Federal do Piauí

この記事について

サマリー

グラフェンナノリボンおよびハイドロキシアパタイトナノ粒子の新規ナノコンポジットを、溶液相合成を用いて調製した。これらのハイブリッドは、生理活性足場材に採用された場合、組織工学および骨再生における潜在的な用途を示すことができる。

要約

骨組織工学のための新規材料の開発は、ナノメディシンの最も重要な推力分野の1つです。いくつかのナノコンポジットが、細胞の接着、増殖、および骨形成を促進するためにハイドロキシアパタイトを用いて製造されている。この研究では、グラフェンナノリボン(GNR)とハイドロキシアパタイトのナノ粒子(nHAPs)を使用してハイブリッドナノコンポジットの開発に成功し、生理活性足場材に採用すると骨組織の再生を改善する可能性があります。これらのナノ構造体は、生体適合性であり得る。ここでは、新規材料の調製に2つのアプローチを用いた。1つのアプローチでは、nHAPが合成され、同時にGNRにコンジュゲートされ、GNR表面上にnHAPのナノハイブリッド(nHAP/GNRと表記される)をもたらす共官能化戦略が使用された。高分解能透過型電子顕微鏡(HRTEM)により、nHAP/GNR複合体は、GNR(最大長1.8μm)の細くて薄い構造と、針状のnHAP(長さ40~50nm)の離散パッチ(150~250nm)で構成されていることが確認されました。他のアプローチでは、市販のnHAPをGNRと共役させてGNR被覆nHAP(GNR/nHAPと表記される)を形成した(すなわち、nHAP/GNRナノハイブリッドに対して反対の向きを有する)。後者の方法を用いて形成されたナノハイブリッドは、表面にGNRのネットワークで覆われた直径50nm〜70nmの範囲のnHAPナノスフィアを示した。エネルギー分散スペクトル、元素マッピング、およびフーリエ変換赤外(FTIR)スペクトルは、両方のナノハイブリッドにおけるnHAPおよびGNRの良好な統合を確認した。熱重量分析(TGA)は、GNRの存在による高温での損失は、GNR/nHAPおよびnHAP/GNRについてそれぞれ0.5%および0.98%であることを示した。反対の向きのnHAP-GNRナノハイブリッドは、骨組織工学アプリケーションを改善するための細胞機能を潜在的に促進するために、生理活性足場に使用するための重要な材料を表す。

概要

グラフェンは、spハイブリダイズした炭素からなるシート状の二次元構造を有する。いくつかの他の同素体は、グラフェンの拡張されたハニカムネットワークに起因し得る(例えば、グラフェンシートの積層は、同じ材料を転がり落ちながら3Dグラファイトを形成し、1Dナノチューブの形成をもたらす)。同様に、0Dフラーレンはラッピング2のために形成される。グラフェンは、室温での両極性電界効果および量子ホール効果を含む魅力的な物理化学的および光電子的特性を有する3,4。単一分子吸着事象の検出および非常に高いキャリア移動度は、グラフェン5,6の魅力的な属性に加わる。また、幅が狭く平均自由行程が大きく、低抵抗率で電流密度が高く、電子移動度が高いグラフェンナノリボン(GNR)は、有望な相互接続材料7と考えられている。したがって、GNRは無数のデバイス、最近ではナノメディシン、特に組織工学と薬物送達における応用のために探求されています8。

様々な外傷性疾患の中で、骨損傷は、骨折、再生および新しい骨との置換を安定させ、感染に抵抗し、骨非結合体を再整列させることの困難さのために、最も困難なものの1つと考えられている9,10。外科的処置は、大腿骨軸骨折の唯一の代替手段のままである。中央アメリカとヨーロッパでは、毎年約5200万ドルが骨損傷の治療に費やされていることに注意する必要があります11。

