コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)による脳スライスの髄鞘形成イメージングへの応用

Summary

髄鞘形成を視覚化することは、神経系を研究する多くの研究者にとって重要な目標です。CARSは、ミエリンなどの特殊な構造を照らす脳などの組織内の脂質をネイティブにイメージングできる免疫蛍光法に対応した技術です。

Abstract

コヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)は、分子の特徴的な振動のコヒーレント信号を生成するために化学者や物理学者によって古典的に採用されている技術です。ただし、これらの振動特性は、脳などの解剖学的組織内の分子にも特徴的であり、神経科学アプリケーションにますます有用で適用可能になっています。たとえば、CARSは、これらの分子内の化学結合を特異的に励起することによって脂質を測定でき、神経伝達に関与するミエリンなど、組織のさまざまな側面を定量化できます。さらに、ミエリンの定量に通常使用される他の技術と比較して、CARSは免疫蛍光技術と互換性があるように設定することもでき、ナトリウムチャネルやシナプス伝達の他の成分などの他のマーカーとの共標識を可能にします。髄鞘形成の変化は、多発性硬化症などの脱髄疾患、または脆弱X症候群や自閉症スペクトラム障害などの他の神経学的状態において本質的に重要なメカニズムであり、新たな研究分野です。結論として、CARSは革新的な方法で神経科学の差し迫った質問に答え、多くの異なる神経学的状態に関連する根本的なメカニズムの証拠を提供することができます。

Introduction

活動電位は脳内の情報の基本単位であり、軸索を介した活動電位の伝播は情報処理の1つの柱を形成します^1,2,3。ニューロンは、典型的には、複数の他のニューロンから求心性入力を受け取り、所与の狭い時間窓内でこれらの入力を統合する^4,5。したがって、軸索における潜在的な伝播のメカニズムは、研究者からかなりの注目を集めています。

軸索を伝播する場合、活動電位は軸索に沿って繰り返し再生され、信頼性の高い伝播が保証されます⁶。顎脊椎動物(グナトストーム)のほとんどのニューロンでは、軸索は、グリア細胞の一種である近くの希突起膠細胞またはシュワン細胞によって産生される脂質が豊富な物質であるミエリンの鞘に囲まれています(^7,8でレビュー)。このミエリン鞘は軸索を電気的に絶縁し、その静電容量を低減し、活動電位の伝播を効率的、迅速、そしてより低いエネルギー消費で可能にする。ミエリンは軸索を均一に覆うわけではありませんが、Ranvierの節と呼ばれる、それらの間に短いギャップがあるセグメントで軸索を覆います(^9,10でレビュー)。軸索の電気的絶縁レベルを制御する髄鞘形成の厚さと、軸索に沿って活動電位が再生される頻度を制御するランビエの節の間隔の両方が、活動電位伝播の速度に影響を与えます(¹¹でレビュー)。

髄鞘形成の厚さが軸索^12,13,14の活動電位伝播速度に影響を与えることを示唆する文献が多数ある。さらに、軸索髄鞘形成の変化は、多数のCNS欠損をもたらし得る¹⁵、16、¹⁷、^18、19、^20、21。したがって、多くの研究努力の焦点が軸索髄鞘形成の測定と特性評価を含むことは驚くべきことではありません。ミエリンの厚さの測定は、電子顕微鏡で最も一般的に行われてきましたが、これは大量の組織調製を必要とし、免疫組織化学と組み合わせて使用するのが難しい技術です。ただし、コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)に基づく軸索髄鞘形成を測定するためのより高速で簡単な技術もあります。CARSレーザは、様々な周波数に同調することができ、脂質を励起するのに適した周波数に同調すると、追加の標識²²を必要とせずにミエリンを画像化することができる。脂質画像化は、脂質をいくつかの蛍光チャネル²³と共に画像化することができるように、標準的な免疫組織化学と組み合わせることができる。CARSによる髄鞘形成のイメージングは、電子顕微鏡法よりも有意に高速であり、EMよりも低いものの、同じタイプの軸索における髄鞘形成のわずかな違いを検出するのに十分な分解能を有する。

