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方法論記事

横方向ソフトライト照明 による 大脳オルガノイド培養の促進

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DOI:

10.3791/63989

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2022年6月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

この記事について

サマリー

脳オルガノイドは、臓器の発達とヒトの疾患病理を研究するための前例のない機会を提供します。脳オルガノイド培養系では大きな成功を収めていますが、この技術を適用するには運用上の困難が依然としてあります。本プロトコールは、培地交換およびオルガノイド移動を容易にする大脳オルガノイド手順を記述する。

要約

現在、大脳オルガノイド培養技術は依然として操作が複雑であり、大規模に適用することは困難である。シンプルで実用的な解決策を見つける必要があります。したがって、より実現可能な脳オルガノイドプロトコルが本研究において提案されている。培地交換やオルガノイド移動における避けられない不便さを早期に解決するため、現在の研究では工学原理を応用して運用技術を最適化しています。軟質ライトランプを採用して胚様体(EB)サンプルを横方向に照らし、拡散反射効果を高めてEBを肉眼で見ることができました。回転によって生成される二次流れの原理を使用して、オルガノイドは井戸の中心に向かって集まり、培地交換またはオルガノイド移動の動作を容易にする。分散した細胞と比較して、胚様体はピペット内でより速く沈降する。この現象を使用すると、ほとんどの遊離細胞および死細胞断片を簡単な方法で効果的に除去することができ、EBが遠心分離による損傷を被るのを防ぐことができる。この研究は、脳オルガノイド培養の操作を容易にし、脳オルガノイドの適用を促進するのに役立つ。

概要

2次元(2D)培養系と比較して、3次元(3D)培養系は、特定の器官の真の複製および複雑な構造の効率的な再生を含むいくつかの利点を有する1。したがって、脳オルガノイドは、ヒトの脳の発達や疾患2、薬物スクリーニング、細胞治療などの研究分野にとって重要な補助方法の一つである。

回転懸濁法によって大脳オルガノイドを培養することは、それらの発達および成熟に資する3.脳オルガノイド培養系は大きな成功を収めていますが、依然としてその適用を制限する重大な課題に直面しています。例えば、手作業による栽培は複雑な操作工程を伴い、大規模な施用を実現する上での障害となります。さらに、脳オルガノイドの培養における各発達段階では、異なる培地およびサイトカインの変化が必要である4。しかし、初期段階では、オルガノイドまたはEBは小さなサイズ(約200μm〜300μm)を有し、適切な装置なしではほとんど視覚的にアクセスできない。必然的に、培地を交換すると、一定量の貴重なオルガノイドサンプルが洗い流されます。他の種類のオルガノイド培養においてこれを克服するために多くの技術が探求されており、いくつかの例には、オルガノイドチップ全体を介入なしに3日間培養培地に浸漬することが含まれる5;古い媒体が吸収紙5を用いて吸収された後、カバースリップを通して新鮮な媒体を添加するステップと、または流体交換のために複雑なマイクロ流体パイプラインを適用する6,7,8。オルガノイド培養の初期段階で遭遇するもう一つの障害は、肉眼で直接観察を達成することの難しさであり、オルガノイド移送ステップ中にオルガノイドの損傷および損失につながる貧弱な操作を引き起こす可能性がある。したがって、オルガノイドを生成するための培地交換およびオルガノイド移動を容易にする、より実現可能なプロトコルを確立する必要がある。

これらの問題を克服するために、工学原理に基づく対応する最適化された操作が提案され、これは多くのオルガノイド手順を有意かつ便利に容易にする。自然界では、太陽が窓の隙間から家に照らされると、肉眼では光線の中で踊るほこりを見ることができます。ほこりに太陽光が拡散反射するため、一部の光が眼球に屈折して視覚的な画像が生成されます。この現象9,10の原理に触発されて、この研究は柔らかいライトランプを作り、EBを横方向に照らしました。EB は、表示範囲に影響を与えずに視覚的に明瞭であることがわかりました。渦電流11により培養プレートを回転させることにより、中心を指す二次流れが液体中に発生する。もともと分散したEBはプレートの中央に蓄積します。これに基づき、オルガノイドの沈降速度が細胞の沈降速度よりも速いという現象や、遠心分離を行わずに培地交換やオルガノイド移送の容易な操作方法が提案されている。培養液中のオルガノイドは、この移入操作によって遊離細胞および死細胞断片から効果的に分離することができる。

