透過型電子顕微鏡法:神経芽腫の外科病理学ツール

サマリー

小児の小さな丸い青色細胞腫瘍は、興味深く、挑戦的な新生物のコレクションです。したがって、透過型電子顕微鏡(TEM)と小児腫瘍の専門知識は、外科病理学において非常に価値があります。ここでは、小児期に最も一般的な固形腫瘍の1つである神経芽腫を診断するためのTEMを実行するためのプロトコルを紹介します。

要約

小児の小丸い青細胞腫瘍(PSRBCT)は、興味深く、挑戦的な新生物のコレクションです。小さな丸い青色細胞腫瘍の光学顕微鏡検査は、小さな丸い細胞を特定します。それらは、一般的に過色性の核と比較的乏しい好塩基性細胞質を抱いています。小児の小さな丸い青色細胞腫瘍には、いくつかの実体が含まれます。通常、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、網膜芽細胞腫、リンパ腫、小細胞骨肉腫などが組み込まれています。免疫組織化学を用いても、これらの新生物の鑑別診断は光学顕微鏡法で議論の余地があるかもしれない。かすかな染色や曖昧な背景は、病理医が適切な診断決定を下すのを思いとどまらせる可能性があります。さらに、分子生物学は、それらを区別するのが難しい圧倒的な量のデータを提供する可能性があり、一部の転座は複数のカテゴリで見られる可能性があります。したがって、透過型電子顕微鏡(TEM)は非常に価値があります。ここでは、神経芽腫のTEMデータに関する最新のプロトコルを強調します。神経分泌性顆粒を含む細胞質突起のもつれを持つ腫瘍細胞は、神経芽腫を診断できます。

概要

病理医の仕事は、臨床診断と研究分野の両方でかなり難しいかもしれません。18^世紀と19^{世紀における}光学顕微鏡の進化は目覚ましいものでした。電子顕微鏡の出力は、主に電子の波長に依存しており、これは光^1,2,3よりも短いです。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が登場し、免疫組織化学に応用される前は、TEMは小さな丸い青色細胞腫瘍の診断に重要な役割を果たしていました。

前世紀の90年代から、免疫組織化学的アプローチは、診断において形態学的ツールに取って代わってきました⁴。現在、小さな丸い青色細胞腫瘍グループ^4,6,7,8の抗原に向けられた何千もの新しいポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体があります。非常に多産な20^世紀の最後の10年間と21^世紀初頭の最初の10年間で、ゲノムプローブから次世代シーケンシングまでの蛍光in situハイブリダイゼーションを含む分子生物学は、いくつかの研究室で免疫組織化学の重要な応用の役割に取って代わったようです⁴.アメリカ合衆国の食品医薬品局(FDA)、カナダのカナダ食品検査庁(CFIA)、環境保護庁(EPA)、または他の国の同様の政府機関は、分子生物学のプロトコルを必ずしも承認していない⁹。治療目的で使用できる病理レポートに挿入するのは非常に難しい情報がたくさんあるようで、十分な資金を持ち、稼働している検査情報システムの適切な選択が重要である¹⁰。その間、免疫組織化学は、上皮腫瘍が間葉系マーカーを示し、その逆も同様であるなど、多くの落とし穴を明らかにしています¹¹。上皮間葉転換は、病理学グループ^12,13のいくつかの境界を混乱させています。ここ数年で、電子顕微鏡法が世界中のいくつかの研究室で盛んになったことが明らかになりました¹⁴。特に、組織標本のターンアラウンドタイムは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体による染色にアプローチするいくつかのプロトコルを使用して、数週間からわずか3日以下に短縮されました^4,10。

さらに、電子顕微鏡に電子カメラを取り付けたことで、病理医は迅速な画像を得ることができ、これはさまざまなオペレーティングシステムで汎用性を発揮します。最後に、一部の抗体は、抗原賦活化後であっても、壊死またはオートファジー/虚血関連の変化の一部の領域で明らかにすることが困難です。同時に、安全な手による電子顕微鏡検査は、未知の病理学的腫瘍の正しい分類のための優れた結果とヒントを依然として提供することができます¹⁵。