Protocol

すべての実験は、適用されるすべての法律、国立衛生研究所のガイドラインに準拠し、コロラド大学アンシュッツ施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.動物

1. ジャクソン研究所から入手したC57BL/6J(ストック#000664)マウス(Mus musculus )またはチャールズリバーから入手したモンゴルスナネズミ(Meriones unguiculatus)を使用してください。

2.ティッシュの準備

1. 経心灌流の場合、対象となるげっ歯類種にペントバルビタール(体重120 mg / kg体重)を過剰摂取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.76 mM KH 2 PO 4、10 mM Na₂HPO4)とそれに続く₄%パラホルムアルデヒド(PFA)²⁴)を過剰に投与します。
   1. 具体的には、ハサミを使って腹部と胸郭を開き、ケリー止血鉗子で胸郭を所定の位置に保持して心臓を露出させます。
   2. 灌流ポンプに接続された23GA針を左心室に挿入し、細かいハサミを使用して右心房をすばやく切断します。
   3. 灌流ポンプと心臓の針を通してPBSを10分間投与し、脳と体の血液を取り除きます。
   4. 灌流ポンプを4%PFAに10分間切り替え、手足と尾の剛性をチェックして灌流が成功したことを確認します。
2. 灌流後、動物を斬首し、頭蓋骨から脳を取り除きます。PBSに移す前に、脳を4%PFAで一晩保管してください。脳幹を4%アガロース(PBS中)に埋め込み、厚さ200μmのビブラトームを使用して冠状にスライスします。

3.染色

1. Nisslの染色フリー浮遊切片を、細胞体を可視化するために(1:100)、抗体培地(AB培地:0.1 Mリン酸緩衝液(PB:50 mM KH₂PO₄、150 mM Na2_HPO4)、150 mM NaCl、3 mM Triton-X、1%ウシ血清アルブミン(BSA))で、標準的なラボ用シェー^カー25で室温で30分間。
   1. アルミホイルやカバーを使用して、セクションを光から保護します。550nm以下の波長はCARSイメージングと互換性があります(図1)。
      注:Triton-Xまたは他の試薬が脂質のCARSイメージングに影響を与えるとは予想していませんが、特定の抗体培地による追加のコントロールが必要になる場合があります。
2. 一時停止ポイント:イメージングするまで、フリーフローティングセクション(光から保護されている間)をPBSに保存します。切片化したら、2週間以内に脳切片を画像化します。

図1:CARSイメージングは免疫蛍光イメージングと組み合わせることができます。 グラフは、CARSイメージングが660/640nmの赤色信号スペクトル²⁶で発生することを示しています。この波長は、緑、青、またはUV範囲から十分に離れているため、CARSシグナルとこれらの範囲の免疫蛍光を組み合わせることができます。具体的には、このグラフは、この出版物の代表的な結果の収集中にCARSと組み合わされた青色蛍光色素でタグ付けされたNisslの励起と発光も示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. イメージング

注:CARSレーザーのセットアップには、80 MHzクロックを提供するファイバーレーザーと、CARS信号の収集に必要なストークスビームが1031 nmに固定された770〜990 nmの調整可能な範囲のOPO(光パラメトリック発振器)レーザーが含まれています。両方のビームに1つの開口部があります。

