単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

サマリー

このプロトコルは、外部細菌を除去するための低温麻痺および表面漂白後の個々の細菌的にコロニー形成された Caenorhabditis elegansの 96ウェル破壊を記載している。得られた懸濁液を寒天プレートに播種し、多数の個々のワームにおける細菌負荷の正確で中程度のスループット定量を可能にする。

要約

線虫 Caenorhabditis elegans は、宿主-微生物および宿主-微生物叢相互作用のモデル系である。これまでの多くの研究では、個々のワームサンプルではなくバッチ消化を使用して、この生物の細菌負荷を定量化しています。ここでは、 C. elegans 腸の細菌コロニー形成に見られる大きな個人間変動が有益であり、バッチ消化法は条件間の正確な比較に重要な情報を破棄すると主張している。これらのサンプルに固有の変動を記述するにつれて、多数の個体を必要とし、個々のワームの破壊およびコロニーメッキのための便利な96ウェルプレートプロトコルが確立される。

概要

宿主と微生物の関連における不均一性は遍在的に観察され、個体間の変動は、競争と共存¹から疾患伝染^2、3、4までの集団レベルのプロセスに寄与する要因としてますます認識されている。 C. elegansでは、アイソジェニック集団内の「隠れた不均一性」が繰り返し観察されており、個体のサブ集団はヒートショック応答^5,6、老化、寿命^7,8,9,10,11、および生理学および発達の他の多くの側面において明確な表現型を示している¹².亜集団構造を同定しようとするほとんどの解析は、同種異系の同期ワーム^5,7,8の実験集団における2つの亜集団の証拠を提供するが、他のデータは、別個のグループではなく集団内の形質分布の可能性を示唆している^7,12,13.ここでの関連性は、微生物の共有供給源からコロニー化されたワームの同種性集団内においても腸集団における実質的な不均一性が観察され13、14、15、¹⁶であり、この不均一性は、ワームにおける細菌定量のために広く使用されているバッチ消化測定¹⁷、^18、19、20によって隠蔽することができる。

この研究は、宿主と微生物の関連における単一ワーム測定への依存度を高める必要性を示唆するデータと、単一ワームの中断における精度とスループットを向上させるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、個々のワームの乳棒ベースの破壊よりも優れた再現性とサンプルあたりの労力を提供しながら、生存可能な細菌負荷の定量化のために多数の 個々のC. elegans の機械的破壊を容易にするように設計されています。破壊の準備の前にワームが熱死した 大腸菌 を食べることが許可されている推奨される腸内パージステップは、最近摂取された他の一過性(非付着)細菌からの寄与を最小限に抑えるために含まれています。これらのプロトコルには、低濃度の表面漂白剤処理でキューティクルを洗浄するための冷麻痺法が含まれる。表面漂白は、単一ワーム破壊の準備ステップとして、または生きた外部無菌ワームを調製するための方法として使用することができる。この表面漂白方法は、広範囲の外部微生物を除去するのに十分であり、低温処理は、従来のレバミゾールベースの麻痺に代わるものを提供する。レバミゾールは寒さに敏感な実験に好まれるが、冷たい麻痺は有害な廃棄物の流れへの寄与を最小限に抑え、正常な活動の迅速な再開を可能にする。完全なプロトコルは、ワームが既知の細菌にコロニー形成される実験室実験を説明しているが、ワームの洗浄および単一ワーム破壊の手順は、野生のサンプルから単離されたワームまたは小宇宙実験でコロニー化されたワームに容易に適用することができる。ここで説明するプロトコルは、ワームの腸から抽出された生細菌を産生し、個々のワームのコロニー形成単位(CFU)のメッキおよび定量化に適しています。シーケンシングベースの腸群集分析では、その後の細胞溶解および核酸抽出ステップをこれらのプロトコルに追加する必要があります。

プロトコル

これらの実験で使用されたワームは、NIH研究インフラプログラム局(P40 OD010440)が資金提供している Caenorhabditis 遺伝子センターから入手した。ブリストルN2はワイルドタイプです。DAF-2/IGF変異体 daf-16(mu86)I( CGC CF1038)および daf-2(e1370)III(CGC CB1370) は、腸内細菌負荷の違いを説明するために使用される。

pos-1 RNAiベクターを搭載したHT115(DE3)大腸菌は、アーリンガー^{ライブラリー21からのものである}。C. elegans天然腸内細菌²²のMYbコレクションを、シューレンブルク研究所から入手した。サルモネラ・エンテリカ LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR は、このラボ^{23 からのものです}。シュードモナス・モッセリイはこの研究室で単離された。黄色 ブドウ 球菌 MSSA Newman pTRKH3-mGFPは、エモリー大学のLaRock Labから入手した。