小児の小円形青色細胞腫瘍群には、主に神経芽腫、ウィルムス腫瘍または腎芽腫、横紋筋肉腫、およびユーイング肉腫など、いくつかの腫瘍が含まれる。小さな丸い青色細胞腫瘍の小児グループと比較した分子生物学的データは、適用される技術のために圧倒される可能性があります。小さな丸い青色の細胞は、通常の染色(ヘマトキシリンおよびエオシン染色)ではあまり変わらない場合があり、一部の腫瘍は異常な免疫表現型の特徴を持っている可能性があります。TEMの発見以来、分子生物学の進歩は目覚ましいものがあります。小さな丸い青色細胞腫瘍のグループでは、一部の新生物が他の新生物よりも頻繁に遭遇する可能性がありますが、それらを考慮する必要があります。乳頭状腎細胞がんは本質的に小さな丸い青色細胞腫瘍ではなく、主に乳頭を特徴としていますが、いくつかの補助的な技術を使用して、他のよく知られた小さな円形の青色細胞腫瘍(例えば、ウィルムス腫瘍)とは異なる必要がある可能性のあるいくつかの円形細胞領域を示す場合があります¹⁶。最終的には、後腎間質腫瘍も鑑別診断に取り入れる必要があるかもしれません¹⁷。ラブドイド腫瘍は、腎臓亜型と腎外亜型¹⁸に異なる特に悪性の小児腫瘍である。

神経芽腫は、乳児期および小児期に最もよくみられる固形悪性腫瘍の1つです。神経芽細胞腫細胞は、この固形腫瘍の悪性細胞であり、原始神経堤の誘導体から潜行性に発生します。その診断と鑑別診断は難しいかもしれません。その自然生物学は、過去数十年で目覚ましい進歩を遂げました。転写因子のフォークヘッドファミリーは、明確な「フォークヘッド」ドメイン(FOXO3/FKHRL1)によって特徴付けられます。これらの転写因子は、細胞死に必要な遺伝子の発現を通じて、アポトーシス(プログラム細胞死)の引き金として機能します。FOXO3/FKHRL1は、5-アザ-2-デオキシシチジンによって活性化され、サイレンシングされたカスパーゼ-8を誘導し、この複合体は神経芽腫において重要な役割を果たします。核FOXO3は、神経芽腫^7,19の有害な臨床転帰を予測し、腫瘍血管新生を促進します。分子病理学の進歩にもかかわらず、島田分類は依然として病理医および小児腫瘍医の診療標準です。これは、好調な組織型と好ましくない組織型を区別する上で重要です20,21,22,23。

神経芽腫が疑われる腫瘍の電子顕微鏡検査のための簡単なプロトコルを開発する理論的根拠は、組織標本の超微細構造検査の実現可能性と堅牢性に関連しています。免疫組織化学を使用して一般的に遭遇する問題によって変更されることはめったにありません。理論的根拠とプロトコルは、小児病理学および電子顕微鏡^法4,24,25へのいくつかの教科書と科学的貢献の基礎となっています。このプロトコルは、著者の30年の経験にまたがり、個人的な経験と文献レビューを強調して、いくつかのPSRBCTに焦点を当てます。

プロトコル

人間の参加者が参加する研究で実施されたすべての手続きは、機関および/または国内研究委員会の倫理基準、および1964年のヘルシンキ宣言とその後の改正、または同等の倫理基準に従っていました。電子顕微鏡検査は、診断目的で受け取ったサンプルの顕微鏡検査の通常のルーチンの一部であり、生命倫理委員会の承認は必要ありません。この研究は遡及的であり、サンプルの完全な匿名性を尊重します。

