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方法論記事

CUBICによる全腎三次元染色

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DOI:

10.3791/63986

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2022年7月18日

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

この記事について

サマリー

本プロトコルは、3次元(3D)腎臓イメージングのための組織透明化法およびホールマウント免疫蛍光染色を記載する。この技術は、腎臓病理学における巨視的な視点を提供し、新しい生物学的発見につながる可能性があります。

要約

従来の病理では腎臓の微細構造に関する情報が数多くありましたが、腎臓の血管、近位尿細管、集合管、糸球体、交感神経の正確な構造を知ることは、3次元(3D)情報が不足しているため困難でした。光学クリアリングは、この大きなハードルを克服するための優れた戦略です。組織クリアリングと3Dイメージング技術を組み合わせることで、臓器全体の複数の細胞を単一細胞分解能で解析できます。しかし、全臓器イメージングのための細胞標識法は未開発のままです。特に、ホールマウント臓器染色は抗体の浸透が難しいため困難です。本プロトコルは、CUBIC(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)組織クリアリング法による3Dイメージング用のホールマウントマウス腎臓染色を開発しました。糖尿病性腎疾患の早期における虚血再灌流障害後の腎交感神経除神経や糸球体腫大を総合的に可視化することが可能となりました。したがって、この技術は、巨視的な視点を提供することにより、腎臓研究における新しい発見につながる可能性があります。

概要

腎臓はさまざまな細胞集団で構成されています。従来の病理では腎臓の微小環境に関する多くの情報が得られますが、腎臓病進行時の細胞間クロストークを正確に理解するためには、3次元(3D)イメージングが必要です。従来、臓器全体の3Dイメージングには膨大な数の連続切片作成と画像再構成が必要でした1。しかし、この方法は手間がかかりすぎて再現性に問題がありました。

光学クリアリングは、このハードル2,3を克服するための優れた戦略です。組織の不透明度は、各臓器が水、タンパク質、脂質などのさまざまな物質で構成されているため、主に光の散乱と吸収によるものです。したがって、組織透明化の基本的な戦略は、組織内の水と脂質を、タンパク質4と同じ光学特性を持つ屈折率(RI)マッチング試薬に置き換えることです。透明な標本を観察するためには、ライトシート蛍光顕微鏡が有用である5。ライトシートは透明な試料を側面から照らし、励起信号は垂直位置6にある対物レンズを通して取得される。この顕微鏡は、共焦点または多光子蛍光顕微鏡とは異なる、単一のスイープで断面情報を取得します。したがって、低レベルの光退色でzスタック画像をすばやく取得できます。

透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析(CUBIC)は、ライトシート蛍光顕微鏡による全臓器イメージングを可能にする組織クリアリング方法の1つです2,7,8。CUBICおよびホールマウント免疫蛍光染色は、マウス腎臓の3D構造を視覚化するために本研究で最適化されています9、10、11。このホールマウント染色法を用いて、糖尿病性腎疾患11の早期虚血再灌流障害9,10および糸球体腫大後の腎交感神経の変化、ならびに腎臓全体の血管、近位尿細管、および集合管の変化を可視化します9。

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プロトコル

すべての実験は東京大学治験審査委員会の承認を受けました。すべての動物の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。8週齢の雄C57BL/6NJclマウスを本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1.動物の準備と腎臓の固定

  1. 以下の手順に従って灌流固定を行います。
    1. イソフルラン(3%、2.0 L / min)の吸入と塩酸メデトミジン(0.3 mg / kg)、酒石酸ブトルファノール(5 mg / kg)、およびミダゾラム(4 mg / kg)の腹腔内投与によってマウスを麻酔します( 材料の表を参照)。.
    2. 心臓12の左心室を通して、20mLのPBS(pH7.4)およびリン酸緩衝液(PB)中の30mLの4%PFAで動物に灌流する。
  2. 灌流固定と腎臓サンプリングの直後に浸漬固定を行う9.
    1. 腎臓を4%PFAに4°Cでさらに16時間浸した後、PBSで2時間(3回)洗浄します9 (図1)。
      注意: ホルムアルデヒドとパラホルムアルデヒドは有毒な刺激物です。適切な個人用保護具を備えたヒュームフード内の試薬を取り扱ってください。

2.脱色と脱脂

  1. 以前に発表された報告4,8,9に従って、10重量%のTriton X-100と10重量%のN-ブチルジエタノールアミンからなる脱色および脱脂質化用のCUBIC-Lを調製します(材料の表を参照)。
  2. CUBIC-Lによる脱色・脱脂は以下の手順で行ってください。
    1. 固定した腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-L(水とCUBIC-Lの1:1混合物)に14 mLの丸底チューブ( 材料の表を参照)に浸し、室温で6時間穏やかに振とうします(図2A)。その後、14mLの丸底チューブに7mLのCUBIC-Lを浸漬し、37°Cで5日間穏やかに振とうします。
    2. このプロセス中は、CUBIC-Lを毎日更新してください。脱色および脱脂プロセスの後、腎臓をPBSで室温で2時間(3回)洗浄します9 (図1)。サンプルの取り扱いにはディスペンシングスプーンを使用してください(図2B)。