ここでは、ヒト多能性幹細胞から脳オルガノイドを生成するために、操作が容易なプロトコルが提案されている。操作技術は、エンジニアリング原理を適用することで最適化され、3D文化での操作を2D文化の操作と同じくらいシンプルで実現可能にしました。改善された液体交換法およびオルガノイド移送操作は、他のタイプのオルガノイド培養および自動培養機の設計にも有用である。

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プロトコル

議定書はヘルシンキ宣言に従って実施された。広州医科大学第三附属病院の倫理委員会より承認を得ました(医学倫理審査[2021]第022号)。実験の前に、各培地をユルゲン・A・ノブリッヒの式12 (補足表1〜4)に従って調製し、または市販の脳オルガノイドキットを使用した( 材料表参照)。本研究で用いたiPS細胞は、当研究室が事前に確立したものであり、十分な情報を得た上での免除を受けています。SCA3-iPSCsは、ATXN3遺伝子13に26/78 CAGリピートを保有する遺伝子型決定型化された31 歳の女性脊髄小脳失調症3型(SCA3)患者から生成された(補足図1A)。前回の記事で言及した正常なヒトiPSCをNC-iPSCs14として選択し、ATXN3遺伝子は14/14 CAGリピートを有すると同定された(補足図1B)。

人工多能性幹細胞(iPSC)の作製

  1. ボランティアと患者のインフォームドコンセントを得て静脈穿刺によって末梢血3mLを採取する。
  2. 末梢血単核球をFicoll-Paque法15に従って単離する。
  3. 仙台リプログラミングキットのプロトコルに従ってiPS細胞を作製する( 資料表参照)。
    1. mTeSR1培地を用いてiPS細胞をマトリゲル(基底膜マトリックス、 材料表参照)で覆った35mmペトリ皿中で培養する。毎日メディアを交換します。iPSCの成長密度は75%を超えてはなりません。
    2. PSC解離溶液( 材料表参照)で細胞を消化し、3〜5日ごとに1:5の比率で継代培養します。
      注意:ここではセンダイウイルスを使用しています。バイオセーフティキャビネットで操作し、自己保護対策を講じる必要があります。現地で合法的に使用できるかどうかは明確でなければなりません。使用時には、地域のバイオセーフティに関する法律や規制に厳密に従わなければなりません。

EB準備(0-1日目)

  1. iPS細胞からmTeSR1培地をピペットで取り出し、1mLの1x PBSで2倍洗浄します。
  2. PBSをピペットで取り出し、300μLの細胞剥離液( 材料表参照)を加えて、iPSCを37°Cで3~4分間単一細胞に消化します。
  3. 細胞を2 mLのEB形成培地(補足表1)に再懸濁し、次いでサンプルを300 x g (室温)で5分間遠心分離する。
  4. 特殊な24ウェルプレートを付着防止リンス液(500 μL/ウェル)で5分間前処理します( 材料表を参照)。
    注:付着防止リンス溶液は、最適なEBおよびスフェロイド形成に不可欠です。
  5. 細胞密度1.5 x 106 cells/mLのY-27632(最終濃度、10 μM、 材料表参照)を含むEB形成培地に細胞を再 懸濁します。
  6. 付着防止リンス液を除去し、各ウェルを2mLのEB形成培地ですすいでください。
  7. 特殊な24ウェルプレートに、3 x106 細胞/ウェルの密度で細胞を追加します(図1A、左)。
    注:通常、各ウェルに300EBを準備できます。この方法は、同じサイズのEBを大量に調製することができる。
  8. プレートを100 x g で室温で2分間遠心分離します。プレートの下部にある各チャンバーに細胞を均一に分布させます(図1A、右)。
    注:適切な遠心分離機がない場合は、プレートをインキュベーターに直接入れて静置することもできますが、EBボールの形成時間は通常の遠心分離の場合よりも数時間遅くなります。
  9. サンプルを37°Cおよび5%CO2で24 時間インキュベートします。前の工程で遠心分離を使用しなかった場合は、36時間インキュベートする。サンプルを安定させ、この期間中はインキュベーターから取り出さないでください。