1. FFPE(ホルマリン固定およびパラフィン包埋)検索およびグルタルアルデヒド固定組織標本のTEMプロトコール

1. ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された最後のスライドとFFPE組織ブロックを回収します。
2. 油性マーカーを使用して、ティッシュスライド上の関心領域を選択し、ティッシュブロック上の領域に一致させます。
3. ブロックから新しいかみそりの刃で選択した領域を切り取り、濾紙で5mmの立方体に正確に切ります。
4. 回収したティッシュペーパーを入れた濾紙をラベル付きのシャーレに入れます。ペトリ皿を60〜70°Cのオーブンに15分間、つまりパラフィンが溶けるまで(パラフィンワックスは、融点が48°C〜66°C(120〜150°F)の範囲の固体直鎖炭化水素の混合物で構成され、濾紙に吸収されるまで)保管します。
5. パラフィンを含まない回収した組織を、4 mL の 100% トルエン (メチルベンゼン) v/v [100% トルエンは 100 mL のトルエンを意味します] を充填したシンチレーションバイアルに移します。脱パラフィン処理中、サンプルが連続的に回転していることを確認します(回転速度:24回転/分)。
6. 角度付き回転装置を使用して、トルエンを各1時間ずつ2回交換し、100%トルエンを4mLを各30分ずつ1回交換します。
7. 4 mLの100%無水エタノール(C₂H₅OH)を1時間1回交換し、次に4 mLの100%無水エタノールをそれぞれ30分間2回交換します。次に、70%エタノールの4mLで30分間別の交換を行います。
8. 4 mLの0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を1回交換し、30分間進めます。検体を4 mLの2.5%グルタルアルデヒドに移し、処理まで4°Cに保ちます。
9. 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を5分間、2%四酸化オスミウムを1時間および50分間、dH₂Oを5分間、50%エタノールを15分間、70%エタノールを30分間、100%エタノールを15分間(3回)、100%エタノールを30分間(3回)、100%エタノールを30分間(3回)処理します。 100%エタノールを45分、アセトンを50分、樹脂を1時間(2回)、新鮮な樹脂を一晩。すべての溶液の容量は15mLです。
10. ティッシュプロセッサーから取り出したばかりの新鮮な樹脂を埋め込みます。
    1. ポリエチレンカプセルを番号付きの紙片のあるホルダーに入れます。カプセルに新鮮な樹脂を滴下し、試料を適切なブロックに移し、ブロックを60°C(140°F)のオーブンで一晩保管します。
11. ホットプレート上に1%トルイジンブルーで半薄(500 nm)切片を染色し、最小温度設定を30秒間行い、dH₂Oですすぎ、カバースリップを置きます。
12. ここでは、Ultracutミクロトーム(UCM)を使用して、半薄切片の切片化を行います。
    1. 樹脂製の埋め込みブロックをUCMのブロックホルダーに取り付けます。次に、ブロックホルダーをUCMのステージに取り付けて締めます。
    2. 接眼レンズを使用して、シングルエッジコーティングされたかみそりの刃を使用して、サンプルの周囲に余分な樹脂を切断します。ブロックの面を台形に切ります。
    3. ブロックホルダーをステージから取り外し、UCMアームにしっかりと取り付けます。次に、ブレードホルダーをUCMステージに取り付けます。最後に、ブレードホルダーにガラスナイフを締めます。
    4. 接眼レンズとUCMが提供する光を使用して、ガラスナイフの端をゆっくりとスライドさせ、切断する樹脂ブロックの表面にできるだけ近づけます。ブレードホルダーをステージ上の所定の位置に締めます。
    5. UCMの切断厚さを500 nmに設定し、レジンブロックを75%フルフェースになるまでトリムします。