すべてのワームバッファーおよび培地は、以前に公開された文献²⁴ に従って、若干の変更を加えて調製されています( 補足ファイル1を参照)。

1. 同期滅菌C.エレガンスの調製

注: このセクションでは、生殖的に滅菌された成虫の同期集団を生成するためのステップバイステップの手順について説明します。 pos-1 RNAiプレートへの摂食は、この干渉が胚性致死的であるため、子孫の産生を防ぐためにここで使用されます。 pos-1 RNAiで成虫期に育てられたL1幼虫は産卵雌雄同体に発達するが、これらの卵は生存不能である²⁵。RNAi給餌プロトコルは、ワームブック²⁶の「逆遺伝学」の章のとおりです。

1. ワームを同期させる前に、新鮮な10 cm NGM + pos-1 RNAiプレートが利用可能であることを確認してください。プレートは、濃縮誘導液体培養物(+Amp + IPTG)から新鮮に調製するか、NGM + 100 μg/mLアンピシリン+ 1 mM IPTG上に芝生として接種し、暗所で25°Cで1日間増殖させた²⁷。
   注:カルベニシリン(25μg/mL)は、RNAiプレート上でアンピシリンの代わりによく使用されます。アンピシリンは安価ですが、安定性は低くなります。アンピシリンを使用する場合は、乾燥したらすぐにプレートを播種し、できるだけ早く使用する必要があります(4°Cで<1週間保存することができます)²⁷。ここで推奨される高い抗生物質濃度は、適切な選択を確実にするのに役立ちます。
2. いくつかの(典型的には2〜4つの)NGMプレートから始め、重力雌雄同体の集団が多い。漂白剤-NaOH同期²⁴を用いて卵を単離する。
   1. プレートあたり2 mLの滅菌ddH_{2 Oを使用して}寒天プレートからワームを洗い流します。液体を1.5 mLの微量遠心チューブ(プレートまたは雌雄同体ごとに1本のチューブ)に均等に分配します。
   2. ベンチトップのミニ遠心分離機(2,000 x g)で約5秒間スピンダウンして、大人をチューブの底に引っ張ります。上清をピペットで取り除き、廃棄する。
   3. 1mLの滅菌_ddH2Oで洗浄する。前と同じようにスピンダウンし、上清を捨てる。
   4. 前の手順を繰り返して、残りの細菌の破片を減らします。
   5. 各チューブの内容物を滅菌_ddH2Oの1mLに再懸濁し、各チューブに市販の漂白剤(8.25%次亜塩素酸ナトリウム)130μLおよび5N水酸化ナトリウム(NaOH、最終濃度0.5N)130μLを加える。
   6. ボルテックスチューブは、成人の体が壊れるまで、少なくとも2分ごとに少なくとも10〜15秒間激しくチューブを流します。卵を殺さないように、漂白剤-NaOH処理を5分より長くしないでください。
   7. ミニ遠心分離機で2,000 x g で30〜60秒間回転させて卵をペレット化します。上清をピペットで取り除き、廃棄する。目に見えるペレットがあるかもしれませんし、ないかもしれません、これは正常です。
   8. 1 mL の M9 ワームバッファーを加え、2000 x g で 30 ~ 60 秒回転 させます。上清を捨てる。
   9. すすぎ工程(1.2.8)を5倍繰り返して漂白剤-NaOH混合物を完全に除去し、卵ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を除去する。
   10. 卵を10 mLのM9ワームバッファーに50 mLの円錐形チューブまたはキャップ付き30 mL培養チューブに移します。円錐形のチューブを使用している場合は、蓋を少し緩めたままにしておき、テープを少し使用して固定してください。幼虫が孵化できるように、25°Cおよび200RPMで一晩(16時間)振とうしながらインキュベートする。
3. 同期したL1幼虫をRNAiプレートに移し、成虫期まで成長させる。
   1. 滅菌 M9 バッファー 2 mL + 0.01% Triton X-100 (以下 M9TX-01) を各 L1 チューブに加え、全容量 (12 mL) を 15 mL スクリュートップ円錐形チューブに移します。
   2. L1ワームを含む15mLチューブを4°Cで10分間置き、幼虫の動きを遅くする。
   3. 15 mL の円錐形チューブを大型卓上遠心分離機でスピンダウンします (1,500 x g で 4 °C で 3 分間、加減速は最大値の 80% 以下)。
   4. L1ペレットを乱すことなく上清を慎重にピペットで取り除きます。上清を捨てる。
   5. 12mLの冷たいM9TX-01を各チューブに加える。遠心分離を繰り返す。慎重にピペットオフし、上清を捨てる。各チューブには〜200μLが残っているはずです。
   6. M9TX-01 の 200 μL ピペットチップをすすぎ、ワームがプラスチックに付着しないようにしてから、このチップを使用してワームペレットを再懸濁します。再懸濁ワームを、細菌芝生上に液体の滴をピペッティングすることによって、調製した pos-1 プレートに移す。
   7. 成虫期の最初の日までプレートを25°Cでインキュベートする。