3. ソフトライトランプの準備(1日目)

  1. A5用紙サイズの厚さ0.3〜0.5cmの透明なアクリル板を使用してください。アクリル板の表裏に白いパッドを貼り付けます。
    1. LEDの白色ライトをプレートの端に並べて取り付け、アクリルプレートの側面からライトが入り、平行に射出されるようにします(補足図2A-F、図1B)。
      注:初期段階のEBの直径は200μm~300μm程度であるため、クリーンベンチの蛍光灯の下で肉眼ではっきりと観察することは困難です。これに対して、拡散反射の増強により、横方向に照らされた柔らかい光を用いることでEBを明瞭に検出することができます(図1B、C)。6ウェルプレートは、その後の実験におけるEB培養に推奨される。しかし、本研究では、柔らかな光の視覚効果をよりよく示すために、皿の代わりに皿を使って写真やビデオを撮ることもありますので、誤解しないでください。横方向に照らされたソフトライトランプも6ウェルプレートに使用できます。

4. EB移送と培地交換(2~5日目)

  1. 新しい6ウェル低接着プレートを用意し、各ウェルに2mLのEB形成培地を加える。
  2. EBを1000 μLの広口径ピペットチップ( 材料表を参照)で培地とともに取り出し、6ウェルの低接着プレート(約100EB /ウェル)に移します。
    メモ:操作プロセスでは、EBを観察しやすくするために、ソフトライトランプ(手順3で説明)を採用しています。他の屋内光源をオフにして、柔らかい光の視覚効果を良くします。
  3. 毎日同じ量の新鮮なEB形成培地と交換してください。セカンダリ フローを使用して、EB を中央に集め、メディアを変更します。
    1. 井戸の端までゆっくりとピペッティングして古い培地を吸引します。あまりにも強く吸わないでください;それ以外の場合、EB は一緒に削除されます。次に、EBを再懸濁するために新鮮な培地を追加します。
      メモ:原則的な二次フロー(図1D)。円軌道に沿って皿を回転させることによって渦巻き流を誘発する。渦巻き流のために、二次流が中心に向かって誘導される。EBまたはオルガノイドは、回転によって生成される二次流れのためにウェルの中心に収束し、その後、培地交換または胚様移植を容易に実行することができる。

5. 多能性マーカーOCT4によるラベリングによる多能性の確認(4日目)

注:EBの直径が300μmを超える場合は、OCT4マーカー免疫蛍光染色のためにいくつかのEBを採取して、それらの多能性を検出します。

  1. EBsを4°Cで4%パラホルムアルデヒドに30分間固定し、続いて1x PBS 3xで毎回10分間洗浄した。
  2. EBを0.3%Triton X-100および3%BSAを含む室温PBSに2時間移し、続いてPBS 3xで毎回10分間洗浄した。
    注:Triton X-100で処理した後、EBは液面に浮かび、洗浄中に液体と一緒に簡単に吸い取ることができます。実体顕微鏡下での操作を推奨します。
  3. OCT4一次抗体( 材料表参照)を1%BSAを含む1mLの1x PBSで1:200の比率で希釈し、EBsに添加して4°Cで一晩インキュベートした後、PBS 3xで毎回10分間洗浄する。
  4. それぞれの二次抗体( 材料表を参照)を1:500で1x PBSで希釈し、EBに1mLを加える。
  5. 室温で2時間インキュベートした後、細胞を1x PBS 3xで毎回10分間洗浄する。
  6. PBSを取り出し、1μg/mLのDAPIを含む2mLの1x PBS溶液を加え、室温で10分間インキュベートした後、PBS 3xで毎回10分間洗浄する。
  7. 少量の液体を含むEBをスライド上に移動させ、端に市販のワセリン( 材料表参照)をコーティングしたカバーガラスでスライドを密封し、蛍光共焦点顕微鏡で画像を観察し収集します。
    注:OCT4発現はEB多能性12を表す。OCT4 の式が 90% 未満の場合、EB は破棄し、EB を再度準備する必要があります。

