CUBICによる全腎三次元染色

サマリー

本プロトコルは、3次元(3D)腎臓イメージングのための組織透明化法およびホールマウント免疫蛍光染色を記載する。この技術は、腎臓病理学における巨視的な視点を提供し、新しい生物学的発見につながる可能性があります。

要約

従来の病理では腎臓の微細構造に関する情報が数多くありましたが、腎臓の血管、近位尿細管、集合管、糸球体、交感神経の正確な構造を知ることは、3次元(3D)情報が不足しているため困難でした。光学クリアリングは、この大きなハードルを克服するための優れた戦略です。組織クリアリングと3Dイメージング技術を組み合わせることで、臓器全体の複数の細胞を単一細胞分解能で解析できます。しかし、全臓器イメージングのための細胞標識法は未開発のままです。特に、ホールマウント臓器染色は抗体の浸透が難しいため困難です。本プロトコルは、CUBIC(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)組織クリアリング法による3Dイメージング用のホールマウントマウス腎臓染色を開発しました。糖尿病性腎疾患の早期における虚血再灌流障害後の腎交感神経除神経や糸球体腫大を総合的に可視化することが可能となりました。したがって、この技術は、巨視的な視点を提供することにより、腎臓研究における新しい発見につながる可能性があります。

概要

腎臓はさまざまな細胞集団で構成されています。従来の病理では腎臓の微小環境に関する多くの情報が得られますが、腎臓病進行時の細胞間クロストークを正確に理解するためには、3次元(3D)イメージングが必要です。従来、臓器全体の3Dイメージングには膨大な数の連続切片作成と画像再構成が必要でした¹。しかし、この方法は手間がかかりすぎて再現性に問題がありました。

光学クリアリングは、このハードル^2,3を克服するための優れた戦略です。組織の不透明度は、各臓器が水、タンパク質、脂質などのさまざまな物質で構成されているため、主に光の散乱と吸収によるものです。したがって、組織透明化の基本的な戦略は、組織内の水と脂質を、タンパク質⁴と同じ光学特性を持つ屈折率(RI)マッチング試薬に置き換えることです。透明な標本を観察するためには、ライトシート蛍光顕微鏡が有用である⁵。ライトシートは透明な試料を側面から照らし、励起信号は垂直位置⁶にある対物レンズを通して取得される。この顕微鏡は、共焦点または多光子蛍光顕微鏡とは異なる、単一のスイープで断面情報を取得します。したがって、低レベルの光退色でzスタック画....

プロトコル

すべての実験は東京大学治験審査委員会の承認を受けました。すべての動物の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。8週齢の雄C57BL/6NJclマウスを本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1.動物の準備と腎臓の固定

1. 以下の手順に従って灌流固定を行います。
   1. イソフルラン(3%、2.0 L / min)の吸入と塩酸メデトミジン(0.3 mg / kg)、酒石酸ブトルファノール(5 mg / kg)、およびミダゾラム(4 mg / kg)の腹腔内投与によってマウスを麻酔します( 材料の表を参照)。.
   2. 心臓¹²の左心室を通して、20mLのPBS(pH7.4)およびリン酸緩衝液(PB)中の30mLの4%PFAで動物に灌流する。
2. 灌流固定と腎臓サンプリングの直後に浸漬固定を行う⁹.
   1. 腎臓を4%PFAに4°Cでさらに16時間浸した後、PBSで2時間(3回)洗浄します⁹ (図1)。
      注意: ホルムアルデヒドとパラホルムアルデ....

結果

この染色法を用いて、腎臓全体の交感神経[抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体]および動脈[抗α平滑筋アクチン(αSMA)抗体](図4A、Bおよびビデオ1)を可視化^{しました9。}虚血/再灌流障害(IRI^)後の異常な腎交感神経も可視化されました^9,10(図4C)。さらに、脾臓¹³全体における交感神経の可視化は、このプロトコルを用いて達成された(図4D)。3D免疫蛍光データを定量する一例を図5に示す。

また、採取管[抗アクアポリン2(AQP2)抗体]、近位尿細管のS1セグメン.......

ディスカッション

本プロトコルにより、交感神経、集合管、動脈、近位尿細管、糸球体などのさまざまな構造の腎臓全体の3Dイメージングが可能になりました⁹、^10、11。この染色法は、糖尿病性腎疾患¹¹の虚血再灌流障害後の腎交感神経の変化を可視化し、新たな生物学的発見をもたらした。

不透明度は、組織⁵における光学的不均一性に由来する。さまざまな組織透明化法の共通原理は、光散乱体/吸収体を除去し、RIマッチング試薬で空間を満たすことです。溶媒除去臓器の3Dイメージング(3DISCO/iDISCO)^3,14

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
14 mL丸底高透明度PP試験管	ファルコン	352059	組織の透明化、染色、洗浄
2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン/アンチピリン	東京化学工業	D1876	CUBIC-R +
37%-ホルムアルデヒド溶液	Nacalai Tesque	16223-55	固定後
4%-パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液	Nacalai Tesque	09154-85	腎臓固定
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	二次抗体 (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	二次抗体 (1:200)
抗アクアポリン2 (AQP2) 抗体	Abcam	ab199975	一次抗体 (1:100)
抗ポドシン抗体	Sigma-Aldrich	P0372	一次抗体 (1:100)
抗ナトリウムグルコース共輸送体 2 (SGLT2) 抗体	Abcam	ab85626	一次抗体 (1:100)
抗チロシンヒドロキシラーゼ (TH) 抗体	Abcam	ab113	一次抗体 (1:100)抗
アルファ;-平滑筋アクチン (&α;-SMA) 抗体	Abcam	ab5694	一次抗体 (1:200)
PBS中のブロッカーカゼイン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	37528	染色バッファー
酒石酸ブトルファノール	明治	005526	麻酔薬
C57BL/6NJcl	日本バイオサップセンター	N/A	マウス
イマリス	ビットプレーン	N/A	イメージング解析ソフトウェア
マクロズーム顕微鏡	オリンパス	MVX10	観察ユニット特注顕微鏡
メデトミジン塩酸塩	共立製薬	008656	麻酔薬
ミダゾラム	サンドーズ	27803229	麻酔薬
鉱物油	Sigma-Aldrich	M8410	液浸油
N-ブチルジエタノールアミン	東京化学工業	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R
+ニコチン酸アミド	東京化学工業	N0078	CUBIC-R+
ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル/トリトン X-100	ナカライテスク	12967-45	CUBIC-L、PBST
シリコンオイル HIVAC-F4	信越化学	50449832	浸漬油
ジ化ナトリウム	和光	195-11092	染色緩衝液

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