      注: pos-1 RNAiプレート上でワームを増殖させる場合、ワームは、胚致死的表現型の高い浸透性を確保するために、成体期に完全に移行するまでRNAi細菌に 自由 摂取しなければならない(MUST)。プレートを24時間と48時間に確認します。プレートが飢えているか、ほとんど飢えているように見える場合、ワームはフルサイズの大人に成長するために新鮮なプレートに移動する必要があります。ワームが増殖する前にプレートが枯渇しないように、各10 cm RNAiプレートに250〜500匹のL1幼虫を追加することを目指してください。
4. 成虫を収穫し、腸内 大腸菌 をクリアして無菌ワームを作ります。
   1. プレートあたり5mLのM9TX-01を使用して、プレートから成虫をすすいでください。バッファー+ワームを15mLの円錐形チューブに移し、大人がチューブの底に落ち着くようにします。
   2. 10 mLの新鮮なM9TX-01バッファーの変化で、目に見える細菌の濁りが残らなくなるまで成人をすすいでください(通常1-2倍)。チューブを700 x g で30秒間遠心分離してワームをペレットにするか、大人を重力で沈降させることができます。
   3. 10mLのM9TX-01でさらに1回洗浄を行い、外部細菌を減らします。
   4. ワームを、5 mL S 培地 + 2 x 熱死 大腸菌 OP50 (~5 x¹⁰⁹ 死滅細胞/mL) + 200 μg/mL のゲンタマイシン + 50 μg/mL のクロラムフェニコールを含む 50 mL 円錐形チューブまたは 30 mL 培養チューブに移します。円錐形のチューブを使用している場合は、蓋を少し緩めたままにしておき、テープを少し使用して固定してください。M9TX-01のガラスピペットを使用するか、プラスチックピペットをすすぎ、ワームがくっつかないようにします。
   5. 成人を25°Cで200RPMで24〜48時間振とうしながらインキュベートし、無菌成体を産生する。
      注:ワームが抗生物質に>24時間留まる場合は、ワームが十分な食料源を持っていることを確認するために、より多くの熱死滅OP50を追加する必要があります。24時間でチューブをチェックし、濁りが目に見えて減少している場合は、ヒートキルドOP50を補充してください。
5. スクロースは、Wormbookプロトコル²⁴ に従って成人を洗浄し、細菌コロニー形成のための清潔で生殖的に無菌の同期成人専用ストックを得る。
   1. 60% スクロース、M9 ワームバッファー、および M9TX-01 のコールドボリュームが使用可能であることを確認します。簡単にするために、これらは前夜に4°Cで放置することができます。
   2. 洗浄する各サンプルについて、8 mLのM9TX-01を含む標識付き15 mL円錐管を作成し、氷上に脇に置いておきます。これらはステップ 1.5.10 で必要になります。
   3. 5 mLのM9TX-01をL1幼虫を含む各50 mLチューブに加える。全容量(現在は10 mL)を空の15 mLスクリュートップ円錐形チューブに移し、大人がチューブの底に落ち着くようにします。
   4. 上清を慎重にピペットで取り除き、廃棄する。
   5. 各チューブに10mLのM9TX-01を加え、チューブをアイスバケットに5〜10分間移動させます。
      メモ: この時点で、ワームとすべてのバッファは氷上に保管する必要があります。
   6. 「高速温度」設定を使用して、大型卓上遠心分離機を4°Cに冷却します。
   7. 各チューブに10mLの冷たいM9TX-01を加えて、残っている破片を洗い流します。ワームを氷の上に落ち着かせてください。上清を取り除き、廃棄する。
   8. スクロースフロート:5 mLの冷M9緩衝液および5 mLの冷60%スクロース溶液を各チューブに加え、十分に混合する。次いで、各チューブ内のスクロース - 緩衝液混合物の上に1mLの冷たいM9緩衝液を注意深く浮かべる。float を追加した後は混ぜないでください。
      注意:次の数ステップのために素早く移動してください - ワームは高濃度のスクロースにあまりにも長い間さらされると乾燥する可能性があります!
   9. 1500 x g で4°Cで3分間遠心分離する。 生きた成虫の虫は、M9とスクロースの界面にあり、チューブの上部から約1mLです。
   10. ガラス製5mL血清学的ピペットを使用して、ウォーム層を冷M9TX-01(ステップ1.5.2から)で調製した15mL円錐管に移す。スクロースをあまりピペッティングせずに生きた虫の層を得るように非常に注意してください。
   11. 必要に応じて、M9TX-01 を加えて、等量の 10-12 mL/チューブを取得します。4°Cで1500 x g で1分間遠心分離し、次いで上清をピペットオフする。ワームはこの時点で室温に戻すことができます。
   12. 洗浄ステップ1.5.11を2回繰り返し、速度を4°Cで700 x g に下げ、時間を30秒に下げます。

2. 液体培養中の生きた細菌にワームを給餌する

注:このプロトコルは、液体培養でよく混合された条件下で実験室で増殖した細菌とワームをコロニー形成するために使用されます(補足図1)。ワームは、純粋培養物からの個々の分離株(例えば、エンテロコッカス・フェシウム²⁸、²⁹などの病原体)または分離株の混合物(例えば^、最小マイクロバイオームコミュニティ¹⁴)でコロニー形成することができる。