6. 神経誘導(5~7日目)

  1. 接着力の低い新しい6ウェルプレートを用意し、各ウェルに3mLの神経誘導培地(補足表2)を加える。
  2. 横方向のソフトライト(手順3で説明)をオンにし、他の屋内光源をオフにします。
  3. EBを神経誘導培地(〜100EB /ウェル)を添加した6ウェルプレートに移します。新しい井戸に元の培地をできるだけ少なく加えます。
    注:オルガノイド転送の簡単なスキルを紹介します。当然のことながら、重力下で、媒体よりも比較的高い密度で、再懸濁されたEBは、 図1Eに示す動作を適用することによって徐々に沈む。したがって、EBは便利に転送できます。EBと比較して、遊離細胞および死細胞断片はよりゆっくりと沈むので、したがって、遊離細胞および死細胞断片の大部分は、この沈降法によって除去することができる(図1F)。
  4. サンプルを37°Cおよび5%CO2で24 時間インキュベートします。
    注:顕微鏡下では、EBの直径は約500μmであり、縁は半透明であり、神経上皮層が形成されたことを示している。
  5. 次の手順に進みます。

7. 基底膜マトリックスへの埋め込み(7~10日目)

  1. 膜マトリックスを4°Cの冷蔵庫に60分間置き、予め溶解させた。必要な行列の量を事前に計算してください。約100個のEBを1.5mLの膜マトリックスに包埋した。
  2. 横方向のソフトライトをオンにし、本体上部の光源をオフにします。
  3. 固化を防ぐために、膜マトリックスを氷上に保ちます。
  4. 毎回、少量のEBを新鮮な膨張培地(補足表3)を含む60mmディッシュに移します。EB の数を減らして、1 つの EB を簡単に削除できるようにします。
  5. その後、新しい6ウェル低接着プレートを使用する。毎回、1 つの EB (約 10 μL 培地を含む) を 200 μL の広口径ピペットチップ ( 材料表を参照) で吸い込み、6 ウェルプレートの底部に追加して液滴を作ります。ウェルあたり5つの液滴を使用してください。
    メモ:ピペットガンの範囲を50 μLに調整し、EBを吸い込んでから、 図1Eの動作を参照してください。EBがピペットチップのボアに落ち着くと、チップはすぐにプレートのウェル底部に触れ、約10μLの液体を押し出して液滴を形成します。
  6. EBを含む各滴に15μLの膜マトリックスを加え、素早く混合する。液滴の中央にEBボールを埋め込む。
    メモ: EB を標準のピペットチップで吸引してはならず、EB を損傷します。代わりに、200 μLのワイドボアピペットチップを使用する必要があります。
  7. 6ウェルプレートを37°Cのインキュベーター内に30分間置き、EBsを含む膜マトリックス液滴を固化させた。
  8. 各ウェルに3 mLの膨張培地を加え、マトリックス埋め込みEBを静かに吹き飛ばして懸濁させます。
  9. 37°Cおよび5%CO2 で3日間インキュベートする。
    注:EBの表面に出芽が観察される場合、それは拡張された神経上皮が形成されたことを意味する16。

8.オルガノイド成熟(10-40日目)