骨組織工学用途のための生理活性足場は、骨自体のマイクロおよびナノ建築特性に似ているので、ナノハイドロキシアパタイト(nHAP)を組み込むことによってより効果的であり得る12。化学的にCa10(PO4)6(OH)2として表され、Ca/Pモル比が1.67であるHAPは、生物医学的用途、特に歯周欠損の治療、硬組織の置換、および整形外科手術のためのインプラントの製造に最も好ましい13,14。したがって、GNRで強化されたnHAPベースの生体材料の製造は、優れた生体適合性を有することができ、オッセオインテグレーションを促進し、骨伝導性であるそれらの能力のために有利であり得る15,16。このようなハイブリッド複合足場は、細胞接着、拡散、増殖、および分化などの生物学的特性を維持することができる17。ここでは、図1に示すようにnHAPおよびGNRの空間配置を合理的に改変することによって、骨組織工学のための2つの新しいナノコンポジットの作製を報告する。2つの異なるnHAP-GNRs配列の化学的および構造的特性をここで評価した。

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プロトコル

1. 沈殿によるnHAPの合成

  1. 1 M Ca(NO3)2∙4H2Oおよび0.67 M(NH4)H2PO4を含む反応混合物50 mLを用いて手付かずのnHAPを合成し、続いてNH4OH(25%)を滴下してpHを1018付近に維持する。
  2. その後、超音波照射(UI)により反応混合物を30分間攪拌する(500W電力および20kHz超音波周波数)。
  3. 得られた溶液を、nHAPの白色沈殿物が落ち着くまで室温で120時間成熟させる。室温で5分間、1398 x g で遠心分離することによりnHAPを回収する。
  4. 沈殿物を脱イオン(DI)水3xで洗浄し、48時間凍結乾燥する。乾燥粉末を4°Cで保存する。

2. nHAP/GNRナノコンポジットの作製

注: 以下では、nHAP と GNR の 2 つの異なる空間配置を表す nHAP/GNR (つまり、GNR サーフェス上の nHAP) および GNR/nHAP (GNR コーティングされた nHAP) ナノコンポジットを製造するための 2 つのアプローチについて説明します (図 1)。

  1. nHAP/GNRの合成
    1. nHAP/GNRsナノコンポジットを調製するには、以下のように、nHAPを合成してGNRに同時に共役させることができる共官能化戦略を使用する。
    2. 1 M 硝酸カルシウム 4 水和物 [Ca(NO3)2·4H 2 O] および 0.67 M リン酸水素二アンモニウム [(NH 4)2 HPO4] の混合物に 5 mg の GNR (材料表) を 50 mL の最終容量19 に溶解する。
    3. この反応の間、25%のNH4OHを滴下して、pHを〜10に維持する。得られた混合物をUIで30分間攪拌する。
    4. 反応終了後、成熟するまで溶液を室温で120時間邪魔されずに放置する。
    5. GNRを被覆するnHAPのゼラチン状沈殿物の形成を観察し、続いてnHAP/GNRの白色沈殿物が沈降する。
    6. 沈殿物3xを室温で1398 x g で5分間遠心分離して洗浄し、続いてDI水に再分散させた。
    7. 回収した洗浄沈殿物を48時間凍結乾燥する。乾燥粉末を4°Cで保存する。
    8. 対照サンプルとして手付かずのnHAPおよびGNRを使用する。
  2. GNR/nHAPナノコンポジットの合成
    1. 市販のnHAPを5mg/mLの濃度で5mgのGNRで補充した50mLのDI水に懸濁する。
    2. 得られた混合物をUIによって30分間攪拌し、その後、混合物を室温で120時間邪魔されずに放置する。
    3. 成熟後、得られたGNR/nHAPの白色沈殿を、室温で1398 x g で5分間遠心分離することによって回収する。
    4. DI水を使用してサンプル3xを洗浄し、48時間凍結乾燥し、さらに使用するために乾燥粉末を4°Cで保存する。

