唾液と転位サンプルプーリングを利用した大規模SARS-CoV-2検査

Summary

このプロトコルは、SARS-CoV-2の大規模な検査を検討している大学やその他の組織、または将来のウイルス発生に対する準備計画を策定するための青写真として機能することを目的としています。

Abstract

感染者の特定と隔離、および濃厚接触者の隔離は、COVID-19の蔓延を遅らせるために重要です。COVID-19の無症候性キャリアに対するサーベイランスまたはスクリーニング能力での大規模な検査は、ウイルスの拡散に関するデータと、アウトブレイクが疑われる個人を迅速に検査するフォローアップ能力の両方を提供します。ミシガン州立大学のCOVID-19早期発見プログラムは、2020年秋からサーベイランスまたはスクリーニングの能力で大規模な検査を活用しています。ここで採用された方法は、唾液の信頼性、大量のサンプル、自己収集の利点を活用し、費用対効果の高い試薬保存型の2次元プーリングスキームと組み合わせています。このプロセスは、供給不足に適応できるように設計されており、キットの多くのコンポーネントとアッセイを簡単に置き換えることができます。SARS-CoV-2サンプルの収集と処理について概説したプロセスは、唾液中に確実に発現する将来のウイルス性病原体の試験に適合させることができます。この青写真を大学やその他の組織に提供することで、将来のウイルス発生に対する準備計画を策定することができます。

Introduction

SARS-CoV-2ウイルスによって引き起こされたCOVID-19のパンデミックは、これまでに620万人以上が死亡し、その数は日々増加しています¹。SARS-CoV-2の検査のゴールドスタンダードは、ヌクレオカプシド、エンベロープ、スパイク、RNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子2などのウイルスゲノムを標的とするように設計されたプライマーを使用した定量的リアルタイム(RT-q)PCR^です。パンデミックが始まった当初は、SARS-CoV-2の検査能力が著しく不足していました。これは、検証済みのアッセイ、検査コンポーネント、臨床担当者の不足、およびパンデミックレベルの大量検査に対応するために急速に拡大する準備ができていないインフラストラクチャから生じました。検査不足のため、検査センターでは、検査を受けるためには医師の紹介が必要になることがよくありました。これらの不足により、検査の承認が遅れたり、不快な鼻咽頭サンプル採取のための長い列ができたり、結果が出るまでの待ち時間が長くなったりしました。さらに、これらの制約のために、検査の取り組みは、SARS-CoV-2を知らずに拡散する発症前、軽度、または無症状のキャリアに対応できませんでした。簡単にアクセスできる広範な検査の欠如が、COVID-19の制御不能な蔓延の一因となった可能性があります。

大規模なインターバルテストは、サーベイランスまたはスクリーニングとして実行できます。どちらも、高密度または高リスクの感染地域での地域の陽性率を監視するために使用でき、公衆衛生上の意思決定に利用できます。サーベイランス検査は、集団における疾患の発生率と有病率を監視することを目的としており、個々の診断には使用されません³。サーベイランスの結果は通常、匿名化され、参加者に返されません。サーベイランス試験を実施する試験所は、臨床的に認定されている必要はなく、FDA認定のアッセイを使用する必要もありません。スクリーニングでは、結果を個々の参加者に返すことができますが、米国のスクリーニング検査室は、Clinical Laboratory Improvement Amendments(CLIA)証明書を取得し、該当するすべてのCLIA要件を満たしている必要があります。