  1. 元の培地を穏やかに取り出し、3 mLの成熟培地(補足表4)を各ウェルに加えた。
  2. オルガノイドプレートを37°Cのインキュベーター内の水平シェーカーの上に置きます。
  3. カルチャを水平方向に回転させ続けます。シェーカーを適切な速度に設定します。
    注:6ウェルプレート上で大脳オルガノイドを培養する場合、水平シェーカーの製造元によると、0.11808 x gの相対遠心力(RCF)がより適切です(材料表を参照)。相対遠心力と回転速度17,18の間の変換によると、RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm 2、ここでRCF = 相対遠心力(g)、 rpm = 毎分回転数(r / min)、R = 回転半径(cm)(シェイクスローとも呼ばれます)。 異なるシェーカーの振とうスローパラメータは異なる場合があります。したがって、回転数はrpm=299×(RCF/R)1/2と推定できる。
  4. 新鮮な成熟培地を2〜3日ごとに交換してください。
  5. 20〜30日後、成熟するまで大脳オルガノイドを徐々に培養する。
    注:この期間中、オルガノイドは、神経マーカー検出およびトランスクリプトームシーケンシング19、20、21などの実験および検出に使用することができる。

9. 脳オルガノイドの凍結切片と免疫蛍光

  1. オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドに4°Cで16時間固定し、1回1倍PBSで3倍に10分間洗浄します。
  2. PBSを取り出し、オルガノイドを4°Cで30%スクロースに一晩浸漬した。
  3. オルガノイドを37°Cで1時間10%/7.5%ゼラチン/スクロースに包埋し、その後すぐに包埋型に移します。
  4. 100%エタノールにドライアイスを加えてドライアイス/エタノールスラリーを調製し、その中にオルガノイドサンプルを入れて急速凍結させます。
  5. 凍結したサンプルを-80°Cの冷凍庫に保管します。必要に応じて、厚さ20μmの凍結切片を作ります。
  6. ステップ 5.3.-5.5 を参照してください。免疫蛍光用。PAX6抗体を使用して頂端前駆細胞を標識し、TUJ1抗体(材料表を参照)、神経細胞22、23、24を標識し、DAPIを核DNA染色に使用します。

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結果

本研究は、iPS細胞(図2B)を脳オルガノイド(図2C)に誘導した。初期段階で栽培されたEBsはOCT4マーカー(図2A)を発現し、良好な多能性を示した。後の段階では、EBは成熟した脳オルガノイドに発達した(図2D)。この研究では、正常な健常者およびSCA3患者からiPS細胞を脳オルガノイドに培養した(図3A)。SCA3は、マチャド・ジョセフ病(MJD)としても知られており、ATXN3遺伝子25のポリグルタミン拡張によって引き起こされる神経変性障害である。RNA-seqデータ(パブリックリポジトリにアップロード、 材料表を参照)は、神経伝達物質輸送、シナプス形成、および調節などの経路において、正常な大脳オルガノイド群とSCA3大脳オルガノイド群との間の遺伝子発現...

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ディスカッション

脳オルガノイドは、医学研究のための新しい道を開きます。この技術の多くの有用な応用は、まだ探求され始めたばかりである28。この研究は、遺伝的に罹患した大脳オルガノイドと正常な脳オルガノイドのトランスクリプトームシーケンシング結果が、疾患と健康の違いを反映し得ることを見出した。例えば、RNA-seqデータ解析結果(図3B)は、SCA3疾患に関する多くの報告された研究29、30、31、32と一致している。培地交換、EB移送、ラッピングなどの実験操作は、脳オルガノイドを培養し、良好な均一性を有するオルガノイドを調製できるかどうかを決定するために不可欠である33,34。本...

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開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