1. スクロース洗浄した同期成虫をプロトコルステップ1.5から15mL円錐管で開始する。ワームを12mLのSバッファーで1回洗い、上清を捨てる。
2. 洗浄したワームを実験に必要なS培地の容量に再懸濁する。実験条件の量、ワームが分割される条件の数、およびワームと細菌の最終濃度を検討してください。
   注:ワームの摂食は細菌の可用性³⁰によって異なり、ワームは混雑³¹によってストレスを受ける可能性があります。液体培養におけるコロニー形成には、<1000ワーム/ mLおよび>^107CFU / mLが推奨される。10¹¹ CFU/mLは、大腸菌³²の「自由摂取」摂食密度とみなされる。
3. 細菌培養物をスピンダウンします。上清を注ぎます;吸引またはピペッティングを使用して、緩いペレットを形成する細菌の上清を除去することができる。
   注: 培養物 >5 mL の場合は、15 mL チューブに移し、大型卓上遠心分離機で約 2800 x g で 8 ~ 10 分間回転させます。培養物<5 mLを1.5 mLチューブに移し、小さな卓上遠心分離機で9000 x g で1〜2分間遠心分離することができます。運動性の高い細菌(例えば、多くの種の シュードモナス)は、安定したペレットの形成を容易にするために4°Cで10〜15分間冷却する必要があるかもしれません、そしてそれは4°Cで遠心分離する方が良いかもしれません。
4. 細菌培養物を1容量のS緩衝液に再懸濁し、ペレットに再度遠心分離する。先ほどと同様に上清を取り除いて捨てます。
5. 実験のための所望の密度でS培地に細菌培養物を再懸濁し、選択のために任意の抗生物質を加えた。使用される抗生物質は、もしあれば、コロニー形成に使用される細菌の耐性プロファイルに依存するであろう。
6. M9TX-01でコーティングされたピペットチップを使用して、ワームがS培地に完全に再懸濁されるまでピペットワームを穏やかに上下に動かし、次いで細菌コロニー形成のためにチューブまたはプレートウェルに移す。
7. 各ワーム培養物に細菌懸濁液を加えて、所望の細菌濃度および最終体積に達する。
8. コロニー形成にマルチウェルプレートを使用する場合は、プレートを滅菌96ウェルガス透過性封孔膜で覆う。
9. インキュベーション中に細菌が沈降するのを防ぐために、200 RPMで振とうしながらインキュベートします。

3. 96ウェルフォーマットでの個々のワームの機械的破壊

注:このセクションでは、個々の細菌にコロニー形成された C. elegansの機械的破壊のための96ウェルプレートフォーマットプロトコルについて説明します。プロトコル(3.1-3.8)の最初のステップは、ワーム腸から非付着細菌を除去し、冷たい麻痺および表面漂白を使用してワームの外側を洗浄する方法を記載している。これらのステップは、細菌内容物の定量化のために機械的に破壊されるか(3.8末端)、またはさらなる実験(補足図1)に使用することができる、清潔で生きた成虫ワームを生成する。このプロトコルは、液体培養(セクション2)、寒天プレート上、または天然または小宇宙土壌からコロニー化されたワームの細菌を定量化するために適合させることができる。