    6. ガラスナイフを新しいものに交換します。ガラスナイフのリザーバーに滅菌水を追加します。
    7. 顕微鏡スライドにケース番号をラベル付けし、スライドガラスに滅菌水を4滴ずつ垂らします。
    8. 500nmの設定のままで、ブロックから4つのセクションを切り取ります。細い鉗子を使用して、スライドガラス上の水滴の1つに一度に1つのセクションを移します。スライド上の各ドロップには、1つのセクションが含まれます。スライドをホットプレート上で最低熱設定で乾かすまで(30秒)。
13. トルイジンブルー法で染色します。水ですすぎ、カバースリップを置きます。光学顕微鏡でトルイジンブルー切片を調べます。目的の組織構造が見える場合は、極薄切片をカットします。目的の組織構造が見えない場合は、より深い切片を切断し、目的の構造が露出してトルイジンブルースライドに表示されるまで、同じ手順で染色します。
14. トルイジンブルーの切片から電子顕微鏡の所望の領域が特定されたら、銅グリッド上の極薄切片を切断します。ウルトラミクロトームを使用して極薄スライスをカットします(TEMで見る予定のサンプルは、非常に薄いスライス(80 nm)にカットする必要があります)。
    1. 樹脂製の埋め込みブロックをUCMのブロックホルダーに取り付けます。次に、ブロックホルダーをUCMのステージに取り付けて締めます。
    2. 接眼レンズを使用して、片刃コーティングされたカミソリの刃を使用して、電子顕微鏡用の目的の領域の周りで樹脂を切断します。ブロックの面を1mm四方以下の空中ブランコの形に切ります。光のまぶしさのために電子顕微鏡の目的の領域を見るのが難しい場合は、クロロホルムを軽くたたくを使用して、樹脂ブロック内の構造を強調します。
    3. ブロックホルダーをステージから取り外し、UCMアームにしっかりと取り付けます。次に、ブレードホルダーをUCMステージに取り付けます。最後に、ブレードホルダーにダイヤモンドナイフを締めます。
    4. 接眼レンズとUCMが提供する光を使用して、ダイヤモンドナイフの端をゆっくりとスライドさせ、カットする樹脂ブロックの表面にできるだけ近づけます。ブレードホルダーをステージ上の所定の位置に締めます。
    5. UCMのネジを使用して、ダイヤモンドナイフのさまざまな角度を調整します。ダイヤモンドナイフの端が、カットするブロックの表面とできるだけ完全に揃っていることを確認してください。ダイヤモンドナイフのリザーバーに滅菌水を入れます。
    6. UCMを厚さ80nm、速度1mm/sに設定します。ここでは、自動化機能を使って極薄切片化を行います。UCM(ブロックの面の上部と下部)に切断のウィンドウを設定します。
    7. UCMの スタート ボタンを押して、セクショニングを開始します。切片はダイヤモンドナイフの滅菌リザーバーに浮かびます。
    8. 十分な切片が切断されたら、クロロホルムフュームを使用して切片をまっすぐにします。綿棒をクロロホルムに浸し、セクションに触れずにセクションの上に渡します。
15. 銅グリッドを100%アルコールに浸し、次に細い鉗子を使用して滅菌水に浸します。使用する前に各グリッドを清掃してください。いくつかのグリッド上のセクションを選択します。
16. ラベル付きの濾紙にセクションがあるグリッドを残します。この濾紙をペトリ皿に入れ、60°Cのオーブンに30分間入れて、切片をグリッド上で乾燥させます。
17. その後、造影剤染色を行います。
    1. グリッドを酢酸ウラニルまたは環境に優しい代替物で1分間染色します。次に、注射用の滅菌水ですすいでください(酢酸ウラニルとクエン酸鉛の後、すすぎごとに4つの異なる水容器に40回浸します)。クエン酸鉛のステップも1分です。
18. グリッドをTEMに挿入すると、高電圧の電子ビームがカソードから放出され、磁気レンズによって生成されるようになります。薄い(電子半透明の)試料を部分的に透過したビームは、スクリーン上のTEM情報を形成します(下記参照)。