3. ホールマウント免疫蛍光染色

  1. 染色バッファーを準備します。
    1. 0.5%(v/v)のTriton X-100、PBS中の0.5%カゼイン、および0.05%アジ化ナトリウムを混合することにより、一次抗体用の染色バッファーを調製します9。
    2. 0.5%(v/v)のTriton X-100、0.1%のカゼインをPBSに、0.05%のアジ化ナトリウムを混合して、二次抗体用の染色バッファーを調製します9。
  2. 一次抗体による染色を行います。
    1. 脱脂質化した腎臓を一次抗体(1:100または1:200、 材料の表を参照)で染色バッファー中で37°Cで7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。
      注:1つの腎臓に必要な染色バッファーの量は500〜600μLです(図2C)。
    2. PBS(PBST)中の0.5%(v / v)トリトンX-100で腎臓を室温で1日間洗浄します 9(図1)。
  3. 二次抗体による染色を行います。
    1. 腎臓を二次抗体(1:100または1:200、 材料表を参照)で染色バッファー中で37°C、7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。腎臓をPBSTで室温で1日間洗浄します9 (図1)。
    2. 固定後9、腎臓をPB中の1%ホルムアルデヒド(37%ホルムアルデヒドとPBの1:36混合物)に3時間浸し、PBSで室温で6時間洗浄します(図1)。

4. 屈折率(RI)マッチング

  1. キュービックR+を準備します。
    1. 45重量%の2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン/アンチピリンと30重量%のニコチンアミドを混合してCUBIC-Rを調製します(材料の表を参照)。
    2. 以前に発表されたレポート4,8,9に従って、0.5 v%のN-ブチルジエタノールアミンをCUBIC-Rに添加することにより、屈折率(RI)マッチング用のCUBIC-R+を準備します。
  2. RI マッチングを実行します。
    1. 腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-R +(水とCUBIC-R +の1:1混合物)に14 mLの丸底チューブに浸し、室温で1日間穏やかに振とうします。.次に、室温で2日間穏やか に振とうしながら、14 mLの丸底チューブ内の7 mLのCUBIC-R+に浸します9(図1)。
      注:腎臓はRIマッチングの開始時に50%CUBIC-R +で浮遊しますが、プロセスの最後に沈み、CUBIC-R +で透明になります(図2D)。

5. 画像の取得と再構成

  1. 画像取得中(RI = 1.51)5 (図3)中に、RIに整合した腎臓をシリコンオイル(RI = 1.555)とミネラルオイル(RI = 1.467)の混合物に浸します(55:45)。
  2. 特注の9 ライトシート蛍光顕微鏡で腎臓全体の3D画像を取得します( 材料表を参照)。すべての生の画像データを16ビットTIFF形式で収集します。イメージング解析ソフトウェア(Imaris、 材料表を参照)を使用して、3Dレンダリングされた画像を視覚化およびキャプチャします。

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結果

この染色法を用いて、腎臓全体の交感神経[抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体]および動脈[抗α平滑筋アクチン(αSMA)抗体](図4A、Bおよびビデオ1)を可視化しました9。虚血/再灌流障害(IRI)後の異常な腎交感神経も可視化されました9,10(図4C)。さらに、脾臓13全体における交感神経の可視化は、このプロトコルを用いて達成された(図4D)。3D免疫蛍光データを定量する一例を図5に示す。

また、採取管[抗アクアポリン2(AQP2)抗体]、近位尿細管のS1セグメン...

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ディスカッション

本プロトコルにより、交感神経、集合管、動脈、近位尿細管、糸球体などのさまざまな構造の腎臓全体の3Dイメージングが可能になりました9、10、11。この染色法は、糖尿病性腎疾患11の虚血再灌流障害後の腎交感神経の変化を可視化し、新たな生物学的発見をもたらした。

不透明度は、組織5における光学的不均一性に由来する。さまざまな組織透明化法の共通原理は、光散乱体/吸収体を除去し、RIマッチング試薬で空間を満たすことです。溶媒除去臓器の3Dイメージング(3DISCO/iDISCO)3,14

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

本研究の一部は、東京大学の上田宏樹教授、順天堂大学須崎悦夫教授、東北大学・田中哲弘教授、深川雅文教授、和田武彦博士、駒場博隆教授(東海大学)との共同研究によって行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
14 mL丸底高透明度PP試験管ファルコン352059組織の透明化、染色、洗浄
2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン/アンチピリン東京化学工業D1876CUBIC-R +
37%-ホルムアルデヒド溶液Nacalai Tesque16223-55固定後
4%-パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液Nacalai Tesque09154-85腎臓固定
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibodyInvitrogenA-21436二次抗体 (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibodyInvitrogenA-31573二次抗体 (1:200)
抗アクアポリン2 (AQP2) 抗体Abcamab199975一次抗体 (1:100)
抗ポドシン抗体Sigma-AldrichP0372一次抗体 (1:100)
抗ナトリウムグルコース共輸送体 2 (SGLT2) 抗体Abcamab85626一次抗体 (1:100)
抗チロシンヒドロキシラーゼ (TH) 抗体Abcamab113一次抗体 (1:100)抗
アルファ;-平滑筋アクチン (&α;-SMA) 抗体Abcamab5694一次抗体 (1:200)
PBS中のブロッカーカゼインサーモフィッシャーサイエンティフィック37528染色バッファー
酒石酸ブトルファノール明治005526麻酔薬
C57BL/6NJcl日本バイオサップセンターN/Aマウス
イマリスビットプレーンN/Aイメージング解析ソフトウェア
マクロズーム顕微鏡オリンパスMVX10観察ユニット特注顕微鏡
メデトミジン塩酸塩共立製薬008656麻酔薬
ミダゾラムサンドーズ27803229麻酔薬
鉱物油Sigma-AldrichM8410液浸油
N-ブチルジエタノールアミン東京化学工業B0725CUBIC-L, CUBIC-R
+ニコチン酸アミド東京化学工業N0078CUBIC-R+
ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル/トリトン X-100ナカライテスク12967-45CUBIC-L、PBST
シリコンオイル HIVAC-F4信越化学50449832浸漬油
ジ化ナトリウム和光195-11092染色緩衝液
ア

参考文献

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
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