ミシガン州立大学(MSU)の早期検出プログラムは2020年9月に開始され、350,000を超えるサンプルを処理してきました。このプログラムは、需要の高い検査用品^4,5,6,7,8を必要としない高感度SARS-CoV-2アッセイを設計するための研究グループの努力から生まれました。その目的は、臨床検査室が供給不足に対応するための能力増強と柔軟なプロセスの開発を支援するとともに、MSU College of Human Medicineの職場復帰計画を確立するためのスクリーニング戦略を開発することでした。最初の取り組みは、SARS-CoV-2の代替収集、抽出、および定量方法に焦点を当てていました。鼻咽頭スワブの高い需要とその後の不足により、頬スワブで収集された前鼻腔サンプルの評価が行われ、試薬の不足により^{、中国の武}漢からの初期の報告から適応したサンプル抽出方法が開発されました9。前鼻孔サンプル中のSARS-CoV-2の検出感度を高めるために、RT-qPCRの代わりに液滴デジタルPCRを使用しました^6,7。Droplet Digital PCRは感度が高く、エンドポイントの読み出しで絶対値を提供できますが、この技術には信頼性の高いハイスループット機器がないため、大規模なテストには使用できないと判断されました。さらに、ヒトRNase Pのレベルに基づく前鼻孔サンプルの自己収集は非常に変動し、質量試験に十分な信頼性がないことが示唆されました。

鼻咽頭スワブと前鼻腔スワブに代わるものは、唾液のコレクションです。SARS-CoV、H1N1、MERSなどの呼吸器系ウイルスは、歴史的にすべて唾液中に検出されました10,11,12,13。これはその後、SARS-CoV-2 ^14,15,16,17に当てはまることが証明されました。唾液サンプルと鼻咽頭サンプルを直接比較すると、一致したサンプルでは、唾液は鼻咽頭スワブよりも高いウイルス力価をもたらし、サンプル収集を繰り返すと唾液の変動が少ないことが示されました¹⁴。また、オミクロン株などの特定の変異株では、デルタ¹⁶に比べて唾液がより敏感であることが報告されています。唾液採取のその他の利点は、需要の高い供給なしでオフサイトでの自己採取が比較的容易であること、必要に応じてサンプルを繰り返し再検査できること、サンプル採取のためのオンサイトの人員配置要件の排除、ウイルス感染の可能性を高める可能性のある参加者の待ち行列の回避です。ラボで組み立てられた唾液キットは、ラボアッセイの開発者、パッケージング学部の専門家、大学のブランディング専門家、安全担当者、およびボックスとラベリングシステムを製造した外部の製造パートナーのコラボレーションとして開発されました。

唾液サンプルは十分な遺伝的出発物質を提供し、RT-qPCRは高感度で信頼性の高い結果を提供しますが、試薬(プライマー/プローブおよびマスターミックス)のコストにより、個々のサンプルの大規模なテストは、サンプルごとに個別に費用のかかる作業となっていました。プライマー/プローブとマスターミックスはプロセスの中で最も高価な成分であるため、目標は、その使用を広げ、サンプルあたりのコストを削減するソリューションを探すことでした。SARS-CoV-2 検査では、コミュニティでの発生率とアッセイ感度に基づいてサンプルプールサイズを体系的に最適化することが提案されています¹⁸。しかし、あらゆる規模のプールでSARS-CoV-2の存在が示された場合、プール内のすべての参加者を再検査する必要があるため、時間が失われ、感染拡大の機会が増えます。これらの制限に対処するために、Zilinskasらによって提案されたプロセス¹⁹ のように、監視テストの制限の下で最初のパスを実施するために、2次元プーリング方法が採用されました。このプロセスでは、96個の個々のサンプルを12列8行からなる96ウェルプレートに入れます。各サンプルは、2つの異なる反応プレート上の8つのプールと12のプールに含まれています。これにより、すべてのサンプルが 2 つのプールで一意に表されます。座標に基づくプールのデコンボリューションにより、陽性の可能性のあるサンプルが特定されます。SARS-CoV-2が検出されなかったプール内のサンプルは、サーベイランス検査からスクリーニングに移行しません。一方、サーベイランスプロセスで陽性と判定された個人からのサンプルは、CLIAが承認したスクリーニングプロセスを通じて再抽出されます。陽性と確認された場合は、結果が通知され、大学の医師のオフィスに紹介され、接触者追跡が開始され、保健部門に通知されます。合計で、個々のサンプルは、陽性と宣言される前に3つの別々の反応でテストされ、2回は監視プールで、1回は1つの確認スクリーニングとしてテストされ、偽陽性の可能性を減らします。サンプルプーリングは、サンプルを個別に分析するよりも試薬の使用量が~80%少なく、サンプルあたり~$12のコストがかかります。