1. M9TX-01のアリコートを氷の上に置き、冷やします(サンプル数の4〜5倍(mL単位)。
2. M9TX-01+漂白剤(6%次亜塩素酸ナトリウム、1:1000または1:2000 v/v、サンプルあたり1 mL + 1 mL余分に)のアリコートを調製し、氷の上に置き、冷やします。このアリコートは、ステップ 3.8 で使用されます。
3. 破壊されたワームサンプルの段階希釈のために96ウェルプレートを調製する。
   1. 蓋付きの滅菌300 μL容量96ウェルプレートを入手します。このプロトコルは、消化された12匹のワームごとに1つの希釈プレートを使用する。
   2. 96ウェルマルチチャンネルピペッターを使用して、各96ウェルプレート(300 μL容量)の列B-Dを180 μLの1x PBSバッファーで満たします。一番上の行は空のままにします。行B〜Dは、ワームダイジェストの10倍の連続希釈[0.1x、0.01x、0.01x]になります。
   3. 皿は脇に置いておきます。希釈プレートはステップ3.13で使用されます。
4. 各ワームサンプルを1 mLのM9TX-01に1.5 mLの微量遠心チューブに再懸濁します。
5. チューブを25°Cの低速ミニ遠心分離機(2,000 x g)で短時間(2〜3秒)スピンして、成人をペレット化する。上清をピペットで取り除き、ワームペレットを乱さないようにして廃棄する。
6. ステップ3.5の遠心分離設定を使用して、ワームを1mLのM9TX-01で2回、次いで1mLのM9ワームバッファーで1回すすぎ、外細菌を減少させた。
7. ワーム腸から付着していない細菌をパージします。
   1. ワームの各サンプルを培養管内の1mLのS培地+2x加熱死滅OP50に再懸濁する。
   2. 25°Cで20〜30分間インキュベートし、腸からの非付着細菌の通過を可能にする。
      注:これにより、内腔から細胞外蛍光タンパク質がパージされ、特に抗酸蛍光色素(mCherry、dsRedなど)が使用されている場合、腸上皮に付着した標識細菌をより明確に視覚化できます。
8. 表面漂白剤ワームは、外部細菌を除去します。
   1. パージしたワームを1mLの冷たいM9TX-01で2回すすぎ、上清を捨てる。
   2. チューブを氷上(望ましい)または4°Cで10分間冷やすことができます。 これはワームを麻痺させ、漂白剤の摂取を防ぎます。
      注:他のプロトコルは、レバミゾールなどの化学麻痺剤を使用する。これは、有害廃棄物ストリームの追加を必要とする確立されたアプローチ³³ である。
   3. 氷冷したM9ワームバッファー1mL+無香料漂白剤(8.25%水酸化ナトリウム、1:1000または1:2000 v/v)を各チューブに加えます。チューブを氷の上(好ましい)または4°Cで少なくとも10分間座らせて、外部細菌を殺す。
      注:漂白剤の濃度は1:1000を超えないでください。麻痺したワームでさえ、死亡率が生じる可能性があります。
   4. 漂白剤バッファーをピペットオフし、廃棄;漂白剤が取り除かれるまでワームがポンピングを再開しないようにするために、チューブを氷に戻します。
   5. 各チューブに1mLの冷たいM9TX-01を加える。ミニ遠心分離機(25°Cで2,000 x g )で〜5秒間スピンする。チューブを氷に戻す。上清を取り除き、廃棄する。
   6. 別の1mLの冷たいM9TX-01でこのすすぎ工程を繰り返し、できるだけ多くの上清を捨てる。
      注:さらなる実験にワームを使用する場合は、透過処理ステップ(プロトコル3.9)をスキップし、代わりに表面漂白したばかりの成虫を6cmのペトリ皿の氷冷バッファーに移し、プロトコル3.10のようにワームを実験条件に分けてください。運動性が再開するのを防ぐためにワームを冷たく保ちますが、すぐに機能します - 氷上でワームを>30分間保持すると、通常の活動が<100%再開される可能性があります³⁴。
9. ドデシル硫酸ナトリウムおよびジチオトリエトール(0.25% SDS + 300 mM DTT)によるワームキューティクルの化学的透過(³⁵に基づく)
   警告: DTT は還元剤であり、刺激性です。PPEを着用し、乾燥したストックや溶液を扱うときはヒュームフードで作業してください。有害廃棄物の流れが必要です。
   1. ヒュームフード内で、各サンプルに100 μLを許容するのに十分なSDS/DTT溶液を準備します。1 mL の場合、1.5 mL の微量遠心チューブ内の M9 ワームバッファーまたは M9TX-01 965 μL に、5 μL の 5% (w/v) SDS および 30 μL の 1M DTT を追加します。
      注:1 M DTT溶液(水性)は、効力を確保するために、新鮮に調製するか、-20°Cのアリコートに保存する必要があります。アリコートは、過度の凍結融解サイクルを避けるために、2 ~ 3 回の実験で使用するようにサイズ変更する必要があります。
   2. 表面漂白されたワームを含む微量遠心チューブを室温のチューブラックに移動します。各チューブには、約20μLのバッファーにワームが含まれている必要があります。
   3. 各ワームサンプルに 100 μL の SDS/DTT 溶液を追加します。残りのSDS/DTTソリューションは、適切な有害廃棄物ストリームに廃棄してください。
   4. 治療をベンチで最大8分間進行させて、成虫の耐性キューティクルを部分的に分解する。ワームは死に、この間にチューブの底に落ち着きます。
   5. 透過処理時間が経過したら、SDS/DTT上清を慎重にピペットで取り除き、適切なSDS/DTT有害廃棄物ストリームに廃棄します。
   6. 各チューブに1mLのM9TX-01を加える。卓上遠心分離機で短時間回転させてワームをペレット化するか、ワームが重力によってチューブの底に沈降し、上清を引き出してSDS/DTT有害廃棄物流に処分します。
   7. ワームを 1 mL の M9 ワームバッファー + 0.1% Triton X-100 に再懸濁して、使用できる状態になるまで再懸濁します。
10. ワームを深い96ウェルプレートに分離し、炭化ケイ素グリットで機械的に破壊します。96ウェル破壊プレートを以下のように準備する。
    1. 滅菌した2 mLのディープウェル96ウェルプレートと、一致するシリコン96ウェルプレートカバーを入手します。
       注: 組織ディスラプターには、96 ウェルアダプターと互換性のあるプレートを使用することが重要です。外形寸法のわずかな違いが、アダプターから取り外すことができるプレートとできないプレートの違いを生みます。
    2. 滅菌スクープヘラを使用して、少量の滅菌36グリット炭化ケイ素を、ワームを受け取るプレートの各ウェルに加える。井戸の底をかろうじて覆うのに十分なグリットを使用してください(井戸あたり約0.2g)。過剰な材料は、内容物を取り出すときに井戸の底にピペットチップを得ることを困難にします。
    3. 180 μL の M9 ワームバッファーを各ウェルに加えます。
    4. 各サンプルがどこに行くかを示すために列または行にラベルを付け、シリコン96ウェルプレートカバーでプレートをゆるやかに覆います。
11. 個々のワームを96ウェルプレートに移して中断させます。
    1. 透過処理したワームを、ディッシュを〜1cmの深さまで満たすのに十分なM9TX-01を含む小さな(35または60mm)ペトリ皿に慎重に移動させる。
       注:多数のワームが存在する場合、液体が混雑し、個々のワームをピペットすることが困難になるため、サンプル全体を転送することは現実的ではない場合があります。
    2. 解剖顕微鏡または他の低倍率装置を用いて、個々のワームを20μL容量でピペットオフし、これらのワームを96ウェルプレートの個々のウェルに移す。
       注:殺されたばかりのワームだけを収穫するのが最善です。これらのワームはしばらくの間死んでいた可能性があるため、硬い直線形状のワームは避けてください。湾曲した、またはS字型のワームを服用し、正常な肉眼的な生理機能と無傷の腸を服用してみてください。
    3. 各ボリュームを転送した後、選択したワームが実際にウェルに排出されたことを確認します。これを行うには、ペトリ皿の透明な領域からM9TX-01の20μLをピペットで送り出し、全容量を皿に戻します。これは通常、ワームがピペットにくっついている場合にワームを排出します。ワームが詰まっていた場合は、ウェルから20 μLを取り出し、移入を再試行してください。
    4. すべてのワームを移したら、96ウェルプレートを市販の柔軟な紙裏面封止フィルム(2 x 2マス)で覆い、封止フィルムの紙裏面がサンプルウェルに下を向いていることを確認します。シールフィルムが薄すぎたり、後から外すのが非常に難しくなったりしないように注意してください。
    5. シリコンシーリングマットをフレキシブルシーリングフィルムの上に軽く置きます。この時点では、カバーを井戸に押し込まないでください。
    6. プレートを4°Cに動かして30〜60分間冷やします。これにより、サンプルを損傷する可能性のある破壊中の過熱を防ぐことができます。
       メモ: これはプロトコルのブレークポイントです。ほとんどの場合、プレートは研削前に最大4時間4°Cに放置することができます。これは細菌の数を変えるので、一晩ワームを離れないでください。
12. 96ウェルプレートを組織破壊器に負荷をかけ、ワーム組織を分解し、腸内細菌を放出します。
    注:(オプション)消化に奇数の96ウェルプレートを使用する場合は、先に進む前にカウンターウェイトを準備する必要があります。空の深い96ウェルプレートを使用し、最初のプレートと同じ重さになるまでウェルを水で満たします。
    1. シリコンシーリングマットをウェルにしっかりと押し込んでシールを作成し、蓋がプレートの表面全体に平らに収まっていることを確認します。
       注:延伸後にフレキシブルシーリングフィルムが厚すぎると、シリコン蓋をすべてのウェルに平らに横たわるように固定することが困難になります。これにより、シールが不十分になり、振盪中にウェルツーウェル汚染が発生します。
    2. 96ウェルプレートアダプターを使用して、組織ディスラプターにプレートを固定します。プレートを30Hzで1分間振った後、プレートを180°回転させてから、再度1分間振ってください。これは、プレートのすべてのウェルで均一な混乱を確実にするのに役立ちます。
    3. ベンチにプレートを2〜3回しっかりとタップして、柔軟なシーリングフィルムからグリットを取り除きます。
    4. 2 つの 96 ウェルプレートアダプターを備えた大型遠心分離機を使用して、プレートを 2400 x g で 2 分間回転させ、すべての材料をウェルの底に集めます。
    5. シリコンの蓋を取り外し、フレキシブルシーリングフィルムを慎重に引き抜きます。
       メモ: フレキシブルシーリングフィルムがウェルのいずれかに付着している場合は、200 μL のピペットチップを使用して取り外します。これは、可撓性封止フィルムが薄すぎて延伸された場合に一般的である。
13. ワーム消化サンプルを96ウェルプレートで300 μLで連続希釈します。
    1. 200 μLに設定したマルチウェルピペッターを使用して、ピペットを数回ゆっくりと慎重に上下させてウェルの内容物を再混合し、できるだけ多くの液体を引き出します。この液体を、ステップ3.3で調製した96ウェルプレートの最上段に移す。
    2. 20 μLに設定した96ウェルピペッターを使用して、この量の液体を一番上の列から取り出し、B列に分配します。ヒントを捨てる。
    3. ステップ 3.13.2 を繰り返し、行 B の 0.1x サンプルから始めて、行 C の 0.01x 希釈サンプルを作成します。
    4. 手順 3.13.2 をもう一度繰り返し、行 C から行 D に移動します。
    5. 細菌定量のために固体寒天上にプレートする。単コロニー化したワームの場合、一般に、寒天プレート上に各希釈液[1x-0.001x]の10〜20μL滴をプレート化すれば十分である。多種コロニー形成のために、100 μLを10 cm寒天プレートにピペッティングすることによって各希釈液を別々にプレート化する。ガラスメッキビーズを使用してすぐに広げます。

4. 再利用のための炭化ケイ素グリットの洗浄

注:この手順は、実験後に再利用するために、研削材料である炭化ケイ素グリットを洗浄および滅菌するために使用されます。炭化ケイ素グリットは工業製品であり、事前に滅菌されていないため、このプロトコルは最初の使用前に完全に従う必要があります。Siカーバイドグリット(3.2g / cc)は、緻密で粗いエッジの材料で、タフなサンプルを破壊するために効率的に機能します。ただし、粒子は繰り返し使用すると摩耗する可能性があるため、摩耗が明らかになったら交換する必要があります。幸いなことに、材料は安価であり、一般的に販売されているサイズ(〜1ポンド)は多くの実験に十分です。

1. めっき用のサンプルを除去した後、96ウェルプレートのすべてのウェルに10%漂白剤溶液を加え、少なくとも10分間放置する。
2. すべての内容物をキャッチするのに十分な大きさの小さなハイサイドトレイまたは空のP1000ピペットチップ容器の上に96ウェルプレートを素早く反転させて、グリットの大部分を取り除きます。グリットはすぐにトレイの底に沈みます。漂白剤溶液をシンクに注ぎます。
3. 96ウェルプレートに水道水を入れ直し、同じトレイにひっくり返して、残った砂を洗い流します。シンクに水を注ぎます。
4. プレートが完全に汚れなくなるまで、水道水でさらに1〜3回繰り返します。
5. 水道水でグリット2xをすすぎ、毎回トレイに充填します。
   注:96ウェルディープウェルプレートは、実験室の食器洗い機で洗浄し、ホイルでしっかりと覆い、他の再利用可能なプラスチックでオートクレーブすることができます。グリットはすぐに洗う必要はなく、この時点で脇に置いておくことができます。使用済みのグリットは、通常、洗浄およびオートクレーブの前に複数の実験から蓄積される。
6. 実験用洗剤の溶液でグリットを30分間洗浄し、時折渦巻くか金属ヘラと混合して攪拌する。
7. 水道水のいくつか(8-10)交換で洗剤の痕跡をすべて洗い流し、蒸留水で2倍すすいでください。
8. 浅いポリプロピレン製オートクレーブトレイなどの開いたトレイにグリットを広げ、40~70°Cで数時間乾燥させる。
   メモ:乾燥時にグリットがごつごつしている場合は、十分に洗浄またはすすぎませんでした。手順4.6から洗浄プロトコルを繰り返し、手順4.7でリンスを追加します。
9. 清潔で乾燥したグリットをスクリュートップのオートクレーブ可能なガラス瓶に最大5〜6cmの深さまで分配します。オートクレーブを予備真空サイクルで30分間滅菌します。

結果

生きた虫の漂白剤滅菌
表面漂白されたワームは、運動性が戻り、排泄が再開するまで、外部細菌を効果的に含まない。ここで使用した条件下では、低温麻痺したワームの腸内関連細菌を乱すことなく(図1A-C、補足図2、ビデオ1)、緩衝液中の細菌の急速な絶滅が観察される(図1D-F、ビデオ2)。これらのデータは、表面漂白が腸内容物を損なうことなくワームを外部から消毒するために効果的に使用できることを示している(表面漂白されたワームに関連するCFU数と漂白剤を含まないWCU数の比較は有意ではなく、Wilcoxonランクサム検定p >0.05)。

マルチサンプルの機械的破壊のバリエーション
ワームを機械的に破壊するための96ウェル技術は、使用される特定の材料に対して...

ディスカッション

ここでは、 C. elegansにおける細菌負荷の単一ワーム定量化の利点と、このタイプの大規模なデータセットの迅速かつ一貫した取得を可能にする96ウェル破壊プロトコルに関するデータが提示されています。既存の方法³³と比較して、これらのプロトコルは、ワーム内の腸内微生物群集のより高いスループット測定を可能にする。

このアプローチは、レート制限ステップとしてメッキがあり、真に「ハイスループット」ではありません。大目的フローサイトメトリー(図3C、D)は、個々のワーム¹⁶の蛍光標識細菌を定量するための有用なハイスループット法ですが、同時蛍光色素の数は多種群集では制限されています。マルチウェルプレートの破壊をコミュニティシーケンシングと結びつけることは、スループットを向上させるもう1つの方法です。しかし、ここで説明する96ウェル破壊手順は、細菌細胞をそのまま残すために特別に最適化されま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル平底ポリプロピレンプレート、300 uL	エバーグリーンラボウェア	290-8350-03F
96ウェルプレートシーリングマット、シリコン、スクエアウェル (AxyMat)	Axygen	AM-2ML-SQ
96ウェルプレート、2 mL、スクエアウェル	Axygen	P-2ML-SQ-C-S
96ウェルポリプロピレンプレート蓋	エバーグリーンラボウェア	290-8020-03L
寒天	フィッシャーサイエンティフィック	443570050
96ウェルプレート用ビーズミルアダプターセット	QIAGEN	119900	アダプタープレート TissueLyser II
ビーズミル組織ホモジナイザー(TissueLyser II)	QIAGEN	85300	中〜高スループットのサンプル破壊用メカニカルホモジナイザー
BioSorter	Union Biometrica	見積	りでC.エレガンスM
漂白剤、商業用、8.25%次亜塩素酸ナトリウム	Clorox
Breathe-Easy 96ウェルガス透過性シーリング膜	Diversified Biotech	BEM-1	マルチウェルプレートガス透過性ポリウレタン膜。薄いシーリングフィルムは、O2、CO2、および水蒸気を透過し、300nmまでのUV透過性があります。滅菌済み、100 /箱。
塩化カルシウム二水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC423525000
コレステロール	VWR	AAA11470-30
クエン酸一水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC124910010
硫酸銅 (II) 五水和物	フィッシャーサイエンティフィック	AC197722500
コーニング 6765 LSE ミニ微量遠心機	コーニング	COR-6765
EDTA二ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	409971000
DL 1,4 ジチオスレイトール、99+%、分子生物学用、DNAse、RNAse、プロテアーゼフリー、ACROS	Organics フィッシャーサイエンティフィ	327190010
エッペンドルフ1.5 mL微量遠心チューブ、天然	エッペンドル
エッペンドルフ5424R微量遠心分離機	エッペンドルフ	5406000640	24箇所冷蔵卓上微量遠心機
エッペンドルフ5810R遠心分離機(ローター付き) S-4-104	エッペンドルフ	22627040	3L卓上遠心分離機(15-50mLチューブおよびプレート用アダプター付き
エッペンドルフプレートバケット(x2)、ローターS-4-104	エッペンドルフ	22638930
エタノール 100%	フィッシャーサイエンティフィック	BP2818500
ガラスビーズ、2.7mm	ライフサイエンス製品	LS-79127
ガラスビーズ、酸洗浄、425-600&マイクロ;m	Sigma	G877-500G
ガラスメッキビーズ	VWR	76005-124
塩酸	VWR	BDH7204-1
鉄 (II) 硫酸塩七水和物	フィッシャーサイエンティフィック	423731000
キンブル コンテス ペレット 乳棒モーター	DWK ライフサイエンス	749540-0000
キンブル コンテス ポリプロピレン ペレット 乳棒とマイクロチューブ、0.5 mL	DWK Life Sciences	749520-0590
ライカ DMi8 電動倒立顕微鏡、電動ステージ付き	ライカ	11889113
ライカ LAS X プレミアムソフトウェア	ライカ	11640687
硫酸マグネシウム七水和物	フィッシャーサイエンティフィ
塩化マンガン(II) 四水和物	VWR	470301-706
PARAFILM M フレキシブル ラボ シーリング フィルム	Amcor	PM996
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
ペトリ皿、丸型、10 cm	VWR	25384-094
ペトリ皿、丸型、6 cm	VWR	25384-092
ペトリ皿、正方形、10 x 10 cm	VWR	10799-140
リン酸化緩衝生理食塩水 (1X PBS)	ゴールドバイオ	P-271-200
オートクレーブトレイ、浅い	フィッシャーサイエンティフィック	13-361-10
水酸化カリウム	ッシャーサイエンティフィ	AC134062500
リン酸二塩基性カリウム	ッシャーサイエンティフィック	BP363-1
リン酸カリウム一塩基性	フィッシャーサイエンティフィック	BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 ビルド 443	R ファンデーション	n/a
スクープ型実験用へら、金属	VWR	470149-438
炭化ケイ素 36 グリット	MJR タンブラー	n/a	ブラック エクストラ コース シリコン カーバイド グリット。このベンダーから0.5-5ポンドのサイズで利用可能。
ドデシル硫酸ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP166-100
水酸化ナトリウム	VWR	BDH7247-1
リン酸ナトリウム二塩基性無水	フィッシャーサイエンティフィック	BP332-500
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP358-1
ショ糖	フィッシャーサイエンティフィック	AC419760010
トリカリウムクエン酸一水和物	フィッシャー・サイエンティフィ	AC611755000
トリトン X-100	フィッシャー・サイエンティフィック	BP151-100
硫酸亜鉛七水和物	フィッシャー・サイエンティフィック AC205982500