2.標本をスキャンして撮影するためのTEMプロトコル

1. グリッド上の切片を染色した後、電子顕微鏡でスクリーニングします。電子顕微鏡では、ACC電圧をオンにして、使用する電子顕微鏡によって異なりますが、事前に設定された設定(200〜300 kV)にします。
2. パソコンでデジタルカメラソフトの電源を入れ、ケース番号を入力します。顕微鏡写真は対応するケースファイルに保存されるため、これは重要です。
3. 電子顕微鏡にグリッドをロードし、ガンサンプルを半分引き出し、スイッチを AIR に切り替えて、試料ガンチャンバーからの真空が周囲(室内)の空気で満たされるようにします。
4. 空気がいっぱいになったら、ガンサンプルを引き出します。ガンサンプルを設計されたホルダーに置きます。次に、銃の先端にあるグリッドホルダーをめくって開きます。
5. グリッドを所定の位置に配置します。グリッドホルダーを閉じ、グリッドが固定されていることを確認します。
6. ガンサンプルを途中で試料チャンバーに戻し、 スイッチをEVAC に切り替えて試料チャンバー内に真空を作ります。
7. 緑色のライトインジケーターは、試料チャンバー内で真空度に達すると点灯します。次に、ガンサンプルを電子顕微鏡カラムに慎重に押し込み、速すぎないようにします。そうしないと、銃のサンプルの先端にあるオブジェクトが損傷します。
8. グリッドが電子顕微鏡カラムにしっかりと配置されたら、フィラメントを中間(事前に確立された)飽和設定にオンにします。
9. ON / OFFスイッチでカメラの電源を入れます。コンピューターで、イメージングソフトウェアの[ライブイメージ]をクリックします。
10. 電子顕微鏡で、 低倍率 ボタンを押して対物レンズの絞りを開きます。これにより、目的のスクリーニングエリアを選択することができます。次に、電子顕微鏡のカラムの両側にある2つのコントローラーを使用して、セクションの目的の領域をコンピューター画面の中央に配置します。
11. 電子顕微鏡で、 ズーム ボタンを押して対物レンズの絞りを閉じ、コントラストを向上させます。
12. 切片のスクリーニングは、倍率2,500倍の顕微鏡写真を撮影して開始します。次に、電子顕微鏡のウォブラーボタンと明るさボタンを使用してピントを調整し、顕微鏡写真の品質を確保します。
13. コンピュータ上の 「最終画像」をクリックして、顕微鏡写真を撮影します。色が均一でない場合は、カメラソフトウェアで背景補正を行ってください。また、マイクロフォトを保存する前に、ソフトウェアを使用して最終画像のコントラストを調整してください。
14. 顕微鏡写真を保存するときは、ケース番号と倍率を再確認して、撮影した顕微鏡写真が適切に識別されていることを確認してください。
    注:場合によっては、ユーザーは追加のキャプションを入力することもでき、電子顕微鏡技術者のイニシャルも入力されます。
15. スクリーニングする切片の全領域で顕微鏡写真プロセスを実行します。十分な2,500倍の倍率の後、顕微鏡写真は対象領域をカバーするために保存され、4,000倍および8,000倍の倍率の顕微鏡写真を撮影し、適切なケース番号の識別とともにコンピューターに保存します。
16. 非常に具体的なスクリーニング指示が与えられた場合は、特定の超微細構造の詳細についてセクションをクローズアップします。次に、特定の超微細構造の詳細の測定値をコンピューターに保存し、必要に応じてより高い倍率を考慮します。
17. 検体スクリーニングが完了したら、フィラメント、カメラ、高電圧、カメラソフトウェアを順番にオフにします。次に、電子顕微鏡カラムからグリッドを取り外し、ガンサンプルチャンバー内に空気を入れます。
18. グリッドをゼラチンカプセルにファイルし、同じケースの樹脂ブロックと一緒に、適切にラベル付けされたボックスにカプセルを保管します。ガンサンプルをガンチャンバーに戻し、使用した材料を保存するために、涼しく乾燥した環境に保管します。
19. デジタルマイクロ写真を一般的なコラボレーションプラットフォーム(SharePointなど)または内部サーバーに転送して、病理医がそれらを表示できるようにします。
20. ラボラトリー情報システム (LIS) にワークユニットを入力します。
21. より具体的な顕微鏡写真が必要な場合は、フィールドグリッドを引き出し、追加のスクリーニングや特定の質問に再利用します。