唾液キット、プーリング戦略、アッセイ開発プロセスに加えて、キットの配布、サンプルの収集、結果の報告に関するロジスティクス計画も策定しました。プログラムの参加者は、キットを受け取り、チューブに一意の英数字コードを登録し、サンプルを生成して、多くのドロップオフビンの1つに預け、毎日ピックアップしてラボに運びます。ラボではサンプルを処理し、テクニカルスーパーバイザーは結果をレビューしてアップロードし、参加者には結果ポータルで確認するように通知されます。このプロセスのターンアラウンドタイムは、サンプルが堆積してから24〜48時間です。このハイブリッドなサーベイランスとスクリーニングのプロセスを大規模に成功させるには、施設のあらゆる部門からの協力が鍵となりました。必要なテストプログラムとインフラストラクチャの次の手順と説明は、将来の監視および/またはスクリーニングの目的でテストをスケールアップする方法の青写真として意図されています。

Protocol

早期発見プログラムの方法を最適化するために実施された研究は、ミシガン州立大学の治験審査委員会によって承認されました。すべての図は人為的なサンプルで再現されており、観察された人間の結果を代表しています。原稿に示されているデータ、情報、または結果は、ミシガン州立大学の早期検出プログラムの参加者からのものではありません。

1.キット製作

注意:キットの組み立て中は、キットコンポーネントの汚染を防ぐために、常にマスク、手袋、目の保護具、および白衣を着用してください。

1. キットコンポーネントの準備
   1. 油性マーカーを使用して、25mLのコニカルチューブに1mLを示す線を引きます。油性マーカーを使用して、トランスファーピペットに1 mLを示す線を引きます。
   2. 5 mLのサンプルチューブに4つのセラミックビーズを加えます。1 mLのRNA安定化溶液をサンプルチューブにピペットで入れ、チューブを閉じます。固有の識別コードからなるバーベルステッカーをサンプルチューブに貼り付け、上部にデータマトリックスバーコード、側面に英数字コードで繰り返される識別子を貼り付けます。
      注:セラミックビーズはRNase / DNaseを含まないため、さらに滅菌する必要はありません。
2. 25 mLのコニカルチューブ、5 mLのサンプルチューブ、トランスファーピペット、および小さなバイオハザードバッグをキットボックスに入れます(補足図1)。
   注:コニカルチューブはDNase / RNaseフリーである必要はありません。サンプルの完全性は、RNA安定化溶液によって保持されます。

2.自己サンプル収集のためのキットの使用

1. キットの指示に従って、サンプルを提供する30分前に参加者に飲食しないように依頼してください。参加者に、1 mL の唾液が採取されるまで 25 mL のコニカル チューブに唾を吐き込むように依頼します (マークされた線)。
2. ピペットを使用して、1 mLの唾液(マークされた線まで)を、RNA安定化溶液とセラミックビーズが入った5 mLのサンプルチューブに移します。サンプルチューブを閉じて15秒間振とうします。
3. サンプルに割り当てられた英数字コードを指定のWebサイトに登録してもらいます。完了したら、サンプルチューブを小さなバイオハザードバッグに入れ、収集ビンに入れるように依頼します。