本研究は、広東省自然科学財団(助成番号2020A0505100062)、広州市科学技術重点プロジェクト(助成第201904020025号)、中国国家自然科学財団(助成第31872800号、32070582、82101937)、広州市ポスドク研究助成事業(陳邦珠市宛)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 μm FilterNEST Biotechnology, 中国331001
1000 μL ワイドボアピペットチップThermo Fisher Scientific, USA9405163
200 μL ワイドボアピペットチップサーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国9405020
2-メルカプトエタノールメルク社(ドイツ) 8057400005
4% パラホルムアルデヒドServicebio(中国)G1101
6ウェル低接着プレートNEST バイオテクノロジー(中国) 703011EBs懸濁液培養に使用されています
Aaccute 細胞剥離液STEMCELLTechnologies, Canada07920iPS細胞を単一細胞に消化するために使用されます。
AggreWell800 24-wellSTEMCELL Technologies, Canada34811EB調製用の微多孔質培養プレート。
抗付着リンス液STEMCELL Technologies, Canada07010細胞接着を防ぐための培養器材用リンス液
B27-vit.サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国12587010
bFGFPeprotech、米国GMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology、中国ST025
遠心分離機エッペンドルフ、ドイツ5810 Rさまざまな種類の遠心分離管、試薬ボトル、作業プレートの遠心分離に使用できます。
カバーガラスShitai実験装置、中国10212020C
DAPIのBeyotime Biotechnology、中国C1002核染色に使用されます。DAPIを二本鎖DNAと組み合わせた後、最大励起波長は364nm、最大発光波長は454nmでした。
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, USA11330032
ES-quality FBSThermo Fisher Scientific, USA10270106
Ficoll PaqueGeneral Electric Company, USA17-5442-02Ficoll-Paque法により末梢血単核細胞を単離します。
ゼラチンサンゴン バイオティーチ、中国A609764
Glutamax サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国35050061
Glutamax サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国17504044
ヤギ抗チキン IgY  二次抗体アブカム、英国ab150171ヤギ抗チキン IgG.コンジュゲーション:Alexa Fluor 647。例:652 nm、EM:668 nm。1:500希釈でご使用ください。
ヤギ抗マウスIgG二次抗体Abcam, UKab150120ヤギ抗マウスIgG.コンジュゲーション:Alexa Fluor 594。例:590 nm、EM:617 nm。1:500希釈でご使用ください。
ヤギ抗ウサギIgG二次抗体Abcam, UKab150077ヤギ抗ウサギIgG.コンジュゲーション:Alexa Fluor 488。例:495 nm、Em:519 nm。1:500希釈でご使用ください。
ヘパリンメルク、ドイツH3149
水平シェーカーServicebio、中国DS-H200メーカーのINFORS HT(スイス)によると、0.11808 x gの相対遠心力(RCF)がより適切です。
インスリンメルク、ドイツI9278-5ML
KOSRサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国10828028
マトリゲルコーニング、米国354277 マトリゲルは4°C以上の環境で固化します。Cなので、低温でサブパックする必要があります。
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, USA11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, Canada85850iPSC culture medium
N2 supplementThermo Fisher Scientific, USA17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, USA21103049
OCT4 primary antibodyAbcam, UKab19857ホスト:ウサギ。500 μ で溶解します。L PBSの。1:200の希釈で使用してください。
病理学的凍結スライサーライカ、ドイツライカ CM1860
PAX6 一次抗体Abcam、英国ab78545宿主:マウス。1:100希釈でご使用ください。
PBSSTEMCELL Technologies, Canada37350
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, USA15140122
PSC解離液Beijing Saibei Biotechnology, ChinaCA3001500酵素を含まない解離液は、iPS細胞の消化と継代に使用できます。
仙台リプログラミングキットサーモフィッシャーサイエンティフィック社(米国) A16518仙台リプログラミングキットのプロトコルに従ってiPS細胞を樹立します。
スライドガラスShitai実験装置、中国188105W
ソフトライトランプナット自作のデバイス、準備については補足図2を参照してください。
STEMdiff 脳オルガノイドキットSTEMCELL Technologies, Canada8570内容: 1. EB 形成培地;2.誘導媒体;3.拡張媒体;4.成熟媒体。
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit STEMCELL Technologies, Canada8571Maturation Medium
SucroseSangon Bioteach, ChinaA502792
Triton X-100Merck, GermanyX100
TUJ1 Primary antibodyAbcam, UKab41489宿主: Chicken.1:1000希釈でご使用ください。
ワセリンSangon Bioteach, ChinaA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, Canada72302PBSに5 mMのストック溶液を調製し、1 mgを624 & microに再懸濁します。PBSのL。
Weblink
Raw シーケンシングデータゲノム配列アーカイブ (ゲノミクス、プロテオミクス、プロテオミクス &Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of SciencesGSA-Human:HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/
) シンプルな

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