3. nHAP、nHAP/GNR、および GNR/nHAP の特性評価

  1. 高分解能透過型電子顕微鏡(HRTEM)( 材料表を参照)を使用して、ナノコンポジット11の形態およびサイズを特徴付ける。
  2. エネルギー分散分光法(EDS)を用いてナノコンポジットの元素組成を解析し、走査型透過電子顕微鏡(STEM)を用いて元素マッピングを行う11。
  3. 500-4000cm-1の波数のきれいなサンプルに対してフーリエ変換赤外(FTIR)分光法を実行して、ナノコンポジット16中の化学基を分析する。
  4. 合成されたnHAPの粉末X線回折(XRD)分析は、1.5406ÅのX線波長、それぞれ40mAおよび40kVの電流および電圧設定、および20°~90°の範囲の2θを用いて行う。
  5. 窒素流下でサンプルを室温から1000°Cまで窒素流下で10°C/分の速度で加熱することにより、熱重量分析(TGA)を使用してナノコンポジット中のGNRの負荷率を評価します。

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結果

HRTEM分析
GNRは、 図2で観察されたように、それぞれ細長い竹のような構造で、ある程度の距離で曲がっていました。最長GNRは1.841μmで、最小の曲がったGNRは497nmであった。ナノリボンは、しばしば、多くの場所でらせん状の配置を形成するためにねじれたことに起因し得る幅の目に見える変化を示した。GNRのこのような一方向アライメントは、磁気特性、導電率、または熱輸送などの魅力的な特徴を得るのに役立ち得る7。

室温で硝酸カルシウム四水和物およびリン酸水素二アンモニウムを用いて合成されたnHAPs(ステップ1)は、40nm〜50nmの範囲のサイズを有する棒状または針状であった(図3)。合成されたナノ材料は、凝集および結晶成長のために凝集塊中に見出された。一方、使用した市販のnHAPsは球状であった(図4)。これら...

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ディスカッション

様々な金属、ポリマー、セラミック、およびそれらの組み合わせが整形外科インプラントおよび固定アクセサリーとして研究されてきたが、HAPは骨自体との化学的類似性および結果として高い細胞適合性のために最も好ましい材料の1つであると考えられている20,21,22。この研究では、HAPの向きが変化し、骨形成の促進、骨形成、骨伝導性などのHAPのユニークな特性に大きな影響を与える可能性があります。さらに、HAPの配向を変えることは、体内の長骨がコラーゲンとのHAの異方性配向を有するのに対し、直方体骨はコラーゲンとのHAのランダムな配置を有するので、ナノコンポジットの機械的特性にさらに影響を与え、天然骨のそれをさらに模倣することができる。天然HAPはヒトの歯および骨の主要構成成分であるが、その物理的性質は、CaP相23の反応時間、pH、リン酸濃度、および化学的性質などの反応条件に大きく依存することに留意すべきである。し...

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開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

Sougata Ghosh博士は、インド政府科学技術省(DST)、インド政府科学技術省、およびインドのジャワハルラール・ネルー先端科学研究センターが、ナノ科学技術のポスドク海外フェローシップ(Ref. JNC/AO/A.0610.1(4) 2019-2260 2019年8月19日付)の下で資金提供を受けたことを認めます。Sougata Ghosh博士は、タイのバンコクにあるカセサート大学のポスドクフェローシップと、Reinventing University Program(参考文献番号6501.0207/10870、2021年11月9日付)の下での資金提供を認めています。著者らは、特性評価実験の支援をしてくれたKostas Advanced Nano-Characterization Facility(KANCF)に感謝したい。KANCFは、ノースイースタン大学のコスタス研究所(KRI)内の共有の学際的な研究および教育施設です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸アンモニウム 一塩基性Sigma-Aldrich216003-100G合成
硝酸カルシウム四水和物Sigma-Aldrich237124合成
遠心分離機HettichEBA 200SRecovery
フーリエ変換 赤外分光計BruckerVertex 70特性
グラフェン ナノリボンSigma-Aldrich922714合成
高分解能透過型電子顕微鏡サーモフィッシャーサイエンティフィックテミス Titan 300キャラクタリゼー
マグネチックスターラーIKAC-MAG HS7 S68機能化
マイクロピペットTreffLab06H35687試薬調製
pHメーターユーテック pH5+ECPH503PLUSK試薬調製
熱重量分析装置TAインスツルメンツSDT Q600特性評価
超音波浴バンデリンDT100機能化
ユニバーサルオーブンメモリUF55機能化
計量天秤PrecisaXB220A試薬調製
X線回折計ブルッカーD8-高度な特性評価
評価 ション

参考文献

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