3. RNA単離のためのサンプル摂取と調製

注:すべてのステップは、バイオコンテインメント蓋付きのバイオセーフティキャビネットまたは遠心分離機のバケツで行われます。

1. バイオハザードバッグに入れたまま、品質管理のためにサンプルを消毒し、目視検査します。
2. サンプルを拒否する(図1):サンプルが非天然色(つまり、緑、青)であるか、食品粒子や血液が含まれている。サンプルが漏れているか、ビーズが欠落しています。サンプルの予想容量が正しくありません (<1.5 mL または >3 mL)。サンプルにはバーコードや英数字のコードが添付されていません。
   1. サンプルが拒否された場合は、サンプルをスキャンして拒否ファイルに記録し、サンプルが拒否された理由をメモします。識別子がないためにサンプルが拒否された場合は、拒否ファイルにサンプルをバーコードなしとして記録します。
3. 検体が不合格でない場合は、バイオハザードバッグをハサミで切り開き、検体チューブを取り出します。チューブを15秒間ボルテックスし、サンプルチューブをスイングバケット遠心分離機用のチューブアダプターに入れます。
4. チューブアダプターがいっぱいになったら、バイオコンテインメントの蓋を遠心分離機のバケツに固定し、遠心分離機に移します。4,100 x g で2分間サンプルを遠心分離し、サンプルをバイオセーフティキャビネットに戻します。
   注:遠心分離は、破片をペレット化し、唾液中のより粘性の高い物質をチューブの底に押し込むために使用されます。これにより、プロセスでプロテイナーゼKが不要になります。フルランは 768 サンプル(RNA 単離後のサンプルで満たされた 8 枚の 96 ウェルプレート)で構成されます。
5. ペレット化された材料を乱すことなく、サンプルチューブを、ラック番号(1-8)、日付、およびサンプルがプール/評価される対応するグループ(グループを示す識別子、つまりグループAがその日の最初の実行である)を含む実行IDで事前にラベル付けされた96スロットチューブラックに移します。
6. 96スロットのチューブラックがいっぱいになるか、サンプルが残っていない場合は、ハンドヘルドバーコードスキャナーを使用してチューブをプレートマップファイル(満杯のプールの場合は補足ファイル1 ; Supplementary File 2 for half size pools) を参照してください。バーコードが機能しない場合は、チューブの英数字コードを使用してサンプルを記録します。
   注意: 隣接するバーコードのスキャンを防ぐために、マスクが必要です。マスクは、不透明な紙に穴を開けてラミネートすることで作ることができます。プレートマップファイルにスキャンされたバーコードは、96スロットラックと同じ向きで表示されます。
7. ラック内のサンプルチューブに70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。
   注意: チューブを軽くたたくのではなく拭くと、バーコードが損傷する可能性があります。
8. ウェル容量が 2 mL の 96 ディープウェルプレートに Run ID を標識し、各サンプルチューブから 200 μL の唾液サンプルを 96 ディープウェルプレートの対応するウェルに移します。サンプルが粘性が高すぎて移し替えられない場合は、ボルテックスして再度遠心分離します。問題が残っている場合はサンプルを拒否します。
   注:唾液サンプルは糸状になり、技術者が注意しないと、転送中にプレート全体にカタツムリの跡を残す可能性があります。これにより、最初の誤検知が発生し、最終的に確認ステップで再実行する必要があるサンプルが増える可能性があります(セクション6を参照)。
9. すべてのサンプルを移し替えたら、96ディープウェルプレートをシリコンマットで覆い、室温で保存します。96スロットのラックを残りのサンプルとともに保存して保管し、陽性の可能性のあるサンプルを確認します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。

4. RNA単離

1. 96ウェルRNAアイソレーションカートリッジにRun IDをラベル付けし、空のコレクションプレートの上に置きます。
   注:この時点で、サンプルを含むプレートをバイオセーフティキャビネットから取り外すことができます。
2. 96ディープウェルプレートからシリコンマットをはがします。400 μLのウイルスローディングバッファーを96ディープウェルプレートの各ウェルに移します。
3. 各サンプルを2〜4回ピペッティングで静かに上下させて混合し、サンプル全体を96ウェルRNA分離カートリッジの対応するカラムに移します。
   注:大量に混合すると気泡が発生し、無計画に実行すると隣接するウェルの汚染につながる可能性があります。意図的に混合することで、このリスクを軽減し、下流の処理の完全性を保護できます。
4. コレクションプレートの上部にあるRNA分離カートリッジを4,100 x g で10分間遠心分離し、サンプルをカートリッジにロードします。RNA分離カートリッジを清潔な収集プレートに移します。
5. 500 μLの洗浄バッファーをRNAアイソレーションカートリッジの各ウェルに加え、4,100 x g で5分間遠心分離します。RNA分離カートリッジを清潔なコレクションプレートに移します。
6. 500 μLの洗浄バッファーをRNAアイソレーションカートリッジの各ウェルに加え、4,100 x g で5分間遠心分離します。RNA分離カートリッジを清潔なコレクションプレートに移します。
7. RNA分離カートリッジの各ウェルに500 μLの100%エタノールを加え、4,100 x g で5分間遠心分離します。RNA分離カートリッジを清潔なコレクションプレートに移します。
   注:この時点でサンプルがカラムを完全に通過していない場合は、サンプルの粘性が高すぎるか、サンプル中の小さな破片がカラムを詰まらせています。サンプルは、下流のプーリングプロセスを汚染しないようにカートリッジから完全に除去し、サンプル番号をリジェクションファイルに追加する必要があります。
8. コレクションプレートの上部にあるRNA分離カートリッジを4,100 x g で5分間遠心分離し、カラムを乾燥させます。RNAアイソレーションカートリッジをRun IDと単語rowでラベル付けした清浄な溶出プレートに移し、両方を清浄な収集プレートの上に置きます。
9. 25 μL の DNase/RNase フリー分子グレードの水を RNA アイソレーションカートリッジの各ウェルに加えます。4,100 x g で10分間遠心分離し、RNAを溶出します。サンプルが完全に溶出しない場合は、サンプルを5分間再遠心分離します。
10. 溶出プレートを予め冷却したコールドプレートに移し、蓋をします。すぐにサンプルプーリングとRT-qPCRに進みます。

5. サンプルプーリングとRT-qPCR

注:このプロセスは、2プレートシステム( 図2を参照)で設定されます。溶出RNAプレート番号は、作製カラムプレート番号とロープレートレター(A=1、B=2、C=3など)に対応します。デコンボリューションの目的で、カラムプレートの行文字はRNA溶出プレートの行文字に対応し、行プレートの列番号はRNA溶出プレートの列番号に対応します。例えば、RNAプレート#6のC4位のサンプルは、列反応プレート位置F4とカラム反応プレート位置C6にあります。

1. 新しい溶出プレートにRun IDと単語rowをラベル付けし、事前に冷却したコールドプレートに置きます。10 μL の RNA を、行溶出プレート上の各ウェルからカラム溶出プレート上の対応する行に移し、元の溶出プレートのコピーを作成します (図 2)。
   注:列とマークされた溶出プレートは列方向にプールされ、行とマークされた溶出プレートは行方向にプールされます。
2. カラムプールプレートの場合、プレートを横切る各ウェルの全ボリュームを、ランIDプレート番号に対応するカラム番号に移します。列プールプレートの場合、各ウェルからプレートを上下に全ボリュームを、ランIDプレート番号に対応する行番号に移します(1 = A、2 = Bなど; 図 2)。
3. プールした各サンプル13 μLを、96ウェル反応プレートの対応する列または行に移します(図2)。
4. このプロトコルでは、ヌクレオカプシド(N)、ORF1ab、およびスパイク(S)遺伝子に対する3つのプローブを使用してSARS-CoV-2を検出し、MS2ファージを標的とする4番目のプライマープローブを内部コントロールとして使用します。プールしたサンプルで、MS2ファージポジティブコントロールをマスターミックスにスパイクします。サンプルを個別に分析する場合は、MS2ファージをRNA分離カートリッジ上のサンプルにスパイクし、抽出コントロールとして使用します。
   注:マスターミックス、プライマープローブ、蛍光色素、およびクエンチャーは、アッセイによって異なります。適切な比率と蛍光チャネルは、各ラボで決定する必要があります。
5. 2 μL のポジティブコントロール溶液と 11 μL の DNase/RNase-free 分子グレードの水を反応プレート上のポジティブコントロールウェルに添加して、ポジティブコントロールを準備します(図 2)。
6. 13 μLのDNase/RNaseフリー分子グレードの水を反応プレート上のネガティブコントロールウェルに添加して、テンプレートなしコントロールを調製します。
7. メーカーの指示に従ってマスターミックスを作成し、MS2ファージポジティブコントロールをスパイクします。7 μLのマスターミックスを、サンプルまたはコントロールを含む96ウェル反応プレートの各ウェルに分注します。蛍光灯への曝露を制限します。
8. 反応プレートを光学フィルムとボルテックスで2分間覆い、サンプルをよく混合します。反応プレートを650 x g で5分間遠心分離します。
9. プレートをRT-PCRシステムに移し、マスターミックスに適したサイクリングパラメータで実行します。ここで使用したマスターミックスについては、25°Cで2分間、53°Cで10分間、95°Cで2分間、95°Cで3秒間の40サイクル、60°Cで3秒間のサイクルを実行しました。
10. サンプルを実行したら、プールのデコンボリューションを実行して、陽性の可能性のあるサンプルを手動で(図3)またはR Script Shinyアプリ を使用して 特定します。
    1. カラムおよびローリアクションプレートから結果をスプレッドシートファイルとしてエクスポートします。プール デコンボリューション R スクリプト Shiny アプリを開きます (ソース コードは https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP で入手できます)。
    2. プレート マップ、列、行のファイルをアプリにドラッグ アンド ドロップして、アプリを実行します。アプリから作成したリストを保存します。
       注:アプリから生成されたリストには、プレートマップに入力されたすべてのバーコードと、プールデコンボリューションスクリプトに基づいてそれらが正か陰性かが含まれています。陽性の可能性があるとフラグが付けられたこれらのサンプルは、個別に再処理されます。

6. 陽性サンプルの検証

1. 試験が必要なサンプルごとに、2本の1.5 mL微量遠心チューブとRNA抽出カラムを標識します。1本の微量遠心チューブはサンプル、MS2ファージ、およびウイルスローディングバッファーの混合に使用し、2本目の微量遠心チューブはRNA溶出ステップに使用します。
2. 5 μLのMS2 Phage RNAを1.5 mLの微量遠心チューブに加えます。陽性の可能性のあるサンプル200μLをチューブに移し、400μLのウイルスローディングバッファーをチューブに加え、ピペッティングで混合します。
3. 清浄な収集チューブ内の標識済みRNA抽出カラムに全内容物を移します。10,000 x g で2分間遠心分離します。吸引液は収集チューブから流れます。
4. 500 μLの洗浄バッファーをRNA抽出カラムに加え、10,000 x g で2分間遠心分離します。吸引液は収集チューブから流れます。
5. 500 μLの洗浄バッファーをRNA抽出カラムに加え、10,000 x g で2分間遠心分離します。吸引液は収集チューブから流れます。
6. 100%エタノール500 μLをRNA抽出カラムに加え、10,000 x g で1分間遠心分離します。RNA抽出カラムを清潔な収集チューブに移し、10,000 x g で1分間遠心分離してカラムを乾燥させます。
7. RNA抽出カラムを標識済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、溶出します。25 μL の DNase/RNase フリー分子グレードの水を RNA 抽出カラムに加えます。10,000 x g で2分間遠心分離し、RNAを回収し、チューブを湿った氷に移します。
8. メーカーの指示に従ってマスターミックスを作ります。7 μLのマスターミックスを、サンプルを含む96ウェル反応プレートの各ウェルに分注します。単離された各RNA13 μLを反応プレートに移します。
   注:マスターミックスは、プールされたサンプルプロトコルで使用されているものと同じですが、MS2ファージRNAスパイクは含まれていません。
9. 2 μL のポジティブコントロール溶液と 11 μL の DNase/RNase フリー分子グレード水を反応プレート上のポジティブコントロールウェルに添加して、ポジティブコントロールを調製します。13 μLのDNase/RNaseフリー分子グレードの水を反応プレート上のネガティブコントロールウェルに添加して、テンプレートなしコントロールを調製します。
10. 反応プレートを光学フィルムで覆い、2分間ボルテックスしてサンプルをよく混合します。反応プレートを650 x g で5分間遠心分離します。プレートをRT-PCRシステムに移し、マスターミックスに適したサイクリングパラメータで実行します。
    1. ここに記載されているマスターミックスでは、25°Cで2分間、53°Cで10分間、95°Cで2分間、95°Cで3秒間、60°Cで30秒間のサイクルを繰り返します。

Results

これまでにラボが受け取ったサンプルの大部分は受け入れられ、最初の視覚的品質管理ステップに合格しました。サンプルを拒否する必要性は、サンプルの処理やサンプルの全体的な結果に悪影響を与える可能性のある理由に限定されます。具体的には、チューブ内の容量の誤り、粘稠度、または唾液に不自然な色、サンプルの均質化を支援するために使用されるセラミックビーズの欠如、バーコードの欠落などが、サンプルを拒否する理由です(図1)。

また、採取ビン内でサンプルが屋外の要素にさらされていることを説明するために、サンプル条件も調べました。選択したRNA安定化溶液は、熱サイクルと凍結融解サイクルに長時間さらされて試験されました。RNaseの非存在下で作製したSARS-CoV-2 RNAサンプルをさまざまな温度に曝露した後、RT-qPCR用に処理しました。RNA安定化溶液では、37°Cで1週間保存したサンプルは、RT、4°C、または-20°Cで保存したサンプルと比較して、どのプローブを調べたかによってCt値が1〜3単位高いことを示しました(...

Discussion

サンプル処理中、細心の注意が必要なステップがあります。サンプルの量、一貫性、色、および追加されたビーズの存在を調べる最初の品質管理ステップは、プロセスの全体的な成功にとって重要です。正しい量の唾液が含まれていないサンプルのチューブは、唾液が少なすぎると十分な遺伝物質がなくなるため、偽陰性を引き起こす可能性があります。逆に、唾液が多すぎると、RNAバッファーと正しい比率にならず、RNAの分解が発生する可能性があります。まれに、個々のバイオハザードバッグに液体が存在し、サンプルチューブが不適切に閉じられ、サンプルが漏れたことを示しています。これらのサンプルは、チューブの取り扱いに起因する潜在的な交差汚染を排除するために、リジェクションプロセスの対象となりました。サンプルの非定型の一貫性と色も、問題を予測できます。食品の塊や非天然色のサンプルは、サンプルが収集される前に食べ物や飲み物が消費された可能性があることを示唆しています。これにより、口を洗い流した後の唾液からの信号が低くなったり、RNAを分解したり、RNA抽出が問題となる可能性のある物質が導入されたりして、偽陰性が発生...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ステップMM、ROXサー	モフィ	ッシャーA28523
1.2 mlディープウェルプレート	フィ	ッシャーAB0564
100 mL試薬リザーバー	コーニング	4872
2.8 mmセラミックビーズ	OMNI	19-646
25 ml円錐形スクリューキャップ付き	VWR	76338-496
50mL VボトムリザーバーCostar		4870
5430-高速遠心分離機	エッペンドルフ	22620601
5ml エッペンドルフ チューブ	フィッシャー	14282300
8 ストリップ チューブ QuantStudio	ライフ テクノロジー	4316567
ベータ メルカプトエタノール	フィッシャー	AC125472500
エタノール 200 プルーフ、分子生物学グレード	フィッシャー	BP28184
Microamp Endura Optical 96ウェル高速クリア反応プレート、バーコード	ライフテクノロジー	4483485
Microamp Fast Optical 96ウェルプレート	フィッシャー	4346906
ミニマイクロ遠心分離機	Corning Medical	6770
ストリップチューブ用光学キャップ	ライフテクノロジー	AB-1820
光学フィルム	サーモフィッシャー
PCR プレートシーリングフィルム 非光学	式 Fisher	AB-0558
PCR プレートセミスカート	Fisher	14230244
QuantStudio 3 リアルタイム PCR システム、96 ウェル、0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA Viral Kit 確認	Zymo	R1035
試薬リザーバー、100ml	DOT	229298
RNAシールド	Zymo	R1200-1L
スモールバイオハザードバッグ	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19キット	サーモフィッシャー	A47814
サーモサイエンティフィック Sorvall ST4R Plus 遠心分離機	サーモフィッシャー	75009525
トランスファーピ	ペット フィッシャー	22170404
ウイルス 96 キット	Zymo	R1041
ボルテックスミキサー	フィッシャー	2215414