1. サンプルを顕微鏡に持ち込む前に、CARSレーザーの電源を入れて少なくとも1時間ウォームアップし、CARSレーザーを合わせ、ケーラーをコンデンサー光学系と顕微鏡のダイアフラムを前方CARSイメージング用に合わせます。
   注:この手順は、CARS顕微鏡が適切に機能するために重要です。
   1. 2つのレーザービーム(ポンプとストークス)の空間アライメントについては、CARSレーザーGUIを介して2つの内部PSD(位置検出検出器)にアクセスします。
   2. CARSレーザーGUIの遅延機能を使用して時間的アライメントを実現し、波長が異なるために分散が異なる2つのレーザー(ポンプとストークス)のパルスをオーバーラップするのに役立ちます。したがって、ポンプビームとストークスビームの時間的および空間的なオーバーラップは、GUIを介したユーザー入力で行われます。
   3. 外部潜望鏡(セットアップの最後の2つのミラー)を調整して、空間的に重なった2つのレーザーを顕微鏡のスキャンヘッドミラーの中央に配置します。
   4. 最良の前方CARS非デススキャン検出を行うには、コンデンサーがケーラーであることを確認してください(つまり、コンデンサーが中央に配置され、ダイアフラムに焦点を合わせて均一な照明を実現します)
2. 免疫蛍光共焦点イメージングとCARSイメージングには、蛍光イメージング用の可視レーザーを備えた共焦点顕微鏡を組み込んで、前方およびエピCARSノンデススキャン検出器(NDD)の両方を備えたCARSレーザーを装着します(図2)。
3. カバーガラス(倒立顕微鏡用)、組織が乾燥しないようにPBS、および組織をカバーガラスの近くに保つためのガラス重りを備えた培養皿に切片を置きます。
4. 台形体の内側核(MNTB)などの脳領域をイメージングするために、エピ方向のCARS信号の収集と順方向の0.55NAコンデンサーを介した60倍、1.2NAの赤外線補正水対物レンズを使用してzスタックまたは単一の画像を取得します。
   1. CARSレーザーGUIを使用して、約600mWのポンプ/プローブと300mWのストークスでCARS画像を撮影します。これらのレーザー出力値は、システムによって内部的に測定されます。サンプル位置での両レーザーの出力は25mW未満で、組織サンプルに対して安全です。
   2. ポンプとストークスビームを空間的および時間的に重ね合わせます。OPO を 797.2 nm に調整します。これにより、650nmのCARS波長が得られます。エネルギー準位が高いため、結果として基底状態に戻るのは、励起に対する反ストークス(青シフト)です。
   3. バンドパスフィルター(640-680 nm)を使用して、エピまたはフォワードノンデススキャン検出器でCARSシグナルをキャプチャし、免疫蛍光標識(この場合は蛍光標識されたNissl)を順次検出します。
      注:NisslニューロンソーママーカーはCARS 640-680 nmバンドパスフィルターに捕捉されないため、以下に示す画像で蛍光とCARSイメージングを組み合わせることができます。
   4. CARSと蛍光はPMTを共有しません。 これらの設定を使用して、脳領域の髄鞘形成を選択的に画像化するための最適な脂質シグナルを取得します。
      注意: レーザービームからユーザーを保護します
5. 画像を.oibファイルとして保存し、画像解析プログラムにインポートしてさらに定量化することができます(図3)。

図2:CARSレーザー(赤い矢印)と非デススキャン(NDD)エピおよび前方検出をレーザースキャン共焦点に組み込んだCARS機器図。 フォワードNDDでは、515 nm(オレンジ色の矢印)のC-H結合(濃い赤の矢印)とSHG(第2高調波ジェネラシオイン)のCARSを取得します。エピNDDでは、C-H結合(暗赤色矢印)と2PE(2光子放出)自家蛍光(水色矢印)のCARSを取得します。順次、蛍光共焦点画像を取得することができます(可視レーザーの場合は緑色の矢印、共焦点検出の場合は青色の矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:CARSは、脳組織(脳幹)のミエリン(マゼンタ)を照らすと同時に、Nissl(シアン)または蛍光マーカーをイメージングすることができます。2つのパネルは、モンゴルスナネズミ(単一の画像M. unguiculatus、図3A、C、E)とマウス(zスタック最大投影M.musculus、図2B、D、F)の脳からの代表的な結果を示しており、この手法が種を超えて使用できることを示しています。図3A、Bはシアンでニッスルを示し、C、DはマゼンタでCARS信号を示し、E、Fはスナネズミまたはマウスの各パネルでニッスル信号とCARS信号をそれぞれ組み合わせます。両方の画像セットは、脳幹の台形体(MNTB)の内側核のセクションを示しています。MNTBのニューロンは、巨大シナプスの一種であるHeldのyで終わる重度有髄軸索²⁷からの入力を受け取ります。スケールバーは20μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Results