結果

神経芽腫の特徴的なTEMの特徴がここに表示されます。ここでは、神経芽腫の特徴的なTEMの特徴を説明します。

神経芽腫は、乳児期および小児期に最もよくみられる固形悪性腫瘍の1つです。神経芽細胞腫細胞は、この固形腫瘍の悪性細胞であり、原始神経堤の誘導体から潜行性に発生します。この組織形成は、この青い腫瘍のいくつかの生化学的および形態学的特徴を説明しています。しかし、神経芽腫の決定論的な細胞病理学的および組織病理学的特徴は、分化の程度によって特異的に変動する可能性があります。そのため、その診断や鑑別診断が難しい場合があります。神経芽腫と神経節細胞様要素との区別は、細胞質プロセスの進行と核像の変化に伴って細胞質の量が増加することによって示されます(図1A-D)。核の拡大と可視の核小体は、神経芽細胞腫の分化の特徴です。シュワン細胞様要素への分化も注目されるかもしれません。電子顕微鏡による調査により、神経分泌顆粒(平均直径100nm)が、微小管と細い中間フィラメント<...

ディスカッション

このナラティブレビューと関連するプロトコルでは、神経芽腫の特徴的な超微細構造の特徴を強調しました。最終的に、電子顕微鏡は「死んだ」または古い技術からはほど遠いことを示唆し、シングルセルオミクス技術と組み合わせることで新たな役割の発見を仮定しています。この寄稿は、小児病理学における電子顕微鏡の古くない役割を強調したいと思います^4,27。重要な手順、手法の変更とトラブルシューティング、および制限事項については、以下で詳しく説明します。

このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。まず、電子顕微鏡のためには、必要な領域をカットすることが不可欠です。ひし形のエッジは、ブロックの面にできるだけ近づくように調整する必要があります。これには非常に安定した手が必要です。銅グリッドでフローティングセクションを拾うときは注意が必要です。

この手法の変更とト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトン、ACS試薬	電子顕微鏡科学	10014	化学会によって確立された試薬(ACS試薬)。
自動組織処理装置	電子顕微鏡科学	L12600	LYNX II 組織学および顕微鏡検査用の自動組織処理装置。
デジタルカメラソフト	Gatan	L12600	デジタルマイクログラフ
Spurr's 樹脂	Electron Microscopy Sciences	14300	Embedding resin.組織の埋め込みや迅速な浸潤に優れた浸透性を発揮します。ブロックは優れたトリミングと切片化の品質を備えていますが、薄い切片は電子ビームの下で強靭な品質を示します。
エチルアルコール	電子顕微鏡科学	15058	100%エチルアルコールとモレキュラーシーブ、50%と70%。
グルタルアルデヒド、血清バイアル	電子顕微鏡科学	16214	0.1 Mカコジル酸緩衝液中の2.5%グルテアルデヒド、pH 7.2-7.4、25%グルテルアルデヒド、TEM組織標本の一次固定剤
四酸化オスミウム	電子顕微鏡科学	19110	TEM組織処理中の第2固定剤 蒸留水中のOsO4として使用
ポリエチレンカプセル	電子顕微鏡科学	70021	平底埋め込みカプセル、サイズ00
シンチレータ	電子顕微鏡科学	82010	フィリップクワッド検出器
シングルエッジカミソリブレード	Electron Microscopy Sciences	71952-10	Clean Rm., 10/Disp.
ナトリウムカコジル酸緩衝液	電子顕微鏡科学	11655	ナトリウムカコジル酸緩衝液、0.4M、pH 7.2、ナトリウムカコジル酸三水和
物タンニン酸、試薬、A.C.S.、EMグレード	電子顕微鏡科学	21700	アメリカ化学会(ACS試薬)によって確立された試薬。
透過型電子顕微鏡 (1)	日立	7100	HV75設定で使用
透過型電子顕微鏡 (2)	JEOL	JEM-1010	HV38設定で使用
トルエン	電子顕微鏡科学	22030	アメリカ化学会設立試薬 (ACS試薬)
ウルトラカットミクロトーム	ライカ	11865766	Ultramicrotome
酢酸ウラニル	Electron Microscopy Sciences	22400	Uranyless, alternative for uranyl acetate