他の技術に対するCARS顕微鏡の最大の利点の1つは、蛍光イメージング^{との互換性です23}。 図1 は、免疫蛍光マーカーでタグ付けされたNisslと比較したCARSスペクトルを示しており、スペクトルの重複はほとんどまたはまったくありません。 図2 は、共焦点顕微鏡と組み合わせたCARS用のレーザーセットアップを示しています。 図3 は、細胞体(シアン)とミエリンシグナル(マゼンタ)の両方を示すCARSイメージングを使用して得られる可能性のある、スナネズミとマウスからの単一のスタックとzスタックの最大投影の2つの代表的な画像を示しています。

Discussion

ますます多くの文献が脳機能におけるミエリンの役割を強調しています13,16,21,28。さらに、髄鞘形成の厚さと髄鞘形成パターンは、多発性硬化症(²⁹でレビュー)、老化(30でレビュー)、自閉症^20,31などのいくつかの神経学的状態で変化する可能性があることがわかっています。したがって、ますます多くの研究者が、脳組織および動物モデル全体、いくつかの病状、およびますます多くの実験状況で髄鞘形成を評価する必要があることは驚くべきことではありません。脳組織の髄鞘形成を画像化する従来の方法には、抗体標識とそれに続く光学顕微鏡法、および電子顕微鏡法(EM)が含まれます。どちらの技術も...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
麻酔薬:
1 mL使い捨て注射器、針付き 27 GA x 0.5"	Exel int	260040
致命的な+	Vortech
Surgery:
Spring Scissors - 8mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15024-10
標準ピンセット	ファインサイエンスツール	11027-12
Perfusion:
4% パラホルムアルデヒド	フィッシャーケミカル	SF994 (CS)
ファインハサミ - シャープ	ファインサイエンスツール	14063-11
ケリー止血剤	ファインサイエンスツール	13019-14
ミリポア H2O
ニードルチップ、23 GA x 1インチ	BD 精密グライド	305193
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS):
塩化カリウム		Sigma P9333
リン酸カリウムモノベース	Sigma	P5655
ポンプ、可変流量または同等品
塩化ナトリウム	ッシャーケミカル	s271-1
二塩基性	ナトリウムシグマ	S7907
解剖:>
50 mLバイアル、4%PFA
ボケムケミカルスプーン180mm	ボケム	230331000
ファインハサミ - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Noyes Spring Scissors	ファイン サイエンス ツール	15011-12
ファイン (Graefe) ピンセット	ファイン サイエンス ツール	11050-10
浅いガラスまたはプラスチック トレイ、約 10 インチ x 10 インチ
標準ピンセット	ファイン サイエンス ツール	11027-12
外科用ハサミ - 鈍器	ファイン サイエンスツール	14000-20
Slicing:
寒天、植物	RPI	9002-18-0
ビブラートーム	ライカ	VT1000s
ウェルプレート	アルカリ科学。	TPN1048-NT
strong>Staining:
AB 媒体:			1n 1,000 mL ミリポア H2O
リン酸緩衝剤 (PB):
リン酸カリウム一塩基	Sigma	P5655
リン酸二塩基性ナトリウム	Sigma	S7907
BSA(ウシ血清アルブミン)	シグマ	A2153-100g
塩化ナトリウム	フィッシャーケミカル	s271-1
トリトン X-100	シグマ - アルドリッチ	x100-500ml
ニッスル 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE ピコエメラルドレーザー	Angewandte Physik &エレクトロニック
パスフィルター(420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470 / 100m-2P
バンドパスフィルター(500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515 / 30m-2P
バンドパスフィルター(640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660 / 40m-2P
共焦点顕微鏡	オリンパス	FV1000
カットトランスファーピ	ペットフィッシャー	13-711-7M
ダイクロイック ロングパス 565 nm	クロマ テクノロジー	565dcxr
ダイクロイック ロングパス 585 nm	クロマ テクノロジー	585dcxr
ダイクロイック ショートパス 750 nm	クロマ テクノロジー	T750spxrxt
ガラス底培養皿	MatTek	P35G-0-10-C
ガラス重量 (10 mm x 10 mm ボロロッド)	アレン サイエンティフィックGlass Inc
光子ショートパス発光フィルター680 nm	クロマ	テクノロジーET680sp-